Công nghệ sinh học ( phần 1 ) ppsx

Công nghệ sinh học ( phần 1 )
microRNA kiểm soát chức năng của các tế bào gốc máu
Tế bào gốc tạo máu cung cấp cho cơ thể nguồn tế bào máu ổn định, bao
gồm hồng cầu – tế bào vận chuyển oxy và bạch cầu – tế bào tạo nên hệ
thống miễn dịch. Tế bào gốc tạo máu (tế bào Hematopoitic) có thể tự tạo
nhiều bản sao để chắc chắn rằng nó có đủ số lượng để cung cấp máu
trong suốt một đời người.

Điều này đòi hỏi nó phải đạt được sự cân bằng tinh tế giữa việc tự tái tạo
và việc phát triển thành những dòng tế bào máu khác nhau. Sự mất cân
bằng sẽ dẫn đến một số bệnh như bệnh bạch cầu (Leukemia) và bệnh
thiếu máu (Anemia).
Một yếu tố quan trọng để chống lại các căn bệnh liên quan đến rối loạn tế
bào gốc máu là gia tăng sự hiểu biết về các gene và phân tử kiểm soát
hoạt động của các tế bào gốc máu. Các nhà sinh học thuộc Viện Kỹ thuật
California (Caltech, Mỹ) đã đạt được một bước tiến lớn trong quá trình
nghiên cứu. Họ đã tìm ra một nhóm mới các phân tử có nồng độ cao
trong tế bào gốc máu và nó có tác dụng điều tiết sử sản xuất tế bào gốc
máu.
David Baltimore, Giáo sư Sinh học Robert Andrews Millikan, người nhận
giải Nobel năm 1975 Sinh lý và Y khoa, nghiên cứu chính của đề tài
nói “khi những đoạn nhỏ bé của RNA (còn được gọi là microRNA hay
miRNA) được kích thích biểu hiện ở nồng độ cao trong tế bào gốc máu
của chuột thí nghiệm, các miRNA sẽ cản trở hoặc thú đẩy chức năng của
những tế bào này”.
Bài báo về nghiên cứu này đã được công bố vào ngày 26/6/2010 trên
phiên bản trực tuyến của Kỷ yếu của Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia
(The Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)).
Ngạc nhiên hơn nữa, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy một phần của
miRNA, gọi là miR-125b, có một vai trò nổi bật. Khi nồng độ miR-125b
hơi cao, nó sẽ đẩy mạnh việc sản xuất các tế bào máu trưởng thành từ các

tế bào gốc máu tốt hơn nhiều so với các loại miRNA khác. “Nhưng khi
mức biểu hiện của nó được đẩy lên mức cao hơn, nó sẽ nhanh chóng dẫn
đến ung thư trong vòng 6 tháng”, Baltimore nói. Cơ chế chính xác của
việc chuyển đổi công dụng này hiện nay vẫn chưa được làm rõ, nó được
cho là có khả năng liên quan đến sự ức chế của miR-125b đến những
gene đặc biệt đàn áp sự phát triển của khối u.
“Chúng tôi ngạc nhiên khi thấy rằng ở nồng độ cao, miR-125b gây ra
bệnh máu trắng cấp tính ở chuột” Aadel Chaudhuri, cử nhân thuộc
Caltech, đồng tác giả của bài báo, nói. Bệnh máu trắng là bệnh mà các tế
bào máu bình thường (bao gồm hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu) được thay
thế bởi các tế bào bạch cầu bất thường phát triển liện tục không thể kiểm
soát được, cuối cùng dẫn đến tử vong nếu không được điều trị.
“Những nghiên cứu này được tiến hành trên chuột nhưng chúng tôi đã
phân tích trên tế bào gốc máu của người và đã đã tìm thấy các miRNA
với hàm lượng cao tương tự như trong chuột” theo Ryan O'Connell -
người đang làm postdoc ở Caltech và là tác giả chính của bài báo đăng
trên PNAS.
Thêm vào đó, các nhà nghiên cứu đã tìm ra rằng sự biểu hiện của phân tử
miRNA quan trọng đó tăng khả năng cấy ghép tế bào gốc máu của người
khi nó đươc chuyển vào trong chuột. “Điều này chứng tỏ rằng sự biểu
hiện và chức năng của các miRNA này được bảo tồn trong suốt quá trình
tiến hóa” O’Connell nói.
Aadel Chaudhuri nói “Điều này có nghĩa là hoàn toàn khả thi khi các
bệnh về bạch cầu ở con người có thể được chữa trị bằng cách sử dụng các
microRNA trong tế bào gốc mới được xác định này”
“Các khám phá này khi kết hợp với báo cáo tương tự của bác sĩ David
Scadden thuộc Bệnh viện Đa khoa Massachusetts và Viện Tế bào gốc
Harvard cho thấy rằng các miRNA là những phân tử quan trọng kiểm soát
chức năng của tế bào gốc máu” Aadel Chaudhuri nói “Những sự quan sát
này có sự liên kết chặc chẽ giữ chẩn đoán và điều trị ung thư và bệnh

