Giáo trình Vi sinh vật học part 4 ppsx

97
không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi
trường đi ra với cùng một tốc độ.
Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó
tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị
sự thay đổi thể tích sau một giờ).
Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi
bình nuôi cấy với thể tích:
v
-
= -
dt
dX
= D.X
Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính:
X = X
0
. e
-Dt
Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình biểu thị bởi
phương trình:
v
+
=
dt
dX
= μ.X
Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình tăng theo phương trình:
X = X
0

. e
μt
Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong
nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa độ tăng v
+
và độ giảm v
-
:
v = v
+
- v
-
=
dt
dX
= (μ - D).X
Nếu μ > D => v > 0: mật độ vi khuẩn trong bình tăng.
Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm.
Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời
gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học.
Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu
được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường
xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian.
Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào,
trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và
không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc
nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện
quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp.
Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể
duy trì được điều kiện μ = D.

Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh
trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong. Mỗi pha

98
sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất định. Việc điều
khiển tự động khó thực hiện.
Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến
việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây trong phạm
vi nhất định bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện môi trường
không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động (hình 4.3).


Turbidost
Chemosta













Hình 4.3 Nuôi cấy liên tục trong chemostas (trái) và
turbidostas (phải)

V. Sự kìm hãm sinh trưởng và sự diệt khuẩn

1. Các phương pháp khử trùng
1.1. Khử trùng bằng nhiệt
- Khử trùng bằng phương pháp Pasteur
Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới
100
0
C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các môi trường dễ bị
hỏng khi đun sôi như sữa, bia, rượu vang Khử trùng kiểu Pasteur có thể
ở 60
0
C trong 30 phút hoặc 75
0
C trong 15 phút hay 80
0
C trong 10 phút.
- Khử trùng bằng cách đun sôi
Người ta dùng nồi Koch hay nồi Arnola để khử trùng. Nồi hấp được
cấu tạo bằng thùng hai vỏ kim loại. Nước ở thùng ngoài được đun sôi, hơi
nước sẽ vào thùng trong. Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 100
0
C. Ở

99
nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng
nảy mầm. Ngoài phương pháp trên người ta còn có thể đun sôi trực tiếp
các dụng cụ bằng kim loại, cao su, kim tiêm và xylanh trong thời gian
khoảng 10 phút.

- Khử trùng bằng phương pháp hấp gián đoạn
Các môi trường dinh dưỡng, các ống bằng cao su và một số dụng cụ
dễ bị hỏng khi khử trùng ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần phải khử trùng bằng
cách đun sôi lặp lại 3 lần trong 3 ngày kế tiếp nhau. Lần đun thứ nhất
trong 30 - 45 phút làm cho các tế bào sinh dưỡng đều bị chết, nhưng bào
tử vẫn còn sống. Sau đó để môi trường, dụng cụ đã khử trùng vào tủ ấm
28 - 30
0
C. Ở nhiệt độ này trong môi trường thích hợp, các bào tử sẽ nảy
mầm. Trong lần khử trùng thứ hai các tế bào vừa mới nảy mầm lại bị tiêu
diệt. Để đảm bảo hoàn toàn vô trùng ta tiếp tục khử trùng lần thứ 3 trong
ngày thứ 3 kế tiếp.
- Khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave)
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng
hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1atm. Nồi hấp áp lực cao làm bằng kim loại,
có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi
để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. Thùng khử trùng có nắp van
thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xì hơi
khi áp suất quá mức cần thiết và để nồi khỏi bị nổ. Khoảng trống giữ hai
lớp vỏ là ngăn chứa hơi nước được nối với phểu. Nước trong nồi phải đủ
đến mức quy định đã khắc trên ống đo nước, phía trên của thùng có lỗ để
đưa hơi nước vào thùng trong. Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van
xung quanh.
Chuẩn bị môi trường để khử trùng: các dụng cụ chứa môi trường chỉ
được chứa đến 2/3 thể tích và nút kín bằng nút bông. Nút bông không
được chặt quá để khỏi ngăn cản sự cung cấp ôxy cho vi sinh vật và không
lỏng quá dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường, đáy nút
bông phải gọn tròn không dài quá hoặc ngắn quá. Khi phân phối môi
trường tuyệt đối không để môi trường dính vào miệng ống nghiệm, bình
hay nút bông. Dụng cụ xếp vào nồi khử trùng phải ngay ngắn, không xếp

quá sít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua. Khi khử trùng bằng nồi áp lực
cao, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo.
Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý pH của môi trường, pH dưới
5,5 thạch bị thủy phân và khi nguội không có khả năng tạo gel. Nếu môi
trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramen hóa đường. Để
tránh các hiện tượng trên, trong khi khử trùng phải để môi trường có pH
trung tính, sau khi khử trùng phải trung hòa lại môi trường đến mức pH

