Luận văn : KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO part 6 docx

36
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l
Nghiệm
thức
Nồng độ
NAA
(mg/l)

Chiều dài rễ trung bình (mm)

7 ngày
14 ngày
21 ngày
28 ngày
35 ngày
1 (Đ/C)
0
0,00
a

2,22
a

5,22
a

5,63

a

7,59
a

2
0,5
0,00
a

7,59
b

5,77
b

10,07
b

12,44
b

P


0,00
0,01
0,00
0,00
CV (%)

11
13,2
14,1
14,2
* Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA
* Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không
có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)

Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l
Nghiệm
thức
Nồng độ
NAA
(mg/l)
Số rễ trung bình
7 ngày
14 ngày
21 ngày
28 ngày
35 ngày
1 (Đ/C)
0
0,00
a

2,22
a

3,00
a

4,74
a

8,33
b

2
0,5
0,00
a

3,19
b

4,22
b

6,11
b

6,04
a

P

0,00
0,00
0,00
0,00
CV (%)


19,6
9,2
13,5
11,4
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có NAA
* Trong cùng một cột và các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không
có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)

Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự tác động của NAA là rất có ý nghĩa
lên chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro. Cây được nuôi trên môi trường có bổ
sung NAA tạo rễ dài hơn so với cây đối chứng và chiều dài rễ tỉ lệ thuận so với thời
gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự tác động của NAA lên số rễ của cây có sự khác biệt



37
giữa các giai đoạn nuôi cấy (Bảng 4.3), trên môi trường có bổ sung NAA cây có số
rễ cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn này cây có số rễ và chiều dài rễ dài
gấp 1,5 lần so với cây sau 21 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, sau 35 ngày nuôi cấy số rễ
của cây trên môi trường có NAA giảm dần. Điều này chứng tỏ khi bổ sung NAA
vào môi trường nuôi cấy cây tạo rễ tốt nhất ở giai đoạn 28 ngày tuổi.
Vì các tiền chất alkaloid được sản xuất nhiều ở rễ nên giả thiết đặt ra là hàm
lượng alkaloid đạt được cao nhất ở cây 28 ngày tuổi nên thí nghiệm tiếp theo được

theo dõi ở giai đoạn này.
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng
xuân hoa in vitro

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân
hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy
Nghiệm thức
Nồng độ
NAA (mg/l)
Chiều cao cây
trung bình
(mm)
Số rễ
trung bình
Chiều dài rễ
trung bình
(mm)
1 (Đ/C)
0
51,9
ab

2,93
c

4,19
c

2
0,1

51,8
ab

3,00
c

5,22
d

3
0,5
55,7
b

4,19
e

5,48
de

4
1
55,9
b

3,67
d

5,63
e

5
5
49,5
a

1,93
b

2,44
b

6
10
49,3
a

0,67
a

1,11
a

P

0,02
0,00
0,00
CV (%)

17,1
19,8
17,5
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone
* Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự
theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)

Trong các nghiệm thức thí nghiệm thì sự bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l
và 1 mg/l tác động tốt lên chiều cao trung bình của cây nhưng khi nồng độ này quá



38
cao (5 – 10 mg/l) sẽ làm giảm khả năng phát triển của cây. Kết quả này cũng phù
hợp với sự tác động của NAA lên sự hình thành rễ. Nồng độ tạo rễ tốt nhất trong thí
nghiệm này là NAA 0,5 mg/l với số rễ trung bình là 4,19 trong khi ở nghiệm thức 6
(NAA = 10 mg/l) số rễ tạo thành là thấp nhất 0,67 (Bảng 4.4).
Bên cạnh đó quan sát thấy ở nồng độ NAA cao (5 mg/l, 10 mg/l) có sự phát
sinh mô sẹo ở phần gốc cây (Hình 4.1) bởi vì nồng độ auxin trong môi trường cao
sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự tạo sẹo (Nguyễn Đức
Lượng, 2002). Như vậy tác động của NAA phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, việc
thay đổi nồng độ NAA trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác biệt về khả năng
tạo rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ
của cây là 0,5 mg/l.
4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng
xuân hoa in vitro

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân
hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy.

