Giáo trình Vi sinh vật học part 6 docx

158
những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc
thậm chí cả máu nữa.
Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên
men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể
tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin
hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các
pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số
vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng.
Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có
thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên
những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất
đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả
năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng
lactose.
Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli)
cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật
có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với
sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích
nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú.
Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose
nó phải được phân cắt :

Lactose + H
2
O D-glucose + D-galactose
β- Galactozidase
Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành
glucosephosphate.
Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng

cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một
môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự
tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc.
Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản
xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng
như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một
lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường
thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân
lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc.



159
2. Lên men lactic đồng hình
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như
toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các
enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình
loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat :


Glucose

2 NADH





Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên
hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự

có mặt của một lactat-racemase.
Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành
acetate, ethanol, CO
2
và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ
thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi.
3. Lên men lactic dị hình
Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con
đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải
glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua
glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình).
Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và
nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc
taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và
acetilphosphate.
Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được
rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO
2
theo một tỉ lệ
gần như tương đương:
C
6
H
12
O
6
→ CH
3
- CHOH - COOH + CH
3

- CH
2
- OH + CO
2
ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit
thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc
2 Lactat

2 Piruvat
2 NAD


160
toàn bộ acetilphosphate thành acetate, trong đó liên kết phosphate giàu
năng lượng được chuyển sang ADP và được sử dụng dưới dạng ATP.
Dihydro thừa trong trường hợp này được truyền cho glucose làm
xuất hiện manit. Glyceraldehyt-3-phosphate được chuyển qua piruvat
thành lactat. Ribose được L. mesenteroides lên men thành lactat và
acetate.
*Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium
Vi khuẩn lactic dị hình Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay
chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành
viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh, trước hết là các trẻ nuôi bằng
sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ có trong sữa người mà
không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi Bifidobacterium là những vi
khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần một khí quyển chứa CO
2

(10% CO
2

) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa glucose theo
phương trình :
2 C
6
H
12
O
6
→ 2 CH
3
- CHOH - COOH + 3 CH
3
- COOH
Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ
phosphoketolase, không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-
dehydrogenase, song lại chứa các phosphoketolase hoạt động, phân giải
fructose-6-phosphat và xilulose-6-phosphat thành acetilphosphate và
eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyt-3-phosphate. Hexose được chuyển
hóa theo con đường sau đây :

161


















Hình 6.4: Lên men lactic dị hình
:1. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
2. Phosphogluconat-dedihydrogenase
3. Epimerase ; 4. Phosphoketolase

4. ứng dụng của lên men lactic
Nếu để dung dịch đường không khử trùng chứa cả các nguồn nitơ
phức tạp và các chất sinh trưởng một cách tự nhiên trong trong điều kiện
kị khí hoặc dưới dạng lớp cao thì các vi khuẩn lactic sẽ nhanh chóng phát

triển ở phía bên trong. Chúng làm giảm pH xuống dưới 5 và qua đó ức chế
sinh trưởng của các vi khuẩn kị khí khác là bọn không có khả năng sinh
trưởng ở độ chua này. Trong các môi trường làm giàu này nhóm vi khuẩn
nào phát triển được là tuỳ thuộc vào các điều kiện đặc biệt. Nhờ đặc tính
bảo quản và khử trùng dựa trên nguyên tắc acid hóa mà các vi khuẩn lactic


162
được sử dụng, trong nông nghiệp, trong nội trợ, trong ngành sản xuất và
chế biến sữa.
4.1.Thức ăn ủ chua.
Vi khuẩn lactic phân bố trên các nguyên liệu thực vật giữ một vai
trò to lớn trong việc bảo quản thức ăn gia súc. Để tạo điều kiện cho lên
men lactic xảy ra, lá các loại cây lấy củ hoặc cỏ được nén chặt trong các
hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ C/N và tạo độ chua ban đầu bằng
cách thêm acid formic hay acid vô cơ.
4.2.Dưa là một sản phẩm của quá trình lên men lactic. Bắp cải được cắt
nhỏ, trộn và bóp với muối ăn 2-3%. Trong điều kiện yếm khí, lên men
lactic sẽ xảy ra một cách tự nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc - với sự tạo
thành CO
2
, và về sau có sự tham gia của Lactobacillus plantarum.
4.3.Các sản phẩm sữa. Sữa có một thành phần dinh dưỡng cao, chứa
nhiều nước và giàu các muối khoáng, protein (chủ yếu là cazein), mỡ bơ,
đường (đặc biệt là lactose) và các vitamin. Ở trong bầu vú của động vật thì
nó là vô trùng, nhưng khi đi ra khỏi núm vú thì sữa bị nhiễm bởi khu hệ
bình thường của động vật, sau đó được bổ sung thêm bởi các vi sinh vật
khác từ người vắt sữa, máy hoặc bình chứa.
Là một môi trường gần như hoàn hảo nên sữa rất mẫn cảm với sự sinh
trưởng của vi sinh vật. Khi để sữa ở trong phòng nhiều loại vi khuẩn sẽ lên