100
cần thiết. Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 30
0
C trong
2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng.
- Khử trùng bằng sức nóng khô
Cách khử trùng này tiến hành trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 170
0
C
trong 2 - 3 giờ. Ở điều kiện này các tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi
sinh vật đều bị tiêu diệt. Cách khử trùng này được sử dụng để khử trùng
các dụng cụ thủy tinh. Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần
được nút kín bằng nút bông. Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói
kín bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra.
- Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa
Cách khử trùng này dùng để khử trùng que cấy vi sinh vật, các dụng
cụ bằng sắt (kim, kẹp, gắp, dao, kéo ), một số dụng cụ thủy tinh (đũa
thủy tinh, que gạt ). Muốn khử trùng ta đưa đi đưa lại nhiều lần dụng cụ
trên ngọn lửa đèn cồn, bằng cách này mọi vi sinh vật bám trên bề mặt
dụng cụ đều bị tiêu diệt.
1.2. Khử trùng không bằng nhiệt
- Dùng nến lọc vi khuẩn

Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumine trong môi trường dễ
bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách
lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. Các lỗ của màng lọc nhỏ hơn kích thước
của tế bào vi khuẩn. Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là loại lọc seltz,
loại này có 2 bộ phận. Một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa
dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới. Hai bộ phận được gắn vào
nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc. Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa
2 bộ phận một màng lọc tròn bằng amian hay bằng nitrocellulose dày
khoảng 3 - 5cm (màng lọc chỉ dùng một lần).
- Khử trùng bằng hóa chất
Hóa chất được dùng để khử trùng bảo quản nguyên vật liệu và để
làm sạch phòng thí nghiệm, bệnh viện. Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý tới
nồng độ thích hợp, không gây độc đối với con người. Sàn nhà, bàn ghế
trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0,5 -
3%, hoặc nước phenol 3 - 5%. Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ
thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thuỷ tinh
- Khử trùng bằng tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời
Tia tử ngoại có bước sóng 13 - 400 nm đều có tác dụng diệt khuẩn.
Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử
ngoại trong khoảng 30 - 40 phút.

101
Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 - 400 nm cũng có tác dụng diệt
khuẩn. Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng
cụ của phòng thí nghiệm 2 - 3 giờ sau khi đã được rửa sạch.
2. Các phương pháp bảo quản
1. Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào
thạch. Sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +4
0
C.

Phương pháp này đơn giản nhất và thường được dùng nhưng kém hiệu quả
nhất.
2. Bảo quản dưới dầu vô trùng: dầu paraffin vừa ngăn cản môi
trường khô vừa làm giảm trao đổi chất gây cản trở sự xâm nhập của ôxy.
3. Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng: do cấu trúc lí - hóa cát
và đất sét đều là những vật chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là
các bào tử. Sau khi làm khô không khí cát (hoặc đất sét) cùng với vi khuẩn
có thể bảo quản tế bào rất lâu.
4. Đông khô: là phương pháp hoàn thiện và có hiệu quả nhất. Vi
khuẩn được trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh ) rồi làm
lạnh và làm khô nhờ băng khô. Sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn giữ
được khả năng sống mà không bị biến đổi về di truyền.
5. Bảo quản trong glycerine (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-60
0
C
hay - 80
0
C): đây là phương pháp rất thích hợp nhưng cần mua được loại
ống nhựa chịu nhiệt (khi khử trùng).

Câu hỏi ôn tập chương 4

1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật?
2. Các cơ chất dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh
vật?
3. Cơ chế và tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên sinh trưởng và
phát triển của vi sinh vật?
4. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật, điểm khác biệt của phương
pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục?
5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đường cong sinh trưởng, hiện tượng

sinh trưởng kép?


