CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ pps

CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
•
Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật
đích
•
Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND
TTH
•
Chuyển AND TTH vào tế bào chủ
•
Chọn lọc các tế bào mang AND TTH
•
Sản xuất, tinh sạch protein

Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp
•
Endonuclease giới hạn (RE)
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
•
Vector plasmid
•
Vector thực khuẩn thể
lambda
•
Cosmid
•
BAC
•
YAC

Vector nhân dòng
1. Vector plasmid
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

Biểu hiện gen ở các promoter mạnh và có thể
điều chỉnh
o
Promoter mạnh
•
Có ái lực cao với ARN – pol

vùng nằm ngay sau nó được phiên
mã thường xuyên
•
Tối ưu hóa sự biểu hiện của gen nhân dòng
•
Khó khăn:

Kiệt quệ năng lượng của tế bào chủ

suy yếu các chức năng cần thiết
o
Promoter có thể điều chỉnh
•
Chỉ biểu hiện gen nhân dòng trong giai đoạn sinh trưởng đặc biệt
của tế bào chủ
•
Chỉ biểu hiện trong một thời gian xác định

Một số promoter phổ biến

o
Promoter lac
o
Promoter trp
o
Promoter tac
o
Promoter trc
o
Promoter pL
o
Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o
Promoter lac
Nồng
độ
glucose
Nồng
độ
lactose
Nồng
độ
AMPv
Vùng promoter – operator lac Mức độ
phiên
mã
Thấp Thấp cao Thấp
cao Thấp Thấp Thấp

cao cao Thấp Thấp
Thấp cao cao cao
genoperator
promoter
genoperator
promoter
genoperatorpromoter
genoperatorpromoter
CAP
AMPv
Thể ức
chế lac
Thể ức
chế lac
CAP
AMPv
o
Promoter trp
•
Điều hòa âm: nồng độ trp tăng

đóng promoter

ức
chế phiên mã
•
Hiện tượng “rò rỉ”: phiên mã vẫn diễn ra ngay cả khi
gen đã đóng lại
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o

Promoter tac và trc:
•
Chứa vùng -35 của promoter trp và vùng -10 của
promoter lac
•
khác nhau một cặp base duy nhất:

Promoter tac: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 16 base

Promoter trc: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 17 base
•
Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường
•
Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o
Promoter Pl
•
Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực
khuẩn thể lambda
•
Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:

ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục

liên kết
với operator của promoter Pl

ngăn cản dịch mã tổng
hợp protein đích


ở 42oC, thể ức chế bị bất hoạt

promoter hoạt động


protein đích
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o
Promoter gen 10 của thực khuẩn thể T7
•
Gen T7 ARN – pol – kiểm soát phiên mã của gen đích -
được chèn vào NST của E.coli trên một thể tiềm tan của
thực khuẩn thể lambda dưới sự kiểm soát của promoter
lac của E. coli
•
Khi không có lactose hoặc IPTG, thể ức chế lac được
tổng hợp, ức chế o – lac và p – lac

ức chế tổng hợp T7
ARN – pol

gen đích không được phiên mã
•
Khi có lactose hoặc IPTG

liên kết với thể ức chế lac


ngăn cản sự ức chế phiên mã T7 ARN – pol


gen đích
được phiên mã
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
PROTEIN DUNG HỢP

Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào
chủ

bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế
bào chủ

Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau

Sự có mặt của protein chủ

protein dung hợp không thích
hợp cho ứng dụng lâm sàng

Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của
protein đích

Cắt protein dung hợp:
•
Nối gen protein đích và protein chủ bằng một đoạn
oligonucleitide mã hóa cho các aa được nhận biết bởi
protease không phải của vi khuẩn
PROTEIN DUNG HỢP
ứng dụng của protein dung hợp
o

Sử dụng làm kháng
nguyên, kháng thể
o
Được dùng để đơn giản
hóa quá quá trình tinh
sạch protein
Protein dung hợp và vấn đề cuộn gập
protein
•
Một số protein không tan

thể
vùi không có hoạt tính sinh học
•
Khắc phục: tạo protein dung hợp
•
Protein dung hợp protein đích –
thioredoxin – được tổng hợp và
tích tụ ở vùng nhạy thẩm thấu

tiết vào môi trường nuôi cấy
dạng hòa tan

tinh sạch bằng ủ ở nhiệt độ cao –
nhờ tính bền nhiệt (80oC của
thioredoxin)
Xếp liên tiếp các gen theo một hướng

