Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật vào nông nghiệp

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip




Sở GIO DC V O TO HNG YấN
TRNG THPT TIấN L
Sáng kiến kinh nghiệm
Nm hc: 2012 2013
Mụn: Sinh hc
Đề tài: ứng dụng công nghệ sinh học
thực vật trong nông nghiệp


Ngời thực hiện: đỗ ngọc thái

Tiên Lữ, tháng 4 năm 2013

GV: Ngc Thỏi - 1 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Mục lục
Tran
g
Phần A: Đặt vấn đề
I. Lí do chọn đề tài 2
II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

III. ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3
IV. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu 3
V. Phơng pháp nghiên cứu 3
Phần B: Nội dung nghiên cứu
I. Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật. 4
II. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn.
2.1. Các yếu ảnh hởng.
5
2.2. Tái sinh cây.
6
2.3. ứng dụng.
7
III. Chọn dòng tế bào thực vật.
3.1. Cơ sở khoa học.
8
3.2. Vật liệu và phơng pháp.
9
3.3 chọn dòng chịu bệnh.
11
3.4. Chọn dòng chống chịu các stress của môi trờng.
14
3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao.
17
IV. Lai tế bào thực vật. 20
V. Chuyển gen ở thực vật.
5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
26
5.2. Các phơng pháp chuyển gen.
27

5.2.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens.
27
5.2.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens và virus.
28
5.2.3. Phơng pháp chuyển gen trực tiếp.
28
5.2.4. Phơng pháp chuyển gen nhờ sung gắn gen.
29
5.2.5. Phơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm
29
5.3. ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nông nghiệp
31
VI. Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam 31
VII. Kết quả nghiên cứu và thực nghiệm s phạm 33
VIII. Điều kiện áp dụng đề tài
Phần C: Kết luận và kiến nghị
I. Kết luận 34
II. Kiến nghị 34

GV: Ngc Thỏi - 2 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



III. Những hạn chế và hớng phát triển tiếp của đề tài 35
Tài liệu tham khảo
36
Phần A: đặt vấn đề
I. Lí do chọn đề tài

Thế kỉ XXI là thế kỉ của công nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học
mũi nhọn và then chốt của nhiều nớc. Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong
những tiêu chí hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nớc nào đó. Chính vì vậy,
các nớc đã tập trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành công nghệ
sinh học (biotechnology).
Với tầm quan trọng nh vậy nên ở tất cả các Trờng Đại học: Nông nghiệp, Lâm
nghiệp, Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ môn hay khoa công nghệ sinh học.
Trong chơng trình môn Sinh học và Công nghệ Trung học phổ thông có khoảng từ
5 -10 bài học có liên quan đến công nghệ sinh học. Trong các đề thi tuyển sinh đại học có
khoảng 2 - 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến công nghệ sinh học. Điều này đòi hỏi
các đồng chí giáo viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và toàn diện về
công nghệ sinh học. Tuy nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo viên và các
em học còn nhiều bỡ ngỡ.
Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh
nghiệm, tôi đã mạnh dạn chọn đề tài:
ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp
II. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1- Mục đích :
Xây dựng và hoàn thiện chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong
nông nghiệp và trở thành nguồn t liệu quý cho giáo viên và học sinh.
2- Yêu cầu :
Trình bày đợc ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau:
- Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn
- Chọn dòng tế bào thực vật
- Lai tế bào thực vật

GV: Ngc Thỏi - 3 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

- Chuyển gen thực vật
- Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam
III. ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn t liệu phong phú giúp cho mỗi giáo
viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công
nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo
viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự
phát triển của ngành công nghệ sinh học nớc nhà.
Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói
chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ
vào chuyên ngành khối B của các trờng Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp.
IV. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu: Thực vật.
Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực.
Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy
mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật
chuyển gen ở thực vật. Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy -
học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông.
V. Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp nghiên cứu các tài liệu đợc lấy từ các nguồn thông tin nh giáo trình đại
học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dỡng giáo viên các trờng chuyên,
internet, Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Phơng pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia.
Phơng pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề Công nghệ sinh học
Phơng pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ơng,
Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học,
Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp

tham gia đề tài cấp nhà nớc Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc
thụ bầu nhụy vào cây cam Vinh và quýt Đờng canh.
Phơng pháp đánh giá qua thực tiễn s phạm.