men lactose tạo thành acid và làm thay đổi tính chất và kiến trúc của sữa.
Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên hoặc được con người bắt chước như
trong qnầ trình sản xuất phomat hoặc iagua.
Trong các giai đoạn sớm của lên men sữa lactose bị tấn công
nhanh bởi Streptococcus lactis và Lactobacillus spp. Sự tiết acid lactic và
sự giảm pH làm protein của sữa bị đông lại thành cục vón (curd). Sự đông
cũng làm tách riêng phần dịch đường sữa (whey) ở trên bề mặt. Cục vón
cũng có thể được tạo nên nhờ tác dụng của vi sinh vật hoặc nhờ một
enzyme (rennin) lấy từ dạ dày bê.
Một lít sữa nặng 1032g bao gồm 902g nước và 130g chất khô
trong đó chứa 49g lactose; 39g chất béo (là những giọt mỡ đường kính 1-8
μm gồm glixerit và các chất tan trong lipit, như colesterol và các vitamin
A, D, E, K; 32,7g protein mà chủ yếu là cazein; 9g chất khoáng (gồm
phosphate, xitrat, KCl, NaCl và MgCl
2
).
*Sữa chua (sữa bơ). Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng
bằng sự để chua ngẫu nhiên dưới tác động của nhiều vi khuẩn sinh acid


163
lactic khác nhau (như Streptococcus lactis hay S. cremoris), hoặc của một
số lượng ít hơn nhiều các vi khuẩn gây thơm (như Streptococcus
diacetylacis, Betacoccus citrovorus) hoặc bằng việc cấy vào sữa đã đun
nóng các giống vi khuẩn thuần khiết. Khi lên men diễn ra, lactose được
chuyển hoá thành acid lactic, acid này sẽ ngưng kết cazein ở pH 4-5. Sữa
đông, đặc, có vị chua, tùy theo vùng có tên gọi khác nhau. Sữa chua được
làm từ sữa đầy đủ (chứa ít nhất 3% mỡ của sữa) thường được trộn với bột
sữa đã vớt váng nhằm làm tăng hàm lượng chất rắn toàn phần và cải thiện
cấu trúc gel protein. ở một số nước, sữa chua cũng được sản xuất từ sữa

cừu, sữa trâu, sữa tuần lộc hoặc sữa ngựa. Kem chua được sản xuất bởi
một quá trình rất giống quy trình dùng để sản xuất sữa chua chỉ trừ việc
kem cà phê đã được sử dụng làm nguyên liệu thô.
*Iagua. Iagua được làm từ các loại sữa chứa các hàm lượng mỡ khác
nhau bằng cách lên men nhờ các giống đặc biệt. Nó có một độ đông đặc
mịn giống như gel, một độ chua rõ rệt và hương vị dễ chịu, khác biệt rõ
ràng với loại sữa chua bình thường. Iagua được sản xuất bằng cách cấy
vào sữa đã khử trùng Pasteur đồng nhất khoảng 1,5-3% các vi khuẩn lactic
ưa nhiệt (giống hỗn hợp của một hoặc nhiều chủng như Streptococcus
thermophilus hay Lactobacillus bulgaricus) và sau đó giữ ở 42-45
o
C trong
khoảng 3 giờ. Độ quánh mịn được hình thành trong thời gian này. Sản
phẩm cuối cùng có vị chua (độ chua 40-60
o
SH). Phần quan trọng trong
hương thơm đặc biệt của iagua là các hợp chất cacbonyl với đixetyl và
acetaldehit chiếm ưu thế. Một loại igua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus
được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilú. Việc thêm đường và hoa quả
vào iagua (iagua hoa quả) làm tăng đáng kể sức tiêu thụ sản phẩm này.
*Kefia và Kumis. Kefia và Kumis là các loại đồ uống chứa rượu
giàu CO
2
, nhiều bọt. Khu hệ vi sinh vật bao gồm nấm men Torula (chịu
trách nhiệm đối với quá trình lên men rượu) và các vi khuẩn Streptococcus
lactis và Lactobacillus caucaticus (chịu trách nhiệm đối với lên men
lactic). Các hạt kefia dùng để sản xuất kefia chứa các cục sữa đông cộng
với các vi khuẩn kefia. Kumis được làm từ sữa ngựa hay sữa dê do các
giống kumis thuần khiết (Thermobacterrium bulgaricus và nấm men
Candida) . Cả hai đồ uống làm từ sữa này đều là các sản phẩm địa phương

của vùng Caucasus và các vùng thảo nguyên Turkestan. Kefia chứa acid
lactic (0,5- 1%), một số lượng rượu đáng kể (0,5-2%), CO
2
và một số sản
phẩm phân giải cazein sinh ra từ hoạt động phân giải protein của nấm
men.
*Phomat. Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại
bỏ dịch đường sữa và bằng cách làm chín cục vón khi có mặt một khu hệ