102
Chương 5
Trao đổi chất ở vi sinh vật
I. Các con đường phân giải hexose
1. Con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP hay đường phân)
1.1 Cơ chế (hình 5.1)
Glucose
(1)
Glucose - 6 P
(2)
Fructose - 6P
ATP
(3) ADP
Fructose - 1,6 DP
(5) (4)

(AlPG) Glyceraldehyd - 3P Dioxy acetone – P (DAP)
H
3
PO
4
NAD
(6)
NADH
2
a. 1,3 diphosphoglyceric (a. 1,3DPG)
ADP

(7)
ATP
a.3 P - Glyceric (A
3
PG)
(8)
a.2P- Glyceric (A
2
PG)
(9)
Phosphoenolpyruvic (PEP)
(10) ADP
A TP



Trong điều kiện có hoặc không có O
2
, glucose đều được chuyển
thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản
ứng một chiều, còn các phản ứng khác là phản ứng thuận nghịch. Trừ chất
a. Pyruvic
Hình 5.1: Con đường EMP

103
đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng
phosphoryl hóa. Gốc phosphoryl mang 3 chức năng là giúp cho chất trung
gian mang điện tích âm cao không thể thoát ra ngoài, là vị trí gắn enzyme
và là vị trí cung cấp liên kết cao năng.
Phương trình chung:

Glucose 2 pyruvate + 2ATP + 2 NADH
2
ATP được tạo thành từ 2 phản ứng 7 và 10. Sự tạo thành ATP ở 2
phản ứng trên gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì phosphate cao
năng trước đó là một phần của phân tử chất trao đổi (1,3 di - P - glycerate
và PEP), khi có mặt của ADP thì chất trao đổi sẽ chuyển gốc P cho ADP
tạo thành ATP.
Có thể chia con đường EMP thành 4 giai đoạn:
1. Hoạt hóa glucose tạo fructose - 1,6 diphosphate (có thể xẩy ra ở
nhiều monosaccharide khác).
2. Bẻ đôi phân tử fructose - 1,6 diphosphate tạo AlPG và DAP.
3. Ôxy hóa AlPG thành A
2
PG.
4. Chuyển hóa A
2
PG tạo acid pyruvic (hình 5.1).
1.2. Ý nghĩa của con đường EMP
- Quá trình đường phân cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất
dùng để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: glucose - 6-P, fructose - 6-P, 3-P-
glyceraldehyd, 3P - glycerate, PEP, pyruvate.
- Cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào tuy hiệu suất
không cao (khoảng 10%), nhưng đây là con đường nguyên thủy nhất gặp ở
hầu hết sinh vật.
2. Con đường pentosophosphate ôxy hoá (PP, HMP)
Do một đột biến nào đó (thiếu enzyme) mà một số vi sinh vật có thể
chuyển hóa glucose thành pyruvate theo con đường PP (hình 5.2).
Từ glucose qua quá trình decarboxyl hóa tạo ribuloso - 5P và CO
2
.

Các phản ứng tiếp theo là sự chuyển hóa giữa pentoso- 5P và hexoso - 6P.
Ý nghĩa của chu trình: Xét về mặt năng lượng, từ 1 phân tử glucose
khi phân giải tạo 35 ATP nhưng qua con đường này tạo riboso - 5P tham
gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, tạo các loại đường C
4
, C
7

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin. Con đường này tạo
NADPH
2
cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp trong tế bào. Đây là
con đường phân giải đường thường gặp ở vi khuẩn thuộc giống
Pseudomonas.

104
Phương trình tổng quát:
Glucose + 6O
2
6CO
2
+ 6H
2
O + 35ATP
Glucose
Er
y
tros
Glucose

Glucose
Fructos
Frutose
Fructos
Fructos
Er
y
trose
Ribulose
Xilulose
Xilulose
Xilulose
Xilulose
Ribose
Ribose
Hình 5.2 Con đường pentosophosphate

3. Con đường KDPG (2keto - 3deoxy - 6Pgluconate)
Phương trình tổng quát như sau:
Glucose 2 Pyruvate + ATP + NADH
2
+ NADPH
2

Con đường KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng gluconate và chỉ
gặp ở một số vi khuẩn. Ở E. coli và nhiều loài của Clostridium chuyển hóa
glucose qua con đường EMP nhưng phân giải gluconate qua con đường
KDPG. Qua các con đường phân giải glucose, pyruvate được tạo thành.
Nếu trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật sẽ ôxy hoá pyruvate tạo
CO
2
và nước. Nếu điều kiện kị khí các vi sinh vật sẽ tiến hành quá trình
lên men hoặc hô hấp kị khí (hình 5.3).