GV: Ngc Thỏi - 4 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Phần B. Nội dung nghiên cứu
I. VI NHâN GIốNG bằng nuôi cấy mô thực vật
Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống in vitro. Quá trình
nhân giống này phải trải qua nhiều công đoạn:
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những
quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của
D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di
truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thớc nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm
sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân.
Các chồi nhân ban đầu thờng đợc tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi
trờng thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trởng
(xitokinin và auxin). Vi nhân giống đợc bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ
các cây định nhân sau đó khử trùng và đa vào nuôi cấy ở môi trờng phù hợp có xitokinin.
Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi đợc nhân
lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại đợc tách ra chuyển sang môi trờng mới và
qui trình cứ thế đợc lặp lại. Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển sang môi trờng có auxin.
Đây là phơng pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phơng pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo
hoặc phôi, nhng các chồi nhân giữ lại đợc những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị
thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trờng và hệ thống nhân phù
hợp, hệ số nhân đã đợc tăng lên nhiều (5

8
5
15
chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong
môi trờng lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor.
Trong một số trờng hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi
hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phơng pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhng thờng
kéo theo sự biến dị sôma nên trớc khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ
những thay đổi về di truyền.
Vi nhân giống có những u việt sau:
- Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đa giống vào sản xuất.
- Nhân đợc một số lợng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m
2
nền có thể để
đợc tới 18.000 cây.

GV: Ngc Thỏi - 5 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



- Cây đợc làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các
cây giống sạch bệnh.
- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng
15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4
o
C trong
hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm

trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ớc tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng
đợc yêu cầu thực tiễn.
Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phơng pháp vi nhân còn cao (300
- 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là
cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá trị kinh
tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phơng pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ
hạt.
Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây nh lan, hoa cúc, hoa
hồng, cẩm chớng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông
Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, còn có thể
rút ngắn thời gian đa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm
tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.
II. TạO CâY ĐơN BộI bằng nuôi cấy hạt phấn
Có nhiều phơng pháp tạo cây đơn bội, nhng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội
bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đợc phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi
cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trờng thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977)
hoặc môi trờng lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân
chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây.
2.1. Các yếu tố ảnh hởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo
2.1.1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hởng rất lớn đến hạt
phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng nh nhiệt độ là những
yếu tố ảnh hởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell
(1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận đợc khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây

GV: Ngc Thỏi - 6 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cờng độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ
hạt phấn cao hơn.
ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở
một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu
gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ
cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ.
Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10
o
C) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ
hạt phấn (Wenzel & cs, 1977).
2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro
Thành phần cacbonhydrat trong môi trờng hết sức quan trọng, đặc biệt là đờng
sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến
6%, thậm chí 12%.
Trong các chất hữu cơ, các axit nh glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi
ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá.
Các dịch chiết tự nhiên nh dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác nh
vitamin C, nớc dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi
cấy bao phấn.
Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong tr-
ờng hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thờng có tác dụng ở giai đoạn
nuôi cấy ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy.
Trong một số ít trờng hợp etylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi
cấy bao phấn trong môi trờng lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.
Bổ sung vào môi trờng than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm
tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối
với thuốc lá mật độ tối u là 10
5

hạt/ml môi trờng. Đối với các cây khác mật độ dao động
từ 10
4
- 10
5
.
ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần
300-500 lux. Nhiệt độ bình thờng từ 25-28
o
C là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và
hạt phấn của hầu hết các giống cây.

GV: Ngc Thỏi - 7 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



2.2. Tái sinh cây
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tơng đối dễ, thậm
chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trờng tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số loài
cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trờng nuôi cấy ban đầu chứa
chất sinh trởng và đờng cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang
môi trờng không có chất điều hòa sinh trởng. Một số trờng hợp phải dùng zeatin và nớc
dừa mới có thể tái sinh cây.
Trong trờng hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi
trờng không có chất điều hòa sinh trởng, nhng thờng thì phải chuyển sang môi trờng có
nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thờng hay dùng là BAP và
kinetin. Cho thêm các chất nh casein, lactoabumin thủy phân và nớc dừa thờng làm gia
tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.

Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thờng cho tỉ lệ
tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc th-
ờng có hiện tợng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy
rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài
ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping,
1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhng ở một số loài cây có cả cây
nhị bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị
bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự
phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
2.3. ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trớc hết là làm nguyên liệu để
tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí
consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Nh đã nói trên,
ở một số loại cây có thể nhận đợc cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn
hoặc hạt phấn, nhng trong trờng hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lỡng.

GV: Ngc Thỏi - 8 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng đợc sử dụng tạo
các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tơng hợp ( Chu & cs, 1978) và rút
ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo đợc ứng dụng trong sản xuất lúa
mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc
lá cho năng suất cao và chất lợng tuyệt hảo đã đợc tạo ra bằng phơng pháp cấy bao phấn
(Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới nh Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs,
1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã đợc tạo bằng phơng

pháp nuôi cấy hạt phấn. Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn đợc sử dụng để phát triển
quần thể cho việc lập bản đồ phân tử.
Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tợng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các
cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền
các tính trạng lặn. Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây
đơn bội cũng đợc dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về NST. Nuôi cấy
bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến.
Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn
Bao phấn hoặc Giống mới
hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn

Cây đơn bội

Lỡng bội hóa

Cây lỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng
III. CHọN DòNG Tế BàO THựC VậT (CDTBTV)
3.1.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng. Mỗi
loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lợng lớn các tế
bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem nh quần thể thực vật ở

GV: Ngc Thỏi - 9 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào đợc tái
sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần
thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhng trong suốt quá trình sinh trởng và phát
triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di
truyền do ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa
sinh trởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và
phát triển, những quần thể tế bào này là đối tợng hết sức lí tởng trong việc sử dụng các
chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng nh cây trồng, trong nuôi cấy
mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự
thay đổi gen, đợc gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay
đổi gen, đợc gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài gen không di truyền đợc.
Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tợng
phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào
có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phơng pháp chọn lọc nào.
Hiện tợng này gọi là hiện tợng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế
bào nuôi cấy là calliclones (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh
từ protoplast là protoclones (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đa ra
một định nghĩa có tính chất khái quát hơn somaclonal variation để chỉ tất cả những thay
đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào.
3.2. Vật liệu và phơng pháp chọn dòng
Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là
tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những u điểm và nhợc điểm riêng.
Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phơng
pháp nuôi cấy đối với từng loại cây.
Vật liệu thờng dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo đợc dùng
để chọn các dòng chống chịu nh chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối
(McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp
cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986).
Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phơng pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên

môi trờng chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột
biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phơng
pháp chọn lọc từng bớc tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của

GV: Ngc Thỏi - 10 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngoài ra cũng có thể sử dụng kết
hợp cả hai phơng pháp. Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thờng liên
tục trên môi trờng chọn lọc hoặc khi chuyển môi trờng chọn lọc và sau một thời gian dài
cấy trên môi trờng không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã đợc chọn lọc.
Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có u điểm là đơn giản nhng nguyên liệu
này có một số nhợc điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có nhiều
tế bào bình thờng nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang
đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây
có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thờng. Để
khắc phục nhợc điểm này có thể giảm kích thớc của mô: mô càng nhỏ càng tốt. Trọng l-
ợng mô thờng dùng là 100-150 mg, nhng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha &
Widholin, 1987).
Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã đợc nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami
& Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phơng pháp chọn lọc
trực tiếp và chọn từng bớc cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tợng. Sử dụng tế
bào dịch lỏng để CDTBTV có u điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào đợc tiếp xúc
đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhng một nhợc điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả
năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trờng hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các
dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990).
Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp

và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trờng hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp
ứng đợc mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ
nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng đợc nhiều mặt trong
CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào đợc phát triển đồng
đều trong môi trờng, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng
là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh đợc hiện tợng khảm.
Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs,
1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã đợc chọn lọc
nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trớc đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất
là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ
thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy

GV: Ngc Thỏi - 11 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng nh
khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã đợc công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu
lý tởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tợng quan trọng trong
cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế
bào và chuyển gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và
protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu
CDTBTV. Một trong những mô phân hóa đợc sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright,
1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs
(1985) đã chọn đợc dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs

(1989) cũng nhận đợc dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá.
Bên cạnh việc sử dụng các phơng pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào
dịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để
làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi
tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Ph-
ơng pháp tơng tự cũng đợc một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N
-ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981).
Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trớc khi đa vào nuôi cấy và chọn
lọc.
3.3. Chọn dòng chịu bệnh
Mặc dù phơng pháp truyền thống có thể tạo đợc các dòng hoặc giống chịu bệnh
nhng trong một vài trờng hợp không thể chọn đợc các dòng chịu bệnh bằng những phơng
pháp này hoặc chọn đợc nhng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm bệnh nhân
tạo cho một số lợng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngoài ra gây
nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng phơng
pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh
gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngợc mất rất
nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển đợc các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt
đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực hiện đợc bằng lai tạo.
Đột biến thực nghiệm có thể tạo đợc giống cây chịu bệnh nhng tần số xuất hiện
các đột biến đơn gen rất thấp (10
-4
- 10
-6
), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tơng đối
cao.

GV: Ngc Thỏi - 12 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc
phục đợc nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh nh: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn
lọc, khống chế đợc điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận đợc các đột biến đơn gen
và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trờng hợp đột biến thực nghiệm là 10
-4
- 10
-6
thì ở quần thể cây tái sinh (R
o
) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin &
Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có
thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần
nghiên cứu giải quyết nh vấn đề tơng hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tợng lây
nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân
gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc
tố gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã đợc sử dụng là virus và đối tợng đợc lây nhiễm là
protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo đợc quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân
biệt đợc tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển
trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975),
Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi
vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu
vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trờng phù hợp cho
sự sinh trởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào
sạch virus sinh trởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trởng chậm hơn

và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh nh Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,
1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,
1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae
(Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977),
Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã đợc sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.
Prasad và cs (1984) đã chọn đợc dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sơng bằng phơng
pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi
lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn đợc các dòng kháng