164
vi sinh vật đặc biệt. Có nhiều loại phomat với hình dạng và kích thước
khác nhau. được xếp thành nhóm dựa vào loại sữa sử dụng (bò, dê, cừu),
sự tạo thành cục vón (dùng acid, dùng rennin hay dùng cả hai), kiến trúc
hay độ đặc, và hàm lượng chất béo. Trong từng nhóm, các loại phomat
riêng biệt được đặc trưng bởi hương thơm. Sự sản xuất phomat về cơ bản
bao gồm hai công đoạn : sự tạo thành cục vón và quá trình làm chín.
*Sự tạo thành cục vón
Hàm lượng chất béo của sữa được điều chỉnh tới mức độ mong
mnốn, và khi cần, hàm lượng protein cũng được điều chỉnh. Các chất phụ
gia bao gồm muối canxi nhằm cải thiện sự ngưng kết protein và kiến trúc
của phomat, nitrat để kìm hãm khu hệ vi khuẩn kị khí hình thành bào tử và
các sắc tố tạo màu. Sữa thô hoặc sữa đã khử trùng được trộn trong một bể
ở nhiệt độ 15-59
o
C với một loại giống khởi động (vi khuẩn lactic hay vi
khuẩn propionic, nấm sợi, như Penicillium camemberti, P. candidum, P.
roqueforti , các vi khuẩn mang sắc tố màu vàng hoặc màu đỏ như
Bacterium linens, cùng các cầu khuẩn và nấm men) và sữa sẽ đông lại
thành một khối bán lỏng mềm, cụcvón, sau lên men lactic, được nối tiếp

bằng sự bổ sung rennin hoặc một tổ hợp nào đó mà thông thường nhất là
tổ hợp giữa acid và rennin. Gel protein này sẽ được cắt thành các hình
khối nhỏ trong lúc đang được đun nóng rồi sau đó được khuấy nhẹ. Dịch
đường sữa được loại bỏ còn phần cục vón chứa mỡ thì được chuyển sang
quá trình làm rắn. Khi độ rắn mong muốn đã đạt được, cục vón được
chuyển sang quá trình làm chín.
*Làm chín
Quá trình làm chín phụ thuộc vào thành phần khối phomat, đặc biệt
là hàm lượng nước, khu hệ vi sinh vật và các điều kiện bên ngoài như
nhiệt độ và độ ẩm của các phòng làm chín. Sự chín của phomat mềm xảy
ra từ ngoài vào trong, vì thế trong giai đoạn đầu sẽ có một phần vỏ chín và
một phần lõi chưa chín. Sự chín không đồng đều xảy ra là do có sự chênh
lệch về pH. ở bên trong khối phomat, pH thấp vì có mặt acid lactic. ở
ngoài vỏ, các loài nấm sợi đặc trưng phát triển thích hợp hơn ở các pH cao
đã nâng pH lên nhờ phản ứng loại CO
2
từ các amino acid.
Sự chín ở phomat cứng xảy ra đồng đều trên toàn bộ khối phomat.
Sự tạo thành vỏ chỉ là kết quả của sự khô bề mặt, điều này có thể tránh
được nhờ việc bao gói khối phomat trong các màng plastic thích hợp trước
khi quá trình làm chín bắt đầu. Thời gian làm chín thay đổi tùy trường
hợp, kéo dài từ vài ngày đối với phomat mềm tới vài tháng thậm chí vài


165
năm đối với các loại phomat cứng. Sản lượng trên 100 kg sữa nước là 8 kg
phomat cứng và tới 12 kg phomat mềm.
Mọi thành phần của phomat đều chịu sự biến đổi về mặt sinh hoá
học ở các mức độ khác nhau trong quá trình làm chín. Lactose được phân
giải thành acid lactic nhờ lên men lactic đồng hình. Trong loại phomat

cheđa chẳng hạn, pH giảm từ 6,55 xuống 5,15 tính từ lúc bổ sung giống
khởi động cho tới khi đúc thành khuôn. Khi có mặt vi khuẩn propionic
(như trong trường hợp của phomat Emmental), acid lactic được chuyển
hóa tiếp tục thành acid propionic, acid acetic, và CO
2
theo phản ứng :
3 CH
3
CHOHCOOH → 2 CH
3
CH
2
COOH + CH
3
COOH + CO
2
+ H
2
O
Tỉ lệ giữa acid propionic và acid acetic bị ảnh hưởng bởi thế oxi hóa
khử của phomat và tỉ lệ này sẽ thấp khi có mặt muối nitrat chăng hạn.
Phương thức và mức độ phân giải mỡ của sữa phụ thuộc vào khu hệ vi
sinh vật tham gia vào quá trình làm chín phomat. Sự giải phóng các acid
béo, đặc biệt là các acid ảnh hương đến hương thơm của phomat phụ
thuộc vào tính đặc hiệu của các lipase.
Ngoài các acid béo tự do, 2-alkanon và 2-alkanol cũng được tạo
thành như các sản phẩm phụ của sự β-oxi hoá các acid béo. Nấm sợi, đặc
biệt là Penicillium roqueorti, sử dụng β-ketoaxyl-CoA đeaxylase
(tiodihydroase) và β-ketoacid đecacboxylase để cung cấp các hợp chất
điển hình cho hương thơm của các phomat bán mềm.