Nghiệm thức
Nồng độ IAA
(mg/l)
Chiều cao cây
trung bình
(mm)
Số rễ
trung bình
Chiều dài rễ
trung bình
(mm)
1 (Đ/C)
0
51,8
b

2,93
b

4,19
b

2
0,1
51,5
b

4,30
c

4,81
c

3
0,5
50,4
b

4,04
c

5,67
d

4
1
49,4
ab

5,63
d

5,85
d

5
5
48,7
ab

2,67
ab

4,67
c

6
10
46,3
a

2,59
a

3,78
a

P

0,03
0,00
0,00
CV (%)

13,1
16,4
13,5
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone
* Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự
theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)

39

N2
N3
N1
I2
I3
I1
Sẹo
Sẹo
Rễ
NAA = 0,5 mg/l
N3 = 1 mg/l
NAA = 0,1 mg/l
NAA = 5 mg/l
NAA = 10 mg/l
IAA = 0,5 mg/l
IAA = 1 mg/l
IAA = 5 mg/l
IAA = 10 mg/l
IAA = 0,1 mg/l
Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có
bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày
nuôi cấy.

40
Kết quả phân tích thống kê cho thấy các cây nuôi cấy mô trên môi trường có
bổ sung IAA đều bị ảnh hưởng nhưng ở mức độ khác nhau. Khi bổ sung IAA ở
nồng độ thấp 0 – 0,5 mg/l tác động khác biệt không có ý nghĩa lên chiều cao cây,
nhưng khi tăng nồng độ IAA lên (1 - 10 mg/l) thì chiều cao trung bình của cây giảm
dần và ở nghiệm thức 6 (IAA = 10 mg/l) cây có chiều cao thấp nhất (Bảng 4.5).
Cây đối chứng và cây trên môi trường chứa IAA có sự khác biệt về số rễ và
chiều dài rễ trên phương diện thống kê (P< 0,05). Nồng độ IAA 1 mg/l cho thấy cây
tạo được nhiều rễ nhất với chiều dài trung bình là 5,85 mm nhưng khi tăng nồng độ
IAA sử dụng lên 10 mg/l thì chiều dài rễ là 3,78 mm và số rễ của cây giảm xuống
còn 2,59. Ngoài ra ở nghiệm thức 5 và 6 còn có hiện tượng tạo sẹo và rễ bị biến
dạng về hình thái (Hình 4.1) bởi vì khi sử dụng IAA liều cao sẽ kích thích cảm ứng
sự tạo mô sẹo làm giảm khả năng tạo rễ.
 Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy việc sử dụng NAA 0,5 mg/l hoặc IAA
1mg/l đều tác động tốt lên sự sinh trưởng của cây. Tuy nhiên số rễ được tạo thành
khi sử dụng IAA vẫn cao hơn so với khi sử dụng NAA (đặc biệt ở nghiệm thức 6,
nồng độ 10mg/l). Điều này có thể là do IAA là loại auxin tự nhiên nên khi bổ sung
vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cao không gây kích ứng như khi sử dụng
auxin nhân tạo NAA.
4.4. Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro
bằng thuốc thử Wagner
 Định tính alkaloid từ cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh
trƣởng của cây (7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi) bằng thuốc thử Wagner

41
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng
thuốc thử Wagner

Môi trƣờng
Ngày nuôi cấy
Phản ứng màu với thuốc thử
Wagner
MS
7
dung dịch đục mờ, không lắng
14
dung dịch tạo tủa ít
21
dung dịch tạo tủa ít
28
dung dịch tạo tủa nhiều
35
dung dịch đục, tạo tủa vừa
MS + NAA 0,5
mg/l
7
dung dịch đục mờ, không lắng
14
dung dịch tạo tủa ít
21
dung dịch tạo tủa ít
28

