Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L., Amaryllidacceae (tóm tắt)

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID
CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc
Mã số: 62.73.15.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014
2
Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường
họp tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Vào ……. giờ ……. ngày ……. tháng …… năm …….
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM
- Thư viện Đại học Y Dược TPHCM
3
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
1. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ
(2013), Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá TNHC (Crinum
latifolium L. Amaryllidaceae), Tạp chí Dược học, số 441, tr. 38-41.
2. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Lê Minh Thắng, Kiều Lê Thanh Thảo, Võ Thị Bạch
Huệ (2013), Định lượng đồng thời 6 alcaloid (crinamidin, 6-
hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin,
6-hydroxyundulatin) từ cao chiết lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao, Tạp chí dược học, số 442, tr. 52-56.
3. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Trịnh Thị Thanh Nhã, Phan Thanh Dũng, Võ Thị
Bạch Huệ (2013), Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin
trong lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện
di mao quản, Tạp chí dược học, số 443, tr. 53-58.
4. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011),
“Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin
layer chromatography and column chromatography”, Conference
proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216.
5. Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi
Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE
inhibitor activity of Crinum latifolium L. leaves extracts”, Conference
proceeding, The 2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254.
6. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011),
“Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L.,
Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7
th
Indochina Conference on
Pharmaceutical Sciences, pp 607-611.
7. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Ngoc Yen (2011),
“Isolation and identification of alkaloidal composition from the roots of
Crinum latifolium L. Amaryllidaceae by silica gel coated buffer on

chromatographic column technique”, Proceeding of The 7
th
Indochina
Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603.
8. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang
(2011), “Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of
4
Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7
th
Indochina
Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606.
5
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
- Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae)
là dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng,
hoặc dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến
tiền liệt.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được
nhiều tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố. Tuy nhiên
các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn. DĐVN IV
hiện vẫn chưa có chuyên luận cho cây TNHC. Do đó, công tác đảm
bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có TNHC vẫn chưa
được thực hiện một cách chặt chẽ. Nguyên nhân chủ yếu là do thành
phần hóa học của dược liệu này vẫn chưa được công bố một cách
toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất đánh dấu
và hoàn toàn chưa có bất kỳ chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ
dược liệu này được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc
gia.
Với mong muốn giải quyết các bất cập hiện tại trong công tác “Đảm

bảo chất lượng” cho nguyên liệu TNHC, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và
xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và
flavonoid cho cây Trinh Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium
L., Amaryllidaceae” với các nội dung nghiên cứu như sau:
1. Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid
và phân lập hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung.
2. Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây
Trinh nữ hoàng cung.
3. Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid
trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp HPLC và CE.
6
4. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm nguyên liệu bột lá Trinh nữ hoàng cung.
2. Tính cấp thiết của đề tài: cho đến nay chưa có công trình khoa
học nào xác định toàn diện thành phần hóa học cũng như chưa có tài
liệu xác định các chất đánh dấu và chưa có quy trình định lượng đồng
thời một số chất đánh dấu trong thành phần TNHC. Hệ thống kiểm
nghiệm quốc gia chưa cung cấp bất kỳ CĐC nào có nguồn gốc từ
TNHC.
Tuy nhiên, thực tế thì cây TNHC đang được sử dụng rất phổ biến. Vì
vậy các kết quả nghiên cứu của luận án có thể giải quyết được bất cập
trong công tác quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu cũng như
các sản phẩm có thành phần TNHC.
3. Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình
nghiên cứu cho cây TNHC như sau:
1. Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC.
2. Phân lập đươc 17 hoạt chất từ các bộ phận của TNHC.
Trong đó có một alcaloid mới, cấu trúc là 6-ethoxyundulatin. Các