Sự phân giải protein thành các amino acid xảy ra qua các peptit như
ìà các sản phẩm trung gian. Tùy thuộc vào loại sữa mà 20-40% cazein
được chuyển hoá thành các dẫn xuất protein hòa tan trong đó 5-15% là các
acid amin. Phạm vi pH 3-6 là tối ưu đối với hoạt tính proteinase của
Penicillium roqueorti. Sự phân giải protein bị ảnh hưởng mạnh bởi hàm
lượng muối chứa trong phomat. Hàm lượng amino acid là 2,6-9% phần
chất rắn của phomat và là phần quan trọng trong hương thơm của phomat.
Những lỗi trong quá trình làm chín có thể tạo nên những peptit có vị đắng.
Các amino acid được chuyển hóa tiếp tục. Trong giai đoạn sớm của
sự làm chín, với pH thấp, chúng bị loại CO
2
thành các amino. Trong giai
đoạn muộn, với pH cao, các phản ứng oxi hoá chiếm ưu thế. Sự phân giải
protein không chỉ đóng góp vào sự tạo thành hương thơm, nó còn ảnh
hưởng đến kiến trúc của phomat. Khi phomat mềm bị làm chín quá mức,
sự phân giải protein có thể dẫn đến việc dịch hóa gần như toàn bộ khối
phomat.


166
Câu hỏi ôn tập chương 8
1. Trong tế bào, quá trình đường phân diễn ra ở đâu ? Phản ứng này
khác nhau như thế nào khi không có mặt oxy và khi có mặt oxy ?
2. Phân tử nào mở đầu con đường đường phân ? Khi đường phân
hoàn thành, phân tử nào còn lại. Bao nhiêu ATP được tạo thành ở
mức độ phosphoril hóa cơ chất ? Con số ATP được tạo thành là
bao nhiêu, và vì sao con số này lại khác với tổng số ATP được tạo
thành ? Bao nhiêu ATP sẽ được tạo thành bổ sung nếu oxy có mặt
?
3. Khi nguông glucose là không hạn chế thì cái gì sẽ là nhân tố giới

hạn trong phản ứng đường phân ?
4. Hai cơ chế tái tạo NAD
+
là những cơ chế nào ? Chúng khác nhau ở
chỗ nào ? Đâu là một quá trình hiếu khí và đâu là một quá trình kị
khí ?
5. Lên men khác hô hấp oxy hóa chỗ nào khi xét về phương diện các
chất nhận điện tử và sự sản sinh năng lượng ?
6. Sự trao đổi điện tử để tạo nên ATP khác nhau như thế nào trong
các trường hợp NADH được tạo thành trong đường phân, NADH
được tạo thành trong chu trình acid citric, và FADH
2
được tạo
thành trong chu trình acid citric ?
7. Hiệu quả của việc phân giải hiếu khí hoàn toàn một phân tử
glucose ở vi khuẩn là bao nhiêu ? So sánh với hiệu quả của một
mình đường phân?
8. Hiệu ứng Pasteur có gặp ở các vi khuẩn lên men lactic đồng hình
không ? Vì sao ?
9. Giải thích tại sao ở một số nấm men, như Rhodotorula hay
Geotrichum, khi thừa nguồn C, đồng thời thiếu N và P thì lipit lại
được tích lũy ?
10. Cho ví dụ về những trường hợp lên men ở vi khuẩn trong đó có sự
tạo thành nhiều hơn 2 mol ATP trên một mol glucose bị phân hủy.


144
Chương 8
Các quá trình lên men
I. Con đường Embden-Meyerhof (EM) : Bước chuyển hóa

chung cho các quá trình lên men
Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó
một số nguyên tử của nguồn năng lượng (chất cho điện tử) trở nên có tính
khử hơn, trong khi một số nguyên tử khác trở nên oxi hóa hơn, còn năng
lượng thì được sinh ra nhờ sự phosphorin hóa cơ chất. Con đường trao đồi
chất chung đối với sự lên men glucose là con đường đường phân, cũng
còn được gọi là con đường Embden-Meyerhof. Đường phân được chia
thành ba bước chính, mỗi bước gồm một số phản ứng riêng biệt do
enzyme xúc tác. Bước một gồm các phản ứng chuẩn bị, không có các phản
ứng oxi hóa và cũng không giải phóng năng lượng, song lại dẫn đến việc
tạo ra hai phân tử trung gian quan trọng, glixeraldehit-3-phosphate (GAP).
Trong bước hai, sự oxi hóa-khử xảy ra, năng lượng được dự trữ dưới dạng
ATP và hai phân tử piruvat được tạo thành. Trong bước ba, một phản ứng
oxi hóa-khử thứ hai xảy ra và các sản phẩm lên men (chẳng hạn ethanol và
CO
2
, hoặc acid lactic), sẽ được tạo thành. Trong sự tạo thành hai phân tử
acid 1,3 điphosphoglixeric có hai phân tử NAD
+
bị khử thành NADH. Tuy
nhiên, một tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ NAD
+
, và nếu như toàn bộ
NAD
+
bị chuyển thành NADH thì phản ứng oxi hóa glucose sẽ bị đình
chỉ; sự oxi hóa tiếp tục chỉ có thể xảy ra khi một phân tử NAD
+
có mặt để
tiếp nhận các điện tử vừa được giải phóng ra. Sự "tắc đường" này có thể

được khắc phục trong lên men bằng cách oxi hóa NADH trở lại thành
NAD
+
nhờ các phản ứng khử piruvat thành một trong hàng loạt các sản
phẳm lên men khác nhau. Trong trường hợp của nấm men, piruvat bị khử
thành ethanol với sự giải phóng CO
2
. ở các vi khuẩn lactic, piruvat bị khử
thành acid lactic.
Nhiều con đường khử piruvat cũng gặp ở các vi sinh vật nhân sơ
khác, song kết quả thật sự đều giống nhau, tức là NADH phải được hồi
phục lại thành dạng oxi hóa, NAD
+
, để cho các phản ứng thu nhận năng
lượng của lên men có thể tiếp tục. Là một coenzyme dễ khuếch tán,
NADH có thể tách khỏi GAP-dedihydrogenase, gắn vào một enzyme
khác, (chẳng hạn lactat-dedihydrogenase, enzyme khử piruvat thành acid
lactic), rồi lại lập tức khuếch tán trở lại sau khi NADH đã được oxi hóa
thành NAD
+
để lặp lại chu trình một lần nữa.