GV: Ngc Thỏi - 13 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



bệnh. Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện
in vitro và nhận đợc những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung &
cs, 1987). Ngoài ra có thể đa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất bị nhiễm
nấm, nhng hớng này cha đợc tiến hành nhiều.
Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã đợc dùng nhiều trong
chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có u điểm là các tế bào có thể bị
nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể
sử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng. Ngoài ra còn có sự tơng quan thuận giữa
kháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã đợc tiến
hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng
(Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey,
1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985). Sử dụng ĐTGB
đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn đợc các đột biến kháng bệnh hiếm

(Carlson, 1973).
Bên cạnh những u điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lu ý một số vấn
đề nh xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trờng hợp
cây bị bệnh nhng không phát hiện có độc tố hoặc xác định đợc trong cây có độc tố gây
bệnh nhng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề
nữa là trong nhiều trờng hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không có khả năng
kháng bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc
điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhng nếu ta tái sinh đợc số lợng cây nhiều đến
mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã
đợc khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận đợc 10-
20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.
ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB
thô dới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn đợc sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh.
Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã đợc công bố khi sử dụng ĐTGB thô nh khoai tây kháng
P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá
kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum
f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã
nhận đợc dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng
độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.

GV: Ngc Thỏi - 14 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Ngoài phơng pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào,
mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng
dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn đợc
dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980;

Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh
theo phơng pháp này. Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống
lhoai lang Sarlet chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã đợc chọn và đa vào sản xuất.
Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các
giống cây thì chọn lọc theo hớng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống
chịu bệnh đuợc đa vào sản xuất nhng có một số mặt hạn chế của phơng pháp này: Thứ
nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là
phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều khi chọn đợc dòng chị bệnh
nhng lại ảnh hởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard, 1981).
Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy
mô và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề
cần giải quyết nh cơ chế tơng hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh,
liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Một vấn
đề quan trọng nữa là xác định đợc vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro.
Một số vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian
nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác.
Việc chọn lựa đối tợng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn dòng chịu
bệnh cũng rất quan trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có thể áp
dụng để chọn dòng chịu bệnh ở các loài cây sinh sản vô tính thì phù hợp và có kết quả
hơn (Daub, 1986; Jones, 1990). Ngoài ra nuôi cấy mô và tế bào có thể áp dụng để chọn
các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990). Việc sử dụng
các ĐTGB không đặc hiệu để chọn các dòng chịu bệnh đặc biệt mà bằng các phơng pháp
thông thờng không chọn đợc cũng đã đợc đề cập (Jones, 1990).
3.4. Chọn dòng chống chịu các stress của môi trờng
Các stress môi trờng bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trờng nh phèn,
chua, mặn, khô, hạn, nóng, lạnh Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu đợc
các stress môi trờng là rất cần thiết. Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất
trồng bị mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm). 40-60% đất khô hạn.

GV: Ngc Thỏi - 15 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Ngoài ra do việc cải tạo môi trờng nh tới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và
diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác
nhân trên.
Nh đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần
trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trờng. Trớc khi giới thiệu một số
thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng
nh phơng pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trờng. Ngoài một số vấn đề chung đ-
ợc đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao,
chọn dòng chống chịu stress môi trờng còn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính
chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh. Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính
chống chịu stress môi trờng còn cha đợc biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều
alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trờng, ngoài ra các alen này thờng là lặn nên
không thể hiện trong trờng hợp dị hợp tử. Đây là những vấn đề làm cho việc chọn các
dòng chống chịu stress môi trờng cha có đợc những thành tựu mong muốn. Ngoài ra một
số vấn đề quan trọng nữa là tơng quan giữa khả năng chống chịu các stress môi trờng ở
cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn dòng bằng nuôi cấy mô có thể
không tạo đợc cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên đồng ruộng. Mặc dù có một
số vấn đề hết sức quan trọng đợc nêu ở trên, thực tế vẫn có những cơ sở và số liệu đáng
tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dòng chống chịu với
các stress môi trờng: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi bởi đột biến
xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này. Những kết quả nghiên cứu của
Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số
stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau. Ngoài ra đã có
những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các đặc điểm đợc chọn lọc (Comner &
Meredits, 1985).

Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trờng đều
chọn theo phơng pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành
khi mô sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển. Các stress có thể ở mức
độ thấp hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào
chịu đợc một nồng độ nào đó lại đa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có thể liên
tục hoặc gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay cha có những
nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng trờng hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối tợng cụ thể
mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay cách khác. Đây là một vấn đề nghiên cứu về

GV: Ngc Thỏi - 16 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



mặt phơng pháp nhng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành công trong việc
chọn các dòng chống chịu stress môi trờng. Muốn nhận những đột biến mới hoặc đột biến
lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở mô đơn bội từ hạt
phấn lai F
1
có thể nhận đợc các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của các alen sẵn có.
Trong những năm gần đây đã có những bớc tiến đáng kể trong việc chọn dòng
chống chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã đợc chọn lọc từ
mô nuôi cấy của các loài Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium,
Ipomoea babatas L. (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985),
Medicago sativa L. (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and
Swartz, 1984). Tính chống chịu trong một vài trờng hợp đợc thông báo là ổn định ở mức
độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991). Về cơ chế của tính chịu muối cũng đã có
những kết quả đáng ghi nhận. ở Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá địa ph-
ơng chịu muối cũng đợc tiến hành và đã thu đợc những kết quả tiến bộ (Nguyễn Hoàng

Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là
chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lợng
26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987). Mối tơng quan giữa ABA, tính
chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong
những năm tới. Các dòng chịu hạn đã đợc thông báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs,
1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đa vào môi trờng
để chọn. Vấn đề tạo dòng kháng nhôm đợc Couner và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner &
Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn đợc các dòng thuốc lá kháng nhôm ổn định, tính
kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau. Việc chọn các dòng chống chịu
với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs. (1983) đã nhận đợc các cây cúc
chịu đợc nhiệt độ thấp. Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ trớc đến nay đều tập trung
vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng. Những kết quả của Chen và Gusta (198)
nhận đợc trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy
ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể. Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để
tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng nhận đợc những kết quả tơng tự về tác dụng của ABA.
Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein
mới nhng vai trò cụ thể của từng loại protein mới này nh thế nào? Chúng có vai trò gì
trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ.

GV: Ngc Thỏi - 17 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Chọn dòng chống chịu stress môi trờng là yêu cầu chiến lợc trong công tác giống
cây trồng nhng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm các phơng
pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận đợc mới chỉ
là những cơ sở hết sức ban đầu. Để có đợc những thành công trong tơng lai và có đợc
những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hớng trên vẫn là điều quan tâm

hàng đầu.
3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhng không có
vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong
cây. Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá
trình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất
có tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hơng vị đặc biệt. Sự phát triển của kỹ
thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ
thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Hiện nay có nhiều
phòng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực
vật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp. Một trong những yêu cầu của quá trình công
nghiệp hoá tế bào nuôi cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năng
suất cao và ổn định.
Vật liệu thờng dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô
hoặc tế bào nuôi cấy dịch lỏng.
Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp
không có màu trớc khi cấy chuyển cần đợc phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều công
sức và thời gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đa ra phơng pháp ép tế bào. Theo
phơng pháp này, các cụm tế bào hoặc mô đợc ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm
vào giấy lọc sau đó dùng phơng pháp nhuộm để xác định. Đối với một số chất đợc tế bào
tiết ra môi trờng thì có thể xác định theo phơng pháp dùng màng phủ than hoạt tính để
hấp thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198).
Ngoài ra có thể sử dụng phơng pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của
vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra nh berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987). Các
phơng pháp khác nh phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã đợc sử
dụng.

GV: Ngc Thỏi - 18 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi
cấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn cha đợc sáng tỏ.Tuy nhiên vai
trò của các chất điều hoà sinh trởng và nồng độ đờng đã đợc ghi nhận. Hàm lợng các chất
thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra
môi trờng của các chất này.
Thờng thờng tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ
sinh trởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trởng nhanh và không
kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có tốc độ
phân chia chậm thì có u thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.
Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề
đợc nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có
năng suất cao cho hàm lợng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất
thấp. Cũng trên đối tợng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng
suất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng đợc
công bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến
nay vẫn cha có chứng minh chắc chắn về tơng quan giữa năng suất của cây làm nguyên
liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy. Theo Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa
dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu.
Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòng tế
bào không ảnh hởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả
khác lại nhận đợc các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây,
thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs,
1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) còn cho biết
trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất
màu) cũng khác nhau giữa các tế bào. Những sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp
này là những cơ sở để tìm các phơng pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho năng

suất cao.
Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế
bào nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhng các
tế bào riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ
không ổn định.