hợp chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được
phân lập lần đầu tiên từ cây TNHC.
3. Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin,
lycorin, hippadin, astragalin và isoquercitrin. Hiện tại, các CĐC này
đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
4. Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích
alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE. Các quy trình này đều
chưa được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới.
5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm TNHC. Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều
chưa có chuyên luận này.
7
4. Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1:
TQTL (24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương 4
BL (16); kết luận (2); kiến nghị (1). Và danh mục công trình (1);
TLTK (12).
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Thực vật học cây TNHC:
Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên
Amaryllidaceae.
Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung
trinh nữ, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng.
Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía
trên có thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành.
Phiến lá dạng bản, màu xanh nhạt, mép lượn sóng. Cụm
hoa tán, có 10-20 hoa. Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng.
Nhị 6 rời nhau; màu trắng, bao phấn màu vàng 2 ô. Bầu
hạ, 3 ô. Vòi nhụy dạng sợi.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học:

Có các nhóm hoạt chất chính là alcaloid (36) và flavonoid (8); ngoài
ra còn có nhóm coumarin, carbohydrat.
Các tác dụng chính là kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và
kích thích miễn dịch.
- Các phương pháp chiết hoạt chất và khảo sát hóa học
Hoạt chất được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt, hoặc ngâm; hoặc
đun hồi lưu.
8
Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng kỹ thuật sắc ký cột hoặc
sắc ký lớp mỏng chế hóa.
Thành phần alcaloid trong TNHC được xác định bằng phương pháp
GC, UV, HPLC.
- Phương pháp thiết lập chất đối chiếu:
Theo hướng dẫn của ASEAN.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là các alcaloid và flavonoid trong cây TNHC.
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Các phương pháp chiết xuất:
- Chiết ngấm kiệt, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu
các điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu.
- Chiết bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát các yếu tố áp
suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ.
2.2.2. Phương pháp phân lập chất tinh khiết:
- Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển.
- Biện giải cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS,
NMR.
2.2.3. Phương pháp HPLC, CE và dấu vân tay:
Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng
alcaloid và flavonoid trong cây TNHC. Quy trình phải đạt các yêu

cầu về thẩm định.
- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid
từ lá TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu.
- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha
động, kỹ thuật rửa giải.
9
- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ
đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS.
- Phương pháp dấu vân tay:
- SKLM: khảo sát các điều kiện phân tích về dung môi và
thuốc thử phát hiện để xác định các đặc trưng cơ bản của DVT–
SKLM của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của
TNHC qua hệ số R
f
và màu sắc của các vết đặc trưng.
- HPLC: ứng dụng các điều kiện của phương pháp HPLC vào
phân tích vân tay cho dược liệu TNHC. Ghi nhận thời gian lưu, phổ
UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng. Xác định DVT– HPLC
của hai nhóm hoạt chất chính của TNHC.
2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC:
Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập
CĐC hóa học thứ cấp.
2.2.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm dược liệu TNHC:
- Các chỉ tiêu hóa lý thông thường của dược liệu và phương pháp
thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN IV.
- Chỉ tiêu định tính bằng bằng phương pháp dấu vân tay được khảo
sát với 6 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.
- Chỉ tiêu định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được
khảo sát với 2 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Các quy trình chiết cao cồn, alcaloid và flavonoid từ TNHC
Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và flavonoid bằng phương pháp
ngấm kiệt:
10
- Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 12
giờ. Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ. Rút
dịch chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl
3
1%. Tỷ lệ
dung môi/dược liệu là (10 : 1). Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc.
- Chiết flavonoid: cao cồn được siêu âm với HCl 1%. Lắc với ethyl
acetat đến khi âm tính với TT FeCl
3
1%. Gộp các dịch chiết ethyl
acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid.
- Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa
bằng amoniac 25% đến pH 9-10. Lắc với cloroform đến khi âm tính
với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid.
Chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp:
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ
thống chiết bằng lưu chất CO
2
do Đài loan sản xuất với ba
bình chiết lắp song song, thể tích 20 lít/bình. Điều kiện
SFE: áp suất 200 bar, nhiệt độ 50
o
C, thời gian chiết 2 giờ,
15% cồn 96%. Dịch SFE được thu hồi dung môi (cao L-
SFE). Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1%. Dịch acid được

chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE.
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau
khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Dịch chiết
cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK.
3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC
- Các PĐ alcaloid và flavonoid được chiết từ các bộ phận của cây
TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC.
- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân
lập alcaloid; silica gel pH 4 cho mẫu phân lập flavonoid.
- Riêng 6-ethoxyundulatin (2) và 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua 3
giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm kém
11
phân cực từ PĐ AL-SFE. Sử dụng 2 lần sắc ký cột, lần đầu sử dụng
chất hấp phụ silica gel RP-18 để loại tạp dầu béo, sau đó là silica gel
cỡ hạt nhỏ và rửa giải bằng n–hexan với tốc độ chậm để tránh dồn
vết.
Kết quả: phân lập được 17 hợp chất từ các cao TNHC. Trong đó:
- 1 alcaloid mới được công bố lần đầu tiên, cấu trúc được xác
định là 6-ethoxyundulatin.
- 7 hợp chất đã được công bố từ dược liệu khác, lần đầu tiên
được công bố từ TNHC: kaempferol, isoquercitrin, flazin, esuletin, p-
hydroxybenzoic, 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin.
- 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin,
augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6-
hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin.
3.3 Thiết lập chất đối chiếu
- Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là
chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC.
- 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin,
6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; 2 flavonoid là astragalin và

isoquercitrin.
3.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC
- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết bằng HPLC:
Điều kiện phân tích: cột: C
8
Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 µm);
nhiệt độ cột: 40
o
C; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động.
- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.13 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh
khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.
Tên chất khảo sát Thành phần và tỷ lệ pha động
Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)
12
6-hydroxycrinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)
Lycorin Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 : 90)
Hippadin Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 : 30)
Astragalin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)
Isoquercitrin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)
Xác định tính phù hợp hệ thống: các hệ số sắc ký đều đạt yêu cầu,
quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.
Thẩm định quy trình:
- Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu tại
vị trí thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thử.
- Tính tuyến tính: tiêm 6 nồng độ của mỗi chất từ 10
→

500 (µg/ml).

Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:
Crinamidin: ŷ = 70299x R
2
= 0,9994
6-hydroxycrinamidin: ŷ = 149967x R
2
= 0,9996
Lycorin: ŷ = 9088x R
2

= 0,9999
Hippadin: ŷ = 58426x R
2
= 0,9990
Astragalin: ŷ = 21716x R
2
= 0,9969
Isoquercitrin: ŷ = 17244x R
2
= 0,9991
Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R
2
> 0,998).
- Độ chính xác:
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2. RSD% độ tinh khiết sắc
ký của các pic chính < 2%.
Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các CĐC đạt yêu
cầu về độ chính xác.
13

Bảng 3.15 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng
HPLC.
Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%)
Crinamidin 98,71% (RSD% = 0,02)
6-
hydroxycrinamidin
96,78 % (RSD% = 0,08)
Lycorin 99,99% (RSD% = 0,03)
Hippadin 99,92% (RSD% = 0,02)
Astragalin 98,29% (RSD% = 0,11)
Isoquercitrin 98,12% (RSD% = 0,03)
- Độ đúng: chưa thực hiện được vì hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc
gia chưa phân phối các chất đối chiếu gốc này.
3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu
- Tính chất: các alcaloid là bột kết tinh màu trắng, các flavonoid là
bột kết tinh màu vàng.
- Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV-Phụ lục 6.7.
- Định tính: bằng các phương pháp phổ nghiệm
Phổ UV-Vis: mẫu được hòa tan trong methanol, nồng độ 10
µg/ml. Quyét phổ trong khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm.
Phổ MS: xác định pic cơ bản (m/z).
Phổ IR: dập viên KBr. Xác định các dao động đặc trưng.
Phổ NMR: xác định độ dịch chuyển của proton và carbon.
Dữ liệu phổ của CĐC criamidin:
14
- UV/methanol: λ
max
(nm) 212 và 286.
- IR (KBr): υ
max