dung dịch tạo tủa nhiều
35
dung dịch đục, tạo tủa vừa

Tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa nuôi cấy in vitro phản ứng với thuốc
thử cho lượng kết tủa khác nhau (Hình 4.2, 4.3), điều này có nghĩa là alkaloid hiện
diện trong tất cả các mẫu cây nuôi cấy in vitro nhưng với lượng khác nhau. Quan sát
sự tạo kết tủa của alkaloid sau khi cho phản ứng với thuốc thử nhận thấy mẫu cây
được nuôi trên môi trường có NAA cho kết tủa nhiều hơn so với mẫu cây nuôi trên
môi trường MS ở cùng một thời điểm. Việc thay đổi môi trường sống của cây có thể
đã tác động đến chu trình hình thành các alkaloid vì alkaloid được sản xuất ở thực
vật nhằm giúp cho cây thích nghi với môi trường, dẫn đễn lượng alkaloid cao ở mẫu
cây trên môi trường có NAA. Đặc biệt ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy xuất hiện
kết tủa nhiều nhất, chứng tỏ hàm lượng alkaloid ở giai đoạn này là cao nhất. Điều
này phù hợp với giả thiết đã đặt ra. Ở các giai đoạn còn lại cũng thu được kết tủa
nhưng với lượng ít hơn, trong số đó mẫu cây sau 7 ngày nuôi cấy cho kết tủa ít nhất
(dung dịch đục và có vòng nhẫn).



42

Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy, cây
sản xuất lượng alkaloid cao nhất sau 28 ngày.

 Định tính alkaloid trong thân lá cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi
trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35
ngày
Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa
in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Phản ứng dương tính:
xuất hiện kết tủa (mũi tên).
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày
Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa
in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5
mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên).

43
Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường
xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các
nồng độ khác nhau, để chọn nồng độ phù hợp kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid
nhất. Kết quả trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro
trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy
Chất kích
thích sinh
trƣởng
Nồng độ
(mg/l)
Phản ứng màu với thuốc thử Wagner
NAA
0
dung dịch đục, tạo tủa vừa
0,1
dung dịch đục mờ, không lắng
0,5
dung dịch tạo tủa nhiều
1
dung dịch đục, tạo tủa vừa
5
dung dịch tạo tủa ít
10
dung dịch tạo tủa ít
IAA
0,1

dung dịch tạo tủa ít
0,5
dung dịch đục mờ, không lắng
1
dung dịch đục, tạo tủa vừa
5
dung dịch đục mờ, không lắng
10
dung dịch tạo tủa ít

Khi cho phản ứng với thuốc thử,ở các mẫu trên môi trường có bổ sung NAA
cho kết tủa nhiều hơn so với các mẫu trên môi trường chứa IAA. Có nghĩa là lượng
alkaloid được tạo ra nhiều trong cây nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA. Điều
này có thể giải thích là do IAA là chất kích thích tăng trưởng có nguồn gốc từ thực
vật nên việc sử dụng IAA như chất cảm ứng để kích thích khả năng tổng hợp
alkaloid không có hiệu quả như khi sử dụng chất có nguồn gốc hóa học như NAA.



44
Trong số các nồng độ NAA sử dụng thì thấy mẫu cây trên môi trường chứa
NAA 0,5 mg/l tạo kết tủa nhiều nhất khi phản ứng với thuốc thử. Ở nồng độ 1 mg/l,
5 mg/l và 10 mg/l cho phản ứng tạo tủa vừa, dung dịch đục còn ở 0,1 mg/l thì dung
dịch đục và tạo kết tủa rất ít. Như vậy, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cây
sản xuất được nhiều alkaloid nhất (Hình 4.4).

Các mẫu cây nuôi trên môi trường chứa IAA khi cho phản ứng với thuốc thử
thì thấy dung dịch đục mờ ít lắng, điều này có thể là do lượng alkaloid toàn phần
trong cây trên môi trường này được tạo ra ít. Trong các nồng độ thí nghiệm thì khi
dùng IAA 1mg/l cho hiện tượng tạo kết tủa rõ ràng nhất, ở các nồng độ còn lại có
thể do lượng alkaloid trong mẫu ít nên không quan sát thấy kết tủa, chỉ thấy dung
dịch vẫn đục (Hình 4.5).
1 2 3 4 5 6
Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu
thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên
môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau,1) 0 mg/l, 2) 0,1
mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l.




45

.









Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng
auxin thích hợp (NAA 0,5 mg/l hay IAA 1 mg/l) thì kích thích khả năng tạo alkaloid ở
cây Trường xuân hoa. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, sử dụng NAA 0,5 mg/l có hiệu
quả hơn.
 Định tính alkaloid trong rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có
bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner
Tiến hành ly trích alkaloid của rễ cây Trường xuân hoa 28 ngày tuổi trên các
môi trường khác nhau trong acid H
2
SO
4
loãng sau đó nhận diện alkaloid bằng thuốc
thử Wagner.

1 2 3 4 5
Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân
lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi
trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5
mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l.