145
Trong bất kỳ một phản ứng thu năng lượng nào, sự oxi hóa bao giờ
cũng phải được cân bằng với sự khử và phải có một chất nhận nào đó
đứng chờ sẵn để nhận một điện tử vừa được tách ra. Trong trường hợp
này, sự khử NAD
+
tại một bước trong con đường đường phân sẽ được cân

bằng bởi sự oxi hóa nó tại một bước khác. (Các) sản phẫm cuối cùng cũng
phải nằm trong trạng thái cân bằng oxi hóa-khử với cơ chất ban đầu, tức là
glucose.
Bảng 6.1: Các quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật

Kiểu lên men

Phản ứng tổng thể Vi sinh vật thực hiện
Lên men rượu
Hexose → 2 Ethanol + 2 CO
2
Nấm men
Zymomonas
Lên men lactic
đồng hình
Hexose → 2 Lactat + 2 H
+
Streptococcus
Một số Lactobacillus
Lên men lactic dị
hình
Hexose → Lactat + Ethanol +
CO
2
+ H
+
Leuconostoc
Một số Lactobacillus
Acid propionic
Lactat → Propionat + Acetate

+ CO
2
Propionibacterium
Clostridium propionicum
Acid hỗn hợp
Hexose → Ethanol + 2,3-
Butandiol + Xucxinat + Lactat
+ Acetate + Focmat + H
2
+
CO
2
Các vi khuẩn đường ruột
Escherichia, Salmonella,
Shigella, Klebsiella,
Enterobacter
Acid butiric
Hexose → Butirat + Acetate +
H
2
+ CO
2
Clostridium butyricum
Butanol
Hexose → Butanol + Acetate
+ Aceton + Ethanol + H
2
+
CO
2

Clostridium
acetobutylicum
Caproat
Ethanol + Acetate + CO
2
→
Caproat + Butirat + H
2
Clostridium kluyveri
Homoacetic
Fructose → 3 Acetate + 3 H
+
4 H
2
+ 2 CO
2
+ H
+
→ Acetate
+ 2 H
2
O
Clostridium aceticum
Acetobacterium
Sinh methane
Acetate + H
2
O → CH
4
+

HCO
−
3
Methanothrix
Methanosarcina
II. Tính đa dạng của lên men
Bảng 6.1 trình bày một số kiểu lên men chính được phân loại dựa
trên các sản phẩm được tạo thành. Đó là các quá trình lên men rượu, acid
lactic, acid propionic, acid hỗn hợp, acid butiric và acid homoacetic. Có
nhiều quá trình lên men được phân loại dựa trên cơ chất được lên men


146
thay vì các sản phẩm. Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kị khí tạo thành bào tử
(chi Clostridium) lên men các amino acidvới sự sản sinh acetate, amoniac
và H
2
. Các loài Clostridium khác, như C. acidiurici và C. purinolyticum
lên men các purin như xantin hoặc ađenin với sự tạo thành acetate, focmat,
CO
2
, và amoniac. Còn những bọn kị khí khác thì lên men các hợp chất
thơm. Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm
phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C
6
H
6
O
3
) theo con đường sau :

Phloroglucinol (C
6
H
6
O
3
) +3 H
2
O → 3 acetate
-
+ 3H
+
, ΔG
o'
= -142,5
kJ/phản ứng
Nhiều quá trình lên men không thông thường chỉ được thực hiện bởi
một nhóm rất hạn chế các vi khuẩn kị khí, và trong một sồ trường hợp chỉ
bởi một vi khuẩn duy nhất. Một số ví dụ được nêu trên bảng 6.2. Nhiều
trong số các vi khuẩn này có thể được xem như các chuyên gia về trao đổi
chất vì chúng có khả năng phân giải một hoặc nhiều cơ chất mà các vi
khuẩn khác không phân giải được.
Bảng 6. 2: Một số quá trình lên men không thông thường
Kiểu lên men

Phản ứng cân bằng
tổng thể
Vi sinh vật thực hiện
Acetylen
2 C

2
H
2
+ 3 H
2
O → Ethanol +
Acetate + H
+

Pelobacter acetylenicus
Glycerin
4 Glycerin + 2 HCO →
−
3
7 Acetate + 5 H
+
+ 4 H
2
O
Acetobacterium spp.
Resocxinol
(một hợp chất
thơm)
2 C
6
H
4
(OH)
2
+ 6 H