(cm
-1
) 3200 (-OH); 1616 (C=C); 1046 (-
OCH
2
O-).
- ESI-MS (+): m/z = 318,46 [M+H]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
17
H
19
NO
5
.
-
1
H-NMR (500 MHz, CDC1
3
): δ
H
(ppm) 1,59 (2H; m; H-
4); 2,02 (1H; m; H-11); 2,39 (1H; dt; J=6; 11,5 Hz; H-
11*); 2,79 (1H; m; H-12); 3,17 (1H; m; H-4a); 3,17 (1H;
m; H-12*); 3,27 (1H; t; J = 2,5 Hz; H-2); 3,70 (1H; d; J =
17,5 Hz; H-6β); 3,76 (1H; d; J = 3 Hz; H-1); 3,97 (3H; s;
H-14); 4,18 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6α); 4,47 (1H; d; J =
2,5 Hz; H-3); 5,87 (2H; dd; J = 6,5; 1,5 Hz; H-13); 6,63
(1H; s; H-10).

-
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ
C
(ppm) 29,7 (C-4); 39,1
(C-11); 41,7 (C-10b); 52,6 (C-12); 53,8 (C-1); 56,5 (C-2);
58,5 (C-6); 59,1 (C-14); 61,0 (C-4a); 65,2 (C-3); 96,5 (C-
10); 100,7 (C-13); 117,5 (C-6a); 133,4 (C-8); 138,7 (C-
10a); 141,1 (C-7); 148,2 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC 6-hydroxycriamidin:
- UV/methanol: λ
max
(nm) 212 và 286.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 3508 (-OH); 1616 (C=C); 1286 (-
OCH
3
); 1037 (-OCH
2
O-).
- ESI-MS (+): m/z = 334,38 [M+H]
+
]
+
, M phù hợp với

công thức nguyên C
17
H
19
NO
6
.
15
-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
+MeOD): δ
H
(ppm) 1,52 (1H;
m; H-4β); 1,60 (1H; m; H-4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35
(1H; m; H-11*); 2,70 (1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H-12*);
3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H; dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a);
3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s; H-14);
4,43(1H; d; J = 2 Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d;
J = 1 Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10).
-
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
+MeOD): δ
C
(ppm) 28,7 (C-
4); 35,5 (C-11); 42,1 (C-10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1);
54,6 (C-4a); 56,4 (C-2); 59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-

6); 96,7 (C-10); 101,2 (C-13); 119,3 (C-6a); 134,4 (C-8);
139,2 (C-10a); 142,9 (C-7); 149,8 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC lycorin:
- UV/methanol: λ
max
(nm) 238 và 288.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 3333 (-OH); 1500 (C=C); 1018 (-
OCH
2
O-).
- ESI-MS (+): m/z = 288,44 [M+H]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
16
H
17
NO
4
.
-
1
H-NMR (500 MHz, DMSO): δ
H
(ppm) 2,20 (1H; m; H-
12); 2,44-2,50 (2H; m; H-11); 2,49 (1H; overlapped; H-

10b); 2,60 (1H; d; J =10,5 Hz; H-4a); 3,19 (1H; m; H-
12*); 3,32 (1H; d; J = 14,5 Hz; H-6β); 3,97 (1H; br s; H-
2); 4,01 (1H; d; J = 14 Hz; H-6α); 4,27 (1H; brs; H-1);
4,78 (1H; d; J = 4 Hz; 1-OH); 4,89 (1H; d; J = 6,5 Hz; 2-
OH); 5,36 (1H; brt; H-3); 5,94-5,95 (2H; 2d; J = 0,5; 1 Hz;
H-12); 6,67 (1H; s; H-7); 6,80 (1H; s; H-10).
16
-
13
C-NMR (125 MHz): δ
C
(ppm) 28,1 (C-11); 40,2 (C-
10b); 53,3 (C-12); 56,7 (C-6); 60,8 (C-4a); 70,2 (C-1);
71,7 (C-2); 100,5 (H-12); 105,0 (C-10); 106,9 (C-7); 118,4
(C-3); 129,6 (C-6a); 129,7 (C-10a); 141,7 (C-4); 145,2 (C-
8); 145,6 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC hippadin:
- UV/methanol: λ
max
(nm) 247; 297 và 349.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 1675 (C=O); 1620 (C=C); 1036 (C-
O).
- ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C