GV: Ngc Thỏi - 19 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứ
hai và thứ ba tạo ra các dòng ổn định và không ổn định.
Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn cha sáng tỏ là cơ sở của những thay
đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôi cấy in
vitro. Để có đợc những phơng pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp
cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng.
Ngoài những phơng pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao
đã nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hớng cần đợc tiến
hành, tuy nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan cha đợc hiểu biết đặc biệt là những
cơ sở sinh hoá và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp.
Mặc dù còn một số vấn đề cần giải quyết nhng những thành tựu đạt đợc trong chọn
dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc đa tế
bào thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nông nghiệp, công
nghiệp và y học. Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và
chất diệt khuẩn Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hoá việc
thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada và các
phòng nghiên cứu của hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công
nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report,

1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công
nghiệp dợc, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện
nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng
nguồn cung cấp hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang đợc quan
tâm đặc biệt. Vấn đề tìm ra các phơng pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp
cao là khâu then chốt để đa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp. Những
thành tích đạt đợc trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hoá sản xuất Shikonin
bằng tế bào nuôi cấy là những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận
các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao.
ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã đợc
bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tợng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm
1988, Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn đợc dòng tam thất cho hàm lợng saponin
cao. Những thay đổi về hàm lợng nicotine liên quan đến quá trình phân hoá mô và cây tái
sinh cũng đã đợc công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).

GV: Ngc Thỏi - 20 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



iv. lai tế bào
4.1. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do không có vách xellulô nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tợng lý t-
ởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phơng pháp dung hợp hai
loại protoplast có thể tạo đơc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngoài ra có
thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan nh nhân, lục lạp, ty thể
hoặc chuyển các vectơ mang các gen mã hoá cho một số đặc điểm biết trớc.
Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tợng này thờng xảy ra sau khi tách

protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giống cây
Schieder & Vasil, 1980), ở cà độc dợc tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974).
Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thờng phải xử lý một số tác nhân. Một
số tác giả dùng nớc biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri
(Power & cs, 1970; Carlson, 1972), một số khác sùng các chất kích thích nh lectin nhng
hiệu suất dung hợp rất thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus &
cs, 1974). Hiệu suất dung hợp khá cao có thể đạt đợc bằng cách xử lý protoplast bằng ion
Ca
2+
ở 37
o
C và môi trờng kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974;
Schieder, 1974).
Hiện nay phơng pháp có hiệu quả và đợc sử dụng rộng rãi là phơng pháp dung hợp
của Kao và đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). Các tác giả
đã dùng polyethylen glycol (PEG) có phân tử lợng cao (6000) để gắn các protoplast với
nhau. Quá trình dung hợp xảy ra khi làm loãng dung dịch PEG bằng môi trờng nuôi cấy.
Khi PEG bị làm loãng thì protoplast dần dần trở lại bình thờng và ở phần tiếp giáp giữa
hai protoplast bị vỡ ra và quá trình dung hợp đợc xảy ra. Trong cùng thời gian Wallin và
cs. đã sử dụng thành công phơng pháp này (Wallin & cs, 1974). Nagata đã thay PEG bằng
rợu polyvinyl để dung hợp protoplast của thuốc lá, cà rốt và cây họ đậu (Nagata, 1978).
Phơng pháp sử dụng PEG có hiệu quả đối với nhiều trờng hợp khi dung hợp protoplast
của các cây cùng loài và khác loài, dung hợp tế bào động vật và cả trờng hợp dung hợp
protoplast thực vật với tế bào động vật (Pontecorvo, 1975; Jone & cs, 1976; Dudits & cs,
1976; Vasil, 1976; Vasil & cs, 1976).
Về cơ chế của quá trình dung hợp đã đợc Nagata và Melchers nghiên cứu tỉ mỉ
(Nagata & Melchers, 1978).

GV: Ngc Thỏi - 21 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Cuối những năm 70 và đầu 80 một số tác giả đã đa ra phơng pháp dung hợp bằng
dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982;
Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). Bằng phơng pháp này, các tác giả
đã đạt đợc tần số dung hợp tới 60 và 80%. Tuy tần số dung hợp có cao nhng vấn đề tái
sinh các sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn. Chỉ gần đây một số tác giả mới nhận đợc
cây tái sinh sau khi sử dụng phơng pháp dung hợp này (Kohn & cs, 1985).
Khi dung hợp hai loại protoplast với nhau thờng có ba nguồn gen tham gia (nhân,
lục lạp, ty thể) đợc kết hợp trong các sản phẩm dung hợp. Nếu dung hợp hai loại
protoplast giống nhau ta sẽ tạo đợc các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong tr-
ờng hợp dung hợp hai loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen
(heterogenome). Các sản phẩm đồng hợp gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống nh bố mẹ nhng
với mức bội thể gấp đôi. Các sản phẩm dị hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn hợp lục
lạp và ty thể. Một trong hai nhân có thể bị thoái hoá hoặc cả hai đều phân ly trong quá
trình phân chia tế bào. Sự thoái hoá hoặc phân ly của một nhân trong tế bào dị hợp gen sẽ
tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả hai loại protoplast và chỉ có một nhân. Những
tế bào kiểu này đợc gọi là các thể lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sôma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc điểm
phối hợp, các đặc điểm kháng sinh hoá và các đột biến sắc tố, ngoài ra có thể sử dụng các
đặc điểm khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.
Melcher là ngời đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản
phẩm dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng ph-
ơng pháp tơng tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng loài nh P.innoxia
(Schieder, 1977) và các cây khác loài nh P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N.
Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dỡng nh thiếu
nitrate reductase, thiếu các axit amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã đợc nhiều
tác giả sử dụng có kết quả (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978;

Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs,
1983;Shimamoto & cs, 1983). Điều đáng chú ý là các đột biến sử dụng để chọn phối hợp
phải là các đột biến lặn và khác alen.
Đặc điểm kháng các chất ức chế trao đổi chất cũng đợc sử dụng rộng rãi để chọn
thể lai. Power và cs (1976) đã sử dụng actinomyxin để chọn thể lai giữa P. Parodii và P.

GV: Ngc Thỏi - 22 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Hybrida. Maliga và cs (1977, 1982) dùng kanamyxin và streptomyxin để chọn thể lai
trong các thí nghiệm dung hợp giữa các loài thuốc lá với nhau.
Một số dòng tế bào và cây lai còn đợc chọn bằng sự khác nhau về khả năng sinh tr-
ởng và tái sinh của sản phẩm dung hợp và từng loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power
& cs, 1977), bằng u thế trong sự phát triển của cây lai (Cocking & cs, 1977; Schieder,
1978; Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979;
Lonnerndoker & Schieder, 1980), hoặc hình dạng không bình thờng của mô và cây lai
(Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls, 1978).
Năm 1977 Kao đa ra phơng pháp tách thể dung hợp bằng cơ học. Phơng pháp này
đợc Gleba và đồng nghiệp phát triển và sử dụng tại phòng thí nghiệm của mình (Gleba &
Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979).
Cho đến nay dung hợp protoplast là phơng pháp hiệu quả nhất để tạo cây lai sôma.
Nó cho phép tạo các tổ hợp lai bất kỳ theo ý muốn. Vấn đề là phải nghiên cứu cải tiến
phơng pháp dung hợp, kỹ thuật nuôi cấy và phơng pháp chọnlọc.
Từ công trình lịch sử của Carlson (Carlson & cs, 1972) đến nay bằng phơng pháp
dung hợp protoplast các nhà khoa học trên thế giới đã tạo đợc cây lai sôma từ hàng trăm
tổ hợp lai giữa các cây cùng loài, khác loài và khác chi. Đây là những thành tựu hết sức
lớn lao mà các nhà khoa học đã đạt đợc trong lĩnh vực lai sôma bằng dung hợp protoplast.

Gần đây các nhà nghiên cứu đã tạo đợc cây lai sôma ở cả những giống cây trồng có ý
nghĩa kinh tế nh khoai tây, cà chua và lúa (Handley & cs, 1986; OConnell & Hasnon,
1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua đây ta thấy đợc
triển vọng lớn lao của việc ứng dụng phơng pháp này để cải biến di truyền ở thực vật
nhằm tạo ra giống cây đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi của thực tiễn.
4.2. Lai tế bào chất
Ngoài việc tạo ra các thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast còn có
thể tạo đợc các thể lai tế bào chất (hay còn gọi là lai sinh chất). Trong những năm gần đây
nhiều phòng thí nghiệm ở Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain và Hungary đã
đầu t nhiều cho các nghiên cứu trong lĩnh vực này, vì đến nay một số các đặc điểm chống
chịu của thực vật đợc chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất.
Trong thời kỳ đầu, các nhà nghiên cứu đã cố gắng tạo các thể lai tế bào chất bằng
cách đa các bào quan tách rời vào protoplast. Potrykus là ngời đầu tiên công bố chuyển đ-

GV: Ngc Thỏi - 23 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



ợc lục lạp vào protoplast của Petunia hybrida (cây dạ yên) nhng không có những số liệu
chứng minh chắc chắn sự tồn tại của lục lạp trong tế bào (Potrykus, 1973). Những công
trình của Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) và Kung ( 1975) cũng ở tình trạng t-
ơng tự.
Vasil và vợ của ông đã công bố kết quả chuyển ty thể từ cây bất dục đực (BDĐ) ở
cây ngô và cây Dã yên vào protoplast của cây bình thờng và tái sinh đợc cây (Vasil &
Vasil, 1974; Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định đợc gen điều khiển tính BDĐ ở ngô.
Những công trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay không có những công bố
tiếp theo. Sở dĩ nh vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn và
giữ nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong quá trình tách