2
O → 4
Acetate + Butirat + 5 H
+
Clostridium spp.
Xinamat (một
hợp chất thơm)
2C
9
H
7
O
2
+ 2 H
2
O → C
9
H
9
O
2
+
Benseat + Acetate + H
+
Acetovibrio multivorans
Phlorogluxinol
(một hợp chất
thơm)
C
6

H
6
O
3
+ 3 H
2
O →
3 Acetate + 3 H
+
Pelobacter masiliensis
Pelobacter acidigallici
Putresxin
10 C
4
H
12
N
2
+ 26 H
2
O → 6
Acetate + 7 Butirat + 20 NH
4
+
+
16 H
2
+ 13 H
+
Các vi khuẩn kị khí gram

dương không sinh bào tử,
chưa phân loại
Xitrat
Xitrat + 2 H
2
O → Focmat + 2
Acetate + HCO + H
−
3
+
Bacteroides sp.
Aconitat
Aconitat + H
+
+ 2 H
2
O → 2 CO
2

+ 2 Acetate + H
2
Acidaminococcus
fermentans
Glioxilat
4 Glioxilat +3 H
+
+ 3 H
2
O → 6
Vi khuẩn gram âm chưa

147
CO
2
+ 5 H
2
+ Glicolat phân loại
Xucxinat
Xucxinat + H
2
O → Propionat +
HCO
−
3
Propionigenium
modestum
Oxalat
Oxalat + H
2
O → Focmat +
HCO
−
3
Oxalobacter formigenes
Malonat
Malonat + H
2
O → Acetate +
HCO

−
3
Malonomonas rubra
Sporomusa malonica
III. Lên men không có sự phosphorin hóa cơ chất
Với một số cơ chất, năng lượng sinh ra không đủ để ghép đôi với sự
tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên các hợp
chất này vẫn trợ giúp sinh trưởng lên men của một cơ thể nào đó. Trong
những trường hợp này sự phân giải cơ chất được gắn liền với những bơm
ion được dùng để tạo nên một građien proton hoặc natri qua màng. Ví dụ
về kiểu này có các quá trình lên men của Propionigenium modestum hoặc
Oxalobacter formigenes, cả hai đều gắn sự lên men các acid đicacboxilic
với các bơm ion sinh năng lượng liên kết với màng. Propionigenium
modestum thực hiện phản ứng sau đây :
Xucxinat
2-
+ H
2
O → Propionat
-
+ HCO
3
-
, ΔG
o'
= -20,5 kJ/phản ứng
Phương trình tổng thể này thu không đủ năng lượng tự do để ghép
đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên
nó lại được dùng làm phản ứng thu năng lượng duy nhất cho sinh trưởng
của vi khuẩn. Sở dĩ như vậy là vì sự loại CO

2
khỏi xucxinat













148

Hình 6.1: Lên men liên kết với bơm ion ở vi khuẩn
(năng lượng thu được không qua phosphorin hóa cơ chất)
(qua metilmalonil-CoA và đecacboxilase liên kết với màng bởi
Propionigenium modestum đã được ghép đôi với sự xuất Na
+
qua màng tế
bào chất. Một ATPse chuyển vị Na
+
nằm trên màng của P. modestum sử
dụng građien này để hoạt hóa sự tổng hợp ATP.
Oxalobacter formigenes thực hiện sự lên men oxalat :
Oxalat
2-
+ H
2
O → Focmat
-
+ HCO
3
-
, ΔG
o'
= -26,7 kJ/phản ứng
ở pH trung tính, oxalat tồn tại dưới dạng ion hóa oxalat
-
, và sự loại
cacboxil thành focmat

-
tiêu thụ một proton. Sau đó sự xuất focmat
-
khỏi tế
bào sẽ tạo nên một động lực nhờ proton (proton motive force = PMF) có
khả năng ghép đôi với sự tổng hợp ATP nhờ một ATPase chuyển vị
proton nằm trên màng.


149
Điều thú vị và độc đáo trong trao đỗi chất của cả Propionigenium
modestum lẫn Oxalobacter formigenes nằm ở chỗ sự tổng hợp ATP xảy ra
không cần cả phosphoril hóa cơ chất lẫn chuỗi vận chuyển điện tử; tuy
nhiên, sự tạo thành ATP theo cơ chế hóa thẩm vẫn xảy ra dựa vào một
bơm Na
+
/H
+
kết hợp với sự loại CO
2
khỏi các acid hữu cơ. Điều cần rút ra
từ những sự lên men này là : các phản ứng, dù chỉ thu được dưới 31,8 kJ,
con số cần thiết để tạo thành một ATP, hoặc không có khả năng ghép đôi
với sự phosphorin hóa cơ chất, cũng không thể lập tức bị coi là không có
khả năng trợ giúp sinh trưởng cho một vi khuẩn. Nếu như phản ứng có thể
ghép đôi được với một građien ion thì sự sản sinh ATP vẫn có khả năng
xảy ra và do vậy vẫn có sinh trưởng (Hình 6.1).
IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy)
Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng,
một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một

chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức
không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được.
Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có
liên quan tới khí dihydro (H
2
) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được
tiêu thụ bởi đối tác kia.
Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển
H
2
liên loài. Kẻ tiêu thụ H
2
có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi
khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy
xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol
thành acetate và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2,
bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng
lượng tự do (ΔG
o'
dương). Tuy nhiên, H
2
được sinh ra bởi đối tác lên men
rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành
methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản
ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ
giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng.
Lên men ethanol
2CH
3
CH