VẤN ĐỀ:
o

Để tăng lượng protein gen nhân dòng


tăng số bản sao plasmid

Cạn kiệt nguồn năng lượng tế bào

KHẮC PHỤC:
o
Sắp xếp liên tiếp các trình tự của gen theo
hướng có thể phiên mã và dịch mã
o
Yêu cầu trình tự nucleotide:
•
hai đầu 5’ kéo dài của mỗi đoạn gen có 3
nucleotide khác nhau, mỗi đầu chỉ bổ
sung cho một đầu kéo dài khác trên một
gen khác
•
Các đầu 5’ kéo dài bổ sung cho đầu 5’ của
một vector
•
Các đầu kéo dài ba nu được tạo thành
nhờ PCR với các cặp mồi có một vùng
nhận biết của RE ở đầu 5’
CCG
ATT
TAA
AGT
TCA

CCC
CCG
ATT
TAA
AGT
TCA
CCC
CCG
ATT
TAA
AGT
TCA
GGC
CCC
GGG
Plasmid
Các vector biểu hiện dịch mã
•
Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu
khởi động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN
(Ribosome Binding Site – RBS)
•
RBS: trình tự 6 – 8 nu bắt cặp bổ sung với trình tự nu trên ARN
ribosome
•
RBS phải đặt trước codon khởi đầu dịch mã của gen nhân dòng một
khoảng xác định

Codon khởi đầu dịch mã:


ở mức độ ARN: bộ ba AUG

ở mức độ ADN: bộ ba ATG
•
RBS và một vài codon đầu tiên của gen quan tâm không chứa các
trình tự gây cuộn xoắn nội phân tử sau phiên mã làm cản trở tương
tác RBS – ribosome
Cơ sở phân tử
•
Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin
•
Promoter tac
•
Vị trí đa điểm tách dòng: NotI, PstI, HindIII
•
Vùng liên kết ribosome lacZ
•
Codon khởi đầu ATG cách RBS 8 nu theo chiều xuôi
•
Các yếu tố kết thúc phiên mã T1, T2 từ thực khuẩn thể
lambda.
Các vector biểu hiện dịch mã
Vector biểu hiện pKK233 - 2
•
Gen nhân dòng có các codon hiếm được sử dụng trong tế
bào chủ - hiện tượng không tương hợp tế bào

tế bào
chủ không tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon
hiếm


giảm hiệu suất tổng hợp protein.
•

khắc phục:

Nếu gen đích là của sinh vật nhân chuẩn

nhân dòng và biểu hiện
trong hệ thống tế bào nhân chuẩn

Tổng hợp hóa học một phiên bản mới của gen đích chứa các codon
được tế bào sử dụng thường xuyên hơn – dựa vào tính thoái hóa của
mã di truyền

Cải biến tế bào chủ để biểu hiện vượt mức
Các vector biểu hiện dịch mã
Vấn đề
Làm tăng độ bền protein

Chu kỳ bán hủy của các protein khác nhau dao động từ vài phút đến vài
giờ

Cở sở của độ bền khác nhau:
o
Phạm vi hình thành cầu disulfua

ở E.coli và các G-, cầu disulfua được hình thành ở khoang chu chất

Đòi hỏi sự tham gia của 2 enzyme chu chất hòa tan (DsbA, C) và hai

enzyme màng (Dsb B,D)

Các protein ngoại lai chứa từ 3 cầu disulfua trở lên thường cuộn gập
không chính xác và tạo các thể vùi

khắc phục:

Đồng biểu hiện với enzyme hỗ trợ cuộn gập (ví dụ: disulfua isomerase)

Đồng biểu hiện với sự biểu hiện vượt mức của enzyme chu chất hòa tan
tạo liên kết disulfua (DsbC)
o
Sự có mặt của aa ở đầu N

bền với sự phân hủy của protease
o
Trình tự nhạy với protease:
•
Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T)
•
Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine,
arginine)

tín hiệu phân hủy cho protease

Thay đổi vùng PEST

tăng độ bền protein
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Vấn đề

•
Số lượng bản sao plasmid
cao

gánh nặng trao đổi
chất cho tế bào chủ


hiện tượng mất plasmid
trong quá trình sinh
trưởng

giảm hiệu suất
sản phẩm gen nhân dòng
Khắc phục

Hai phương pháp chủ yếu:
1. Nuôi tế bào trong môi trường
có kháng sinh hoặc chất đồng
hóa bắt buộc

chọn lọc tế bào
mang plasmid có khả năng
kháng kháng sinh

giá thành
cao
2. Đưa ADN nhân dòng trực tiếp
vào ADN nhiễm sắc thể


một
phần của tế bào chủ

tồn tại
bền qua nhiều thế hệ không
cần hóa chất chọn lọc
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
•
Vị trí cài nhập là vị trí không
mang gen cần thiết của NST
•
Được kiểm soát bởi một promoter
có thể điều khiển
•
AND đích phải có độ tương đồng
trình tự nhất định (ít nhất là
50nu) với ADN NST