16
H
9
NO
3
.
-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ
H
(ppm) 6,16 (2H; s; H-
12); 6,90 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-4); 7,47 (1H; t; J = 8 Hz;
H-2); 7,64 (1H; s; H-11); 7,74 (1H; d; J = 8 Hz; H-3); 7,91
(1H; d; J = 8 Hz; H-1); 7,97 (1H; s; H-8); 8,04 (1H; d; J =
3,5 Hz; H-5).
-
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ
C
(ppm) 101,7 (C-11);
102,3 (C-12); 108,4 (C-8); 110,8 (C-4); 116,7 (C-11a);
118,4 (C-1); 122,6 (C-3); 122,6 (C-11b); 123,5 (C-5);
124,0 (C-2); 128,4 (C-3a); 131,0 (C-11c); 131,7 (C-7a);
148,6 (C-10); 152,6 (C-9); 158,2 (C-7).
Dữ liệu phổ của CĐC astragalin:
- UV/methanol: λ

max
(nm) 265 và 347.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 3284 (OH); 1654 (C=O); 1068 (C-
O).
17
- ESI-MS (+): m/z = 471,31 [M+Na]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
21
H
20
O
11
.
-
1
H-NMR (500 MHz, DMSO): δ
H
(ppm) 3,08 (2H; br s;
H-3” và H-4”); 3,18 (1H; m; H-2”); 3,21 (1H; m; H-5”);
3,32 (1H; m, H-6”a); 3,56 (1H; dd; J = 11,5; 5 Hz, H-6”b);
5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,21 (1H; d; J = 2 Hz, H-
8); 6,43 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,88 (2H; d; J = 9 Hz, H-
3’, H-5’); 8,04 (2H; d; J = 9 Hz, H-2’, H-6’); 10,19 (1H; s;
4’-OH); 10,87 (1H; s; 7-OH); 12,62 (1H; s; 5-OH).

-
13
C-NMR (125 MHz, DMSO): δ
C
(ppm) của phần đường
60,8 (C-6”); 69,9 (C-4”); 74,2 (C-2”); 76,4 (C-5”); 77,5
(C-3”); 100,9 (C-1”); phần aglycon 93,63 (C-8); 98,7 (C-
6); 104,0 (C-10); 115,1 (C-3’ và 5’); 120,9 (C-1’); 130,9
(C-2’ và 6’); 133,2 (C-3); 156,3 (C-5); 156,4 (C-2); 159,9
(C-4’); 161,2 (C-9); 164,10 (C-7); 177,46 (C-4).
Dữ liệu phổ của CĐC isoquercitrin:
- UV/methanol: λ
max
(nm) 255 và 354.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 3219 (OH); 1662 (C=O); 1060 (C-
O).
- ESI-MS (+): m/z = 487,33 [M+Na]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
21
H
20
O
12
.

-
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ
H
(ppm) 3,08 (2H;
overlapped; H-3” và H- 4”); 3,24 (1H; overlapped; H-5”);
3,24 (1H; overlapped; H-2”); 3,32 (1H; overlapped, H-6”);
3,58 (1H; d; J = 11,5 Hz, H-6”); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz,
18
H-1”); 6,20 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,40 (1H; d; J = 2 Hz,
H-8); 6,84 (1H; d; J = 9 Hz; H-5’); 7,57 (1H; overlapped,
H-6’); 7,58 (H; overlapped, H-2’);12,62 (1H; s; 5-OH).
-
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d
6
): phần đường δ
C
(ppm)
61,0 (C-6”); 69,9 (C-4”); 74,1 (C-2”); 76,5 (C-5”); 77,5
(C-3”); 100,9 (C-1”); phần aglycon δ
C
(ppm) (C-5’); 116,2
(C-2’); 121,1 (C-1’); 121,5 (C-6’); 144,8 (C-4’); 148,4 (C-
3’); 93,5 (C-8); 98,6 (C-6); 103,9 (C-10); 115,2; 133,3 (C-
3); 156,2 (C-5); 156,3 (C-2); 161,2 (C-9); 164,1 (C-7);
177,4 (C-4).
- Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực hiện phương pháp HPLC.