2
OH + 2H
2
O
→
4H
2
+ 2CH
3
COO
-
+2H
+
+19,4 kJ /phản ứng
Sinh methane
4H
2
+ CO
2
→
CH
4
+ 2H
2
O - 130,7 kJ/phản ứng
Phản ứng cộng dưỡng
2CH
3
CH
2

OH + CO
2
→
CH
4
+ 2CH
3
COO
-
- 111,3 kJ/phản ứng


150
Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat
thành acetate cộng với H
2
bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo
Syntrophomonas:
Butirat
-
+ 2H
2
O → 2acetate
-
+ H
+
+ 2H
2
, ΔG
o'

= +48,2 kJ/phản ứng
Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi
và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên
butirat. Song nếu H
2
vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi
một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas
lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H
2
.
V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn
Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở
vi sinh vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới
các điều kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc
biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số
nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt
không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO
2
. Nhiều vi
khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính
hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose.
1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men
Sự lên men glucose thành ethanol và CO
2
nhờ Saccharomyces
cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa
piruvat thành ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại
CO
2
thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của

tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol
nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH.






2CO
2

2NAD
2NADH
2 Piruvat
2 Acetaldehyt
Glucose
2Ethanol




151
Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate-
dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ
được cân bằng.
2. Các dạng phương trình Neuberg
Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu
không chỉ có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose
mà cả piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như
một sản phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit

vốn không độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi
trường chứa glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết
tủa do tạo thành phức chất :
CH
3
-CHO + NaHSO
3
→ CH
3
- CHOH -SO
3
Na
Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng
thời hiệu suất ethanol và CO
2
sẽ giảm xuống.
Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong
công nghiệp để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt
giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa.
Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng
làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị
loại phosphate để trở thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như
sau :
Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO
2
Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men
Neuberg 2.
Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO
3
, Na

2
HPO
4
) thì glycerin cũng
được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản
ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một
chất nhận điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3
và được viết như sau :
Glucose + 2H
2
O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO
2
Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1.





152
3. Hiệu ứng Pasteur
Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường
phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không
những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO
2
mà còn làm giảm sự hấp thụ
đường. Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này.
Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá
trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro
xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và
phosphate vô cơ (P

vc
) :
Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + P
vc
→ 3-phosphoglicerate +
NAD
H
+ ATP
Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc
vào sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí,
sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để
phát sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và
hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ
giảm. Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa
chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại
dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong
điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng.
Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế
điều hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa
chủ chốt trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu
chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự
cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của
ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào
môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa
chuỗi hô hấp.
Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm
men lên men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận
nghịch đầu tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa
fructose-6-phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm
hãm dị lập thể bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm

tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của
phản ứng enzyme trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể
hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ
đường này.


153
Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại
hoạt hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích
thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose.
Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ
chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được
tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này.
Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người
ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-
phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau
khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau
khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế
bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-
phosphate lại giảm mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như
một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi
trung gian khác. Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ
bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do
vậy, nồng độ giảm đi.
Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở
mô động vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt
về loại chất hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP
mới là chất hiệu ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất
giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và
đặc hiệu chủng.

4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men
Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào
mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài
được quan tâm trước hết
trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces
sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo
ra nhờ kỹ thuật di truyền.
Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công
nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên
men. Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị
cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả
năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính
chịu pH thấp.


154
Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói
chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu
quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35
o
C. Hiện nay người
ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm
men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc
các hợp chất làm biến tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể
đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự
trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu.
5. Hiệu suất lên men
Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol
trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm

sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO
2
và 2 mol ATP trên mỗi mol
glucose được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý
thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên
men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như
vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh
khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có
các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới
4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng
ethanol có thể tăng thêm được 2,7%.
Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men
vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa
bão hòa và các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở
nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm
trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành
ethanol (hiệu ứng Pasteur).
Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự
tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men.
Chúng bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng
để tổng hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu,
Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các
vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết.
Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ
đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các
chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số
trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung
như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền.

155





















Hình 6.3: Hiệu ứng Pasteur
Cơ chế điều hòa nhờ enzyme dị lập thể Phosphofructosekinase
Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế bởi ethanol. Nồng độ 1-2%
(w/v) đã đủ để làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ cồn
10% (w/v) tốc độ sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. Bản chất
của hiện tượng kìm hãm này là rất phức tạp. Việc thêm cồn vào pha log
làm giảm nhanh tốc độ sinh trưởng của nấm men (có lẽ do tác động lên sự
tổng hợp protein), giảm khả năng sống sót của tế bào (qua sự biến tính