trao đổi
vật lý (tái tổ hợp) giữa hai phân
tử AND

Quy trình cài nhập:
1. Nhận dạng vị trí cài nhập
2. Phân lập và nhân dòng một phần
hoặc tất cả vùng cài nhập NST
3. Gắn nối gen nhân dòng và một
promoter có thể điều khiển vào
đúng hoặc lân cận vị trí cài nhập
4. Chuyển bản thiết kế đoạn cài

nhập NST – gen nhân dòng vào tế
bào chủ như một phần plasmid mà
không sao chép trong tế bào chủ -
cần thiết để xảy ra trao đổi chéo
xúc tác bởi enzyme tế bào chủ
5. Chọn lọc và duy trì các tế bào có
biểu hiện gen nhân dòng
Phương pháp cài nhập AND vào nhiễm sắc thể

Việc cài nhập AND đích vào
NST có thể thực hiện nhờ trao
đổi chéo

Trao đổi chéo kép

ưu điểm:
chỉ mình gen nhân dòng được
cài nhập vào NST, chỉ áp dụng
khi nhận dạng được một vị trí
không cần thiết trên NST

Trao đổi chéo đơn: khi trên
NST không có một vị trí không
cần thiết nào

cài nhập toàn
bộ plasmid ngoại lai

cài
nhập cả gen đánh dấu chọn

lọc

hiệu quả không mong
muốn

loại bỏ gen đánh dấu
chọn lọc

Loại bỏ gen đánh dấu chọn lọc:
o
Thiết kế gen đánh dấu chọn lọc
chặn hai đầu bởi trình tự AND
đặc hiệu được nhận biết cắt
bởi enzyme đặc hiệu khi bổ
sung chất cảm ứng vào môi
trường
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Sự tiết protein ở E.coli
•
Sự tiết protein: kết quả sự
đi qua màng tế bào vào
vùng chu chất, hoặc qua
màng ngoài vào môi
trường của protein

Tinh sạch protein dễ dàng
hơn

Tăng đô bền protein


Peptid tín hiệu:
o
Trình tự aa khu trú ở đầu
N protein
o
Làm tăng khả năng qua
màng của protein
o
Tuy nhiên sự có mặt của
peptid tín hiệu không
đảm bảo chắc chắn sẽ có
tỷ lệ tiết cao
o
E.coli và các G- tiết
protein vào môi trường
nhờ sự có mặt của màng
ngoài

Cách giải quyết:
o
Sử dụng G+ hoặc tế bào nhân chuẩn đều thiếu màng ngoài

tiết
protein trực tiếp vào môi trường
o
Sử dụng cải biến gen

tạo G- tiết protein vào môi trường

Vi khuẩn dạng L:

o
Biến thể của vi khuẩn thông thường
o
Tồn tại ở dạng thiếu thành tế bào – kết quả của đột biến tự phát khi
xử lý các vk nhạy cảm với chất cảm ứng dạng L: penicillin,
lysozyme
o
Hiệu quả: biểu hiên mức độ cao protein ngoại lai + tiết hoàn toàn
protein đích
o
Đặc tính kháng nhiều kháng sinh

không được sử dụng làm dấu
chuẩn kháng ks trong các thí nghiệm nhân dòng

khắc phục: sử
dụng gen đánh dấu không mã hóa cho khả năng kháng ks.
Sự tiết protein ở E.coli
Gánh nặng trao đổi chất
1. Tăng số bản sao và/ hoặc kích thước plasmid

tăng nhu
cầu tế bào cho việc sao chép và duy trì plasmid
2. Giới hạn hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy
3. Biểu hiện cao cả protein đích và protein đánh dấu

làm cạn
kiệt nguồn aminoacyl – tARN, nguồn aa và nguồn năng
lượng của tế bào chủ
4. Sự biểu hiện vượt mức protein ngoại lai


vận chuyển vào
khoang chu chất

tắc nghẽn vùng tiết xuất

ngăn cản sự
định vị đúng protein tế bào chủ cần thiết
5. Một số tế bào chủ vốn có đặc tính trao đổi chất bất
thường

dễ bị ảnh hưởng bởi trạng thái gánh nặng trao đổi
chất
6. Protein ngoại lai xen vào chức năng tế bào chủ

tạo ra sản
phẩm độc hại đối với tế bào chủ
Nguyên nhân gánh nặng trao đổi chất
1. Giảm tốc độ sinh trưởng của tế bào sau khi đưa AND
ngoại lai vào
2. Mất plasmid tái tổ hợp
3. Thay đổi hình dạng kích thước tế bào chủ
4. Tăng hàm lượng polysaccharide ngoại bào do vi khuẩn
chủ tổng hợp

gây kết dính tế bào

khó khăn cho
việc thu nhận tinh sạch protein
Gánh nặng trao đổi chất

Hệ quả của gánh nặng trao đổi chất