105



Glucose
Glucose -6-
hh
6 -
p
hos
p

ho
g
lucono-18-lactose
6 -
p
hos
p
ho
g
luconate
2-keto-3 deox
y
-6-
p
hos
p
ho
g
luconate
pyruvate
Gl
y
ceraldeh
yd
1
,
3
3-
p
hos

p
ho
g
l
y
cerat
2-
p
hos
p
ho
g
l
y
cerate
Phos
p
hoenol-
py
ruvate
Hình 5.3 Con đường KDPG

4. Ôxy hoá pyruvate
Pyruvate chiếm vị trí trung tâm trong trao đổi chất trung gian và là
tiền chất của nhiều sản phẩm. Nhiều vi sinh vật ôxy hóa pyruvate thành
acetyl - CoA chủ yếu qua 3 phản ứng sau (hình 5.4):

106
Pyruvate +CoA+NAD
+
Acetyl - CoA + NADH
2
+ CO
2
(1)
Pyruvate + CoA + 2Fd Acetyl - CoA + 2FdH + CO

2
(2)
Pyruvate + CoA + NAD
+
Acetyl - CoA + formate (3)
(Formate - Fd - ferredoxin)

Hình 5.4 Quá trình ôxy hóa pyruvate
Pyruvate-
carboxylase
Vòng tiasolium
củ






a thiamin
pyrophosphate

Acid acet

y
l-li
p
oic
Dihydrolipoid-
transacetylase

Acid dih
y
droli
p
oic
Enz
y
me
Acid li
p
oic
Dihydrolipoid
-
dehydrogenas
Enz
y
me
Enz
y
me
Enz
y
me
P
y
ruvate

Phản ứng (1) do phức hệ pyruvate - dehydrogenase (PDH) xúc tác.
PDH gặp ở hầu hết vi sinh vật hiếu khí (không gặp ở vi khuẩn kị khí bắt
buộc). PDH gồm 3 enzyme, ngoài CoA và NAD
+
còn cần TPP (thiamine -
pyrophosphate) và acid lipoic. Phản ứng (2) xúc tác bởi pyruvate - Fd -
oxidoreductase, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí như Clostridium.
Phản ứng (3) do pyruvate - formate - liase xúc tác, enzyme này gặp nhiều
ở vi khuẩn kị khí tiết acid formic (thuộc họ Enterobacteriaceae) và vi
khuẩn quang năng.

107



II. Chu trình tricarboxylic (Krebs)

Trong quá trình ôxy hóa hoàn toàn, pyruvate sẽ được ôxy hoá triệt
để thông qua chu trình Krebs (chu trình acid tricarboxylic = ATC).

Cơ chế được trình bày ở hình 5.5.






















Hình 5.5 Chu trình Krebs
(
theo Lehnin
g
er
)
Trong chuỗi phản ứng vòng của chu trình ATC, acid pyruvic bị phân

huỷ triệt để tạo CO
2
, coezyme dạng khử và các hợp chất trung gian. Các
coezyme thông qua chuỗi hô hấp vận chuyển H và electron đến cho O
2

phân tử tạo nước đồng thời giải phóng năng lượng ATP.

108
Ý nghĩa của chu trình: Ngoài chức năng ôxy hóa tận cùng, chu trình
ATC còn cung cấp cho tế bào 3 tiền chất là oxalacetate (tổng hợp
aspactate), α - ketoglutarate và succinyl - CoA (tổng hợp nhân hem). Về
năng lượng, chu trình cung cấp 1ATP ở mức độ phosphoryl hóa cơ chất
nhưng sản sinh NADH
2
để đi vào chuỗi vận chuyển electron tạo ATP.
Trong điều kiện kị khí chu trình TCA không có chức năng sinh năng
lượng nhưng cũng phải cung cấp cho tế bào 3 tiền chất trên. Tế bào phải
sử dụng phần lớn pyruvate để lên men thu năng lượng, còn phần nhỏ
chuyển thành acetyl - CoA nhờ pyruvate - ferredoxin - oxidoreductase.
Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí ôxy hóa chất dinh dưỡng hữu cơ
thành CO
2
và H
2
O (vì carbon trong phân tử CO
2
đạt mức độ ôxy hóa cao
nhất nên người ta gọi là quá trình ôxy hóa hoàn toàn