thiếu máu – căn bệnh do sự khiếm khuyết của tế bào gốc máu. Việc cấy
ghép tế bào gốc máu đã trở thành phương pháp phổ biến trong điều trị
ung thư, bệnh tự miễn dịch và thậm chí cả một số loại bệnh truyền nhiễm.
Việc sử dụng các mức độ biểu hiện của miRNA trong tế bào gốc máu
thông qua liệu pháp điều trị mục tiêu có thể được dùng để chứng minh
thêm hiệu quả của cách tiếp cận này”
“Hai nghiên cứu bổ sung cung cấp thêm bằng chứng rằng các miRNA là
bộ phận điều khiển then chốt trong việc kiểm soát tỷ lệ các loại tế bào
máu được tạo từ tủy xương của chuột và con người.” Baltimore nói.
“Trong công việc này, chúng tôi đã chứng minh cơ chế này là có thật
trong các tế bào gốc. Trong khi những nghiên cứu trước đó của chúng tôi
và các nhà khoa học khác đã cho thấy mức độ của miRNA xác định nồng
độ của các loại tế bào máu trưởng thành. Tuy nhiên liệu pháp miRNA
mục tiêu (The targeting miRNAs therapy) vẫn là một thách thức lớn cho
ngành Công nghệ sinh học”.
Ngoài Baltimore, O'Connell và Chaudhuri, bài báo “MicroRNAs gia tăng
trong quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu điều tiết dài hạn việc sản xuất
các tế bào gốc tạo máu” (MicroRNAs enriched in hematopoietic stem
cells differentially regulate long-term hematopoietic output) còn có các
đồng tác giả như Dinesh Rao, nhà khoa học trước đây làm việc tại
Caltech và hiện nay thuộc Trường Y khoa David Geffen tại UCLA,
William S. Gibson – Kỹ thuật viên của Caltech và Alejandro B. Balazs –
nghiên cứu sinh hậu tiến sĩ của Caltech. Công việc nghiên cứu được tài
trợ bởi Viện nghiên cứu Ung thư, Viện Tim, Phổi và Máu Quốc gia; Quỹ
khoa học Quốc gia và Viện Ung thư Quốc gia.
Tinh sạch protein
I. Giới thiệu chung
Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có
thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các
protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa

của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực
hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết
được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua
dữ liệu chiếu xạ tia X.
II. Nhận biết protein mục tiêu
Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân
tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này
chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi
cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để
xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực
hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục
tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính
của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một
enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như
tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản
ứng của nó trong tế bào
Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của
Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh
sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác
định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra
một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách
thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy
nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần
một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện
nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ
protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ
protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính
enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng
càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục
tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng.

III. Ly trích protein từ tế bào
Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta
cần phân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào
chứa nhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát
triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng
tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly
tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng
lượng cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần
nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được
gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ
trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác
nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông
thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ
thuật tinh sạch hiệu quả.
IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện
tích, và liên kết ái lực
Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những
đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực.
Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách,
mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một
protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính
và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein
tinh sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không
gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là
một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch
thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký.
IV.1. Tủa bằng muối
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng
này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một
nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được

dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối
ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới
kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch
protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch
trước. Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách
IV.2. Sự thẩm tách
Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán
dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức
không gian nhất định lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi
thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các
lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những
phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại
protein với nhau.
IV.3 Sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học
phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có
thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó,
tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như
nguyên liệu cho pha cố định và pha di động.
Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất
là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion
chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion
exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với
một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa
vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất
(high pressure liquid chromagraphy).
IV.3.1 Sắc ký lọc gel
Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước
phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ

polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose
(những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và
Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ
với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả
bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể
ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ
chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có
thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn
những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra
sau cùng.
IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang
một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của
chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein.
Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương
pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những
hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với
chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose
(CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ
tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt
mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-
cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang
điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột
trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những
protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân
tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao
đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch
tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích
dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra
ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion

Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch
đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với
hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein
IV.3.3 Sắc ký ái lực
Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong
việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein
với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại
protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân
tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì
nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không.
Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch
glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với
Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.

Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố
phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn
đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những
trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực
cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ
này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có
hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng
thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn
có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay

những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn
hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein
không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung
dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết.
Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa
protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao.
IV.3. Sắc ký lỏng cao áp

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột
có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu
tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương
tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được
làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có
được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và
phân tách nhanh.