và làm sạch, các bào quan bị giảm sức sống. Ngoài ra chúng còn dễ bị ảnh hởng bởi các
tác nhân trong quá trình dung hợp. Mặt khác nữa là trong các công trình kể trên hiệu suất
dung hợp còn rất thấp.
Bắt đầu từ năm 1978 đến nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật dung hợp hai
loại protoplast, trong đó một loại có các đặc điểm di truyền lục lạp và ty thể đã đợc xác
định để tạo các cây lai tế bào chất. Belliard và cs (1978) là những ngời đầu tiên sử dụng
thành công phơng pháp này. Tuy nhiên tỷ lệ cây lai tế bào chất nhận đợc còn thấp và việc
phân tích di truyền các cây lai nhận đợc bị gặp nhiều khó khăn do sự hình thành cả các
thể lai nhân. Để khắc phục những hạn chế trên, Zelcer và đồng nghiệp lần đầu tiên sử
dụng phơng pháp dung hợp cho và nhận (Zelcer & cs, 1978). Ông dùng tia X để giết
nhân của một loại protoplast. Những protoplast đã bị chiếu xạ này không thể phân chia đ-
ợc mà chỉ đóng góp tế bào chất trong quá trình tạo cây lai. Zelcer dung hợp protoplast đã
giết nhân (protoplast cho tế bào chấ) của N. Tabacum với protoplast nguyên vẹn
(protoplast nhận) của N. Sylvestris. ôõng đã chuyển đợc tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N.
Tabacum sang N. Sylvestris.
Các đặc điểm liên quan tới lục lạp cũng đã đợc chuyển thành công nhờ phơng pháp
trên (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983,
1984, 1985; Kemble & Barsby, 1988).
Ngoài việc dùng tia phóng xạ để giết nhân có thể dùng một số chất hoá học nh
iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoặc dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977;
Maliga & cs, 1982). Nhng trong các trờng hợp này tỷ lệ nhân sống sót vẫn còn đáng kể.

GV: Ngc Thỏi - 24 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip



Đối với các đặc điểm di truyền lục lạp rất dễ dàng chọn lọc và theo dõi sau khi
dung hợp bằng các chỉ thị di truyền lục lạp nh các đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), các

đột biến kháng sinh hoá nh kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs,
1985), các đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo &
Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) và các đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel 1984).
Đại phân tử của enzim ribulozo 1, 5 difotfat carbonxylase đợc tổng hợp nhờ thông
tin di truyền lục lạp đã đợc sử dụng để nghiên cứu sinh hoá lục lạp (Kung & cs, 1975).
Phơng pháp phân tích sinh hoá chính xác hơn nữa đó là phơng pháp phân tích điện di đồ
của ADN lục lạp (cpADN) sau khi dùng các enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành những
đoạn khác nhau và phân lập các đoạn cắt này bằng điện di (Belliard & cs, 1978). Hiện nay
phơng pháp này đợc sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Ngoài khả
năng sử dụng với bất kỳ tổ hợp lai nào, phuơng pháp này còn rất chính xác nó cho phép
xác định đợc 1% hỗn hợp của cpADN.
Khác với lục lạp các đặc điểm liên quan tới ty thể không có những chỉ thị để chọn
trong khi nuôi cấy in vitro. Một số tác giả đã dùng chỉ thị lục lạp để chọn (Medgyesy &
cs, 1980; Menczel & cs, 1982). Trờng hợp này chỉ sử dụng đợc khi lục lạp và ty thể liên
kết với nhau theo một cơ chế nào đó.
Nghiên cứu hình thái của hoa có thể gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai trong
các cây lai. Tính BDĐ cũng đã đợc sử dụng làm chỉ thị để chọn đặc điểm ty thể ở thuốc lá
(Belliard & cs, 1979) và Dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980).
Giống nh lục lạp phơng pháp phân tích điện di đồ của ADN ty thể (mtADN) cũng
đợc sử dụng rộng rãi để xác định ty thể trong cây lai tế bào chất. Belliard và cs đã dùng
phơng pháp này để nghiên cứu ty thể ở những cây lai trong thí nghiệm dung hợp
protoplast thuốc lá và đã phát hiện thấy sự tái tổ hợp của mtADN trong các cây lai
(Belliard & cs, 1979). Tiếp sau đó Nagy và cs (1981), Galun và cs (1982) và nhiều tác giả
khác đã sử dụng những phân tích mtADN để nghiên cứu và theo dõi hoạt động của ty thể
ở các cây lai tế bào chất.
Số phận của lục lạp cũng nh ty thể ngoại lai trong cơ thể lai tế bào chất là một vấn
đề đợc các nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu vì việc biến đổi di truyền tế bào chất chỉ có
ý nghĩa khi những thông tin di truyền lục lạp và ty thể ngoại lai tồn tại và hoạt động bình
thờng trong cơ thể lai.
Những kết quả đầu tiên của Kung (Kung & cs, 1975, 1977) và Chen (Chen & cs,

1977) cho thấy các cây lai giữa N. Glauca và N. Langsdorffii phần lớn chỉ chứa một loại

GV: Ngc Thỏi - 25 - Trng THPT Tiờn L