không thuận nghịch của các enzyme), và ở một mức độ thấp hơn nhiều,


156
ethanol làm giảm tóc độ tổng hợp bản thân nó. Các dẫn liệu về mức độ
chịu cồn của một số chủng nấm men phụ thuộc rất nhiều vào thành phần
acid béo trong màng tế bào chất cho thấy rằng thành phần acid béo kích
thích hoặc kìm hãm sự tiết ethanol khỏi bào tương. Các kết quả khác cung
chứng minh được rằng ethanol được tạo ra trong lên men (ethanol tự sinh)
ức chế lên sinh trưởng của tế bào mạnh hơn là ethanol được đưa vào một
cách nhân tạo từ bên ngoài.
6. Sự tạo thành ethanol nhờ vi khuẩn
Trong số vi khuẩn, kiểu lên men rượu phổ biến ở nấm men (EM,
piruvat-đecacboxilase) chỉ gặp ở Sarcina ventriculi. Đây là loài vi khuẩn
chịu khí yếu, dễ dàng phân lập được từ đất, nhưng cũng gặp cả trong dịch
tiêu hóa của những người mắc bệnh dạ dày. Các vi khuẩn này được coi là
không bình thường vì có kích thước rất lớn (đường kính 4 μm), tạo nên
các dạng hộp bao gói (chứa trên 64 tế bào mỗi hộp , được liên kết với
nhau nhờ xenlulose), chịu pH (sinh trưởng được ở pH từ 0,9 đến 9,8) và
tạo thành nội bào tử.
Từ dịch ép lên men của cây dứa dại (Agave americana) ở vùng
Mexico người ta đã phân lập được một loài vi khuẩn hình que, di động, có
lông roi ở hai cực, có khả năng tạo thành ethanol. Vi khuẩn này có tên là
Zymomonas mobilis, phân giải glucose theo con đường 2-keto-3deoxi-6-
phosphogluconat (KDPG) cắt piruvat thành acetaldehit và đioxit cacbon.
Acetaldehit được khử thành ethanol. Ethanol, đioxit cacbon và một lượng
nhỏ acid lactic là những sản phẩm lên men duy nhất. Người ta để ý rằng
trong rượu mạnh chế từ dứa dại, các nguyên tử cacbon số 2 và số 3 cũng
như số 5 và số 6 đã thay thế các nguyên tử cacbon số 1 và số 2 cũng như
số 5 và số 6 trong rượu chế từ nấm men.

157
Trong quá trình lên men của một số Enterobacteriaceae và
Clostridium, ethanol xuất hiện như một sản phẩm phụ. Tuy nhiên, tiền
chất của ethanol, acetaldehit, không được giải phóng trực tiếp từ piruvat
nhờ piruvatđecacboxilase mà được tạo thành nhờ sự khử acetil-CoA.
Các vi khuẩn lên men lactic dị hình (ví dụ Leuconostoc
mesenteroides) tạo ra alcohol theo một con đường hoàn toàn khác. Qua
các bước đầu tiên của con đường pentosephosphate (PP), glucose được
phân giải thành pentosephosphate. Phosphoketolase tấn công vào xilulose
-5- phosphate :
Xilulose-5-phosphate+P
vc
→ Acetilphosphate + glyceraldehyt-3-phosphate
Acetilphosphate vừa tạo thành nhờ acetaldehit-đedihydrogenase và
alcohol-đedihydrogenase sẽ được khử thành ethanol. Sản phẩm phân giải
còn lại là glyceraldehyt-3-phosphate, sẽ được khử thành lactat qua piruvat.
VI. Lên men lactic và họ Lactobacteriaceae
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc
dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi
khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt

sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng. Tất cả các đại diện
đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ
Sporolactobacillus) và không di động. Để thu năng lượng chúng hoàn toàn
phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactat).
Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh acid lactic,
chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Chúng khác chứa các hemin
(xitocrom, catalase). Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae
có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí, chúng thuộc bọn kị khí
song đồng thời cũng là bọn chịu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí
mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn lactic
(trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae).
1. Nhu cầu về các chất bổ sung và nhân tố sinh trưởng
Một đặc điểm nữa của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về các chất
bổ sung. Không có đại diện nào có thể mọc được trên môi trường vô cơ
thuần khiết chứa glucose và các muối amôn. Đa số trong chúng cần hàng
loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid
folic, biotin), và các acid amin, các bazơ purin và pirimiđin. Vì vậy người
ta thường nuôi chúng trên các môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa


158
những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc
thậm chí cả máu nữa.
Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên
men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể
tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin
hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các
pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số
vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng.
Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có

thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên
những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất
đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả
năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng
lactose.
Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli)
cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật
có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với
sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích
nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú.
Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose
nó phải được phân cắt :

Lactose + H
2
O D-glucose + D-galactose
β- Galactozidase
Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành
glucosephosphate.
Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng
cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một
môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự
tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc.
Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản
xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng
như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một
lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường
thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân
lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc.

159
2. Lên men lactic đồng hình
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như
toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các
enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình
loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat :


Glucose

2 NADH





Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên
hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự
có mặt của một lactat-racemase.
Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành
acetate, ethanol, CO
2
và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ
thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi.
3. Lên men lactic dị hình
Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con
đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải
glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua

glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình).
Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và
nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc
taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và
acetilphosphate.
Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được
rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO
2
theo một tỉ lệ
gần như tương đương:
C
6
H
12
O
6
→ CH
3
- CHOH - COOH + CH
3
- CH
2
- OH + CO
2
ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit
thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc
2 Lactat

2 Piruvat
2 NAD