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: các quy trình đều đạt yêu cầu.
Kết quả đánh giá độ tinh khiết sắc ký của các CĐC: kết quả được
trình bày ở Bảng 3.2. Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥
95%.
3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá các CĐC:
Các CĐC khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa
học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
3.2.4 Đóng gói và đánh giá đồng nhất:
Đóng gói: các CĐC được đóng trong các lọ thủy tinh nâu trong tủ
đóng ống Glove-box. Các ống CĐC được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8
o
C.
Đánh giá đồng nhất lô: các lọ CĐC đồng nhất trong quá trình gói.
Đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm: độ tinh khiết của các
CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá, các lọ CĐC đồng
nhất.
19
Bảng 3.18 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của CĐC sau khi đóng gói.
TT
Độ tinh khiết sắc ký TB giữa 2 lần phân tích (%)
Crina. 6-OHcri. Hippadin Lycorin Astra. Isoquer.
1 98,69 96,72 99,96 99,99 98,23 98,02
2 98,70 96,75 99,98 99,99 98,27 98,07
3 98,67 96,76 99,98 100,00 98,26 98,11
4 98,72 96,73 99,99 100,00 98,30 98,13
5 98,73 96,74 99,93 100,00 98,30 98,09
6 98,76 96,75 99,95 99,99 98,29 98,10
7 98,70 96,72 99,91 100,00 98,31 98,15
8 98,74 96,76 99,98 100,00 98,25 98,11
9 98,71 96,75 99,93 99,99 98,27 98,15

10 98,69 96,79 99,93 99,99 98,30 98,14
11 98,70 96,81 99,99 100,00 98,26 98,10
TB % 98,71 96,75 99,96 99,99 98,28 98,10
3.2.5 Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố:
Bảng 3.25 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC.
Tên chất khảo
sát
x*% s
*
µ
x
X%
Crinamidin 98,74 0,023 0,007 98,74
6-
hydroxycrinamidi
n
96,75 0,017 0,006
96,74
Hippadin 99,99 0,009 0,003 99,99
Lycorin 99,98 0,020 0,006 99,98
Astragalin 98,28 0,115 0,037 98,25
Isoquercitrin 98,15 0,018 0,005 98,16
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính,
định lượng alcaloid hoặc flavonoid
20
Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-
hydroxycrinamidin (96,75%), 6-hydroxypowellin
(98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin
(98,50%) và 6-hydroxybuphanidrin (98,65%).
Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%),

isoquercitrin (98,15%). Cafein (100,01%) và quercetin
(91,4%) là chuẩn nội của quy trình CE.
3.4.1 Quy trình xử lý mẫu
- Mẫu thử alcaloid: cân 10 g bột lá cho vào cốc, thêm 50 ml cồn
70%, siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2
o
C (x 3 lần). Toàn bộ
dịch chiết được thu hồi dung môi, kiềm hóa bằng amoniac 25% đến
pH 9 – 10. Chiết với 30 ml cloroform (x3 lần). Gộp toàn bộ dịch
cloroform, thu hồi dung môi đến cắn alcaloid AL-SA.
- Mẫu thử flavonoid: cân 10 g bột lá cho vào cốc 250 ml, thêm 50 ml
cồn 70%, siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2
o
C (x 3 lần). Toàn
bộ dịch chiết được thu hồi dung môi, sau đó acid hóa bằng acid
hydrocloric đến pH 3 – 4. Chiết với 30 ml ethyl acetat (x3 lần). Gộp
toàn bộ dịch ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cắn flavonoid FL-SA.
3.4.2 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC
- Các điều kiện sắc ký: cột C
8
Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5
µm), tốc độ dòng: 1 ml/phút, bước sóng phát hiện: 214 nm, thể tích
tiêm: 10 µl, nhiệt độ cột: 40
o
C. Rửa giải theo chương trình dung môi,
pha động là methanol; dung dịch acid H
3
PO
4
pH 3 và 0,2% TEA.

3.4.3 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC
- Điều kiện sắc ký: các điều kiện sắc ký tương tự quy trình định
lượng alcaloid. Rửa giải đẳng dòng, pha động là hỗn hợp dung môi
acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80), bước sóng
265 nm.
21
3.4.4 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE
- Điều kiện điện di: cột mao quản silica nung chảy chiều
dài tổng cộng 64,5 cm; chiều dài hiệu quả 56 cm; đường
kính trong 50 μm. Thể tích tiêm mẫu 50 mbar x 5 giây,
điện thế 25 kV, nhiệt độ cột 25
o
C, sước sóng phát hiện
214 nm. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 25 mM; SDS 50
mM; điều chỉnh pH 9,5 bằng natri hydroxid 1N, phối hợp
để được dung dịch điện di có 10% methanol.
Kỹ thuật điện di MEKC.
3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng CE
- Điều kiện điện di: các điều kiện điện di tương tự quy trình định
lượng alcaloid. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM;
điều chỉnh đến pH 9,0 bằng acid boric, phối hợp với
methanol để được dung dịch điện di nền có 10% methanol.
Kỹ thuật điện di vùng CZE.
Khảo sát tính phù hợp hệ thống: các quy trình đạt yêu cầu.
Thẩm định quy trình phân tích: cả 4 quy trình đều đạt yêu cầu của
tính đặc hiệu; tính tuyến tính (R
2
≥ 0,998); độ chính xác (RSD của
các kết quả định lượng ≤ 5,3%); độ đúng với tỷ lệ phục từ 90 –
107%.

Bảng 3.28 Kết quả định lượng alcaloid trong lá TNHC (n = 6).
Tên alcaloid
Hàm lượng alcaloid trong lá TNHC
(µg/g)
HPLC CE
Crinamidin
µ = 145,3 ± 3,3
(RSD = 2,16%)
µ = 142,7 ± 4,7
(RSD = 4,07%)
6-hydroxycrinamidin µ = 112,1 ± 3,2 µ = 115,4 ± 4,4
22
(RSD = 2,68%) (RSD = 4,76%)
6-hydroxypowellin
µ = 345,9 ± 9,5
(RSD = 2,63%)
µ = 339,7 ± 13,1
(RSD = 4,81%)
6-hydroxybuphanidrin
µ = 421,1 ± 9,9
(RSD = 2,24%)
µ = 420,7 ± 14,8
(RSD = 4,38%)
Undulatin
µ = 77,6 ± 2,6
(RSD = 3,17%)
µ = 75,7 ± 2,36
(RSD = 3,90%)
6-hydroxyundulatin
µ = 286,4 ± 7,1

(RSD = 2,35%)
µ = 285,3 ± 8,5
(RSD = 3,71%)
Bảng 3.31 Kết quả định lượng flavonoid trong lá TNHC (n = 6).
Hàm lượng flavonoid trong lá TNHC (µg/g)
Phương pháp HPLC Phương pháp CE
Astragalin
µ = 266,0 ± 6,2
RSD = 2,21%
µ = 261,9 ± 9,7
RSD = 3,56%
Isoquercitrin
µ = 125,9 ± 2,6
RSD = 1,99%
µ = 126,0 ± 3,1
RSD = 2,32%
3.4.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alcaloid hoặc flavonoid
Mẫu thử: alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA.
Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid
và flavonoid bằng phương pháp HPLC.
Phương pháp DVT – SKLM:
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F
254
; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa
các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng.
Dung môi:
Mẫu thử alcaloid: cloroform – methanol – dd amoniac (5 : 1 :
0,05)
Mẫu thử flavonoid: cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 :
1)

Tiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch
thử và đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng
23
10 cm. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng TT
Dragendorff (alcaloid) hoặc TT FeCl
3
1% (flavonoid).
Phát hiện: đèn UV 254 hoặc 365 nm hoặc TT Dragendorff.
Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có ít nhất 6
vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng.
Phương pháp DVT – HPLC
Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT
alcaloid như Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC như Mục
3.4.3.
Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm
(alcaloid); λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương
đối, % diện tích pic và phổ UV.
- DVT– HPLC flavonoid: mẫu thử có ít nhất 2 pic đặc trưng như sau:
Pic Thời gian lưu (phút)
% diện
tích
Phổ UV-Vis
1
11,5 ± 0,5
(isoquercitrin)
29,5
λ = 254 và 355
(nm)
2 18,5 ± 0,5 (astragalin) 70,5
λ = 265 và 346

(nm)
- DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có ít nhất 6 pic đặc trưng như sau:
Pi
c
Thời gian lưu (phút)
diện
tích
(%)
Phổ UV-Vis
1
9,0 ± 0,5 (6-
hydroxycrinamidin)
21,9
Các pic alcaloid
đều có phổ UV
tương tự:
2 10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin) 17,8
24
λ
max
= 214 nm
vai ở 281 nm
3 13,5 ± 0,5 (crinamidin) 13,7
4
18,0 ± 0,5 (6-
hydroxybuphanidrin)
20,8
5
20,5 ± 0,5 (6-
hydroxyundulatin)

18,3
6 23,5 ± 0,5 (undulatin) 7,6
3.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm cho bột lá TNHC
Một số chỉ tiêu và phương pháp thử để đánh giá chất lượng bột lá
TNHC như sau:
Một số chỉ tiêu của TCKN lá TNHC
Lá đã phơi hoặc sấy khô của cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae).
Mô tả: lá khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc
biệt, dài 50 - 90 cm, rộng khoảng 2 - 5 cm. Vị đắng.
Bột: mùi hăng, vị đắng. Mảnh biểu bì mang lỗ khí có tinh thể calci
oxalat hình kim, tế bào hình đa giác thuôn dài. Mảnh mạch xoắn. Hạt
tinh bột riêng lẻ, dạng hình bầu dục, tễ có hình sao. Cuộn sợi nhiều,
sợi vách dày, khoang hẹp.
Độ ẩm: không quá 12% (DĐVN IV - Phụ lục 9.6).
Tro không tan trong acid HCl: ≤ 2% (DĐVN IV - Phụ lục 9.7).
Tro toàn phần: không quá 15% (DĐVN IV - Phụ lục 9.8).
Định tính: định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid và flavonoid. Có
thể thực hiện theo một trong hai phương pháp sau:
25
A. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: các bước tiến hành và
phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.
B. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến
hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.
Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và
flavonoid.
Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Định lượng alcaloid:
Pha động: Dung môi A: methanol

Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2%
TEA.
Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin
trong pha động để có dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 150
µg/ml và 100 µg/ml.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có
mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở
nhiệt độ 50 ± 2
o
C (x 3 lần. Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để
nguội, kiềm hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch amoniac 25% (TT)
đến pH 9 – 10. Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy alcaloid bằng
cách lắc hỗn hợp trong bình lắng với 30 ml cloroform (TT) (x 3 lần).
Cô dịch chiết cloroform đến cạn dung môi, thu được cắn alcaloid.
Hòa tan phần cắn này trong bình định mức 10 ml với dung hỗn hợp
dung môi A và B (25 : 75), thêm dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc qua
màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm)
được nhồi pha tĩnh C8 (5 µm).
Detector: PDA, bước sóng 214 nm.
Rửa giải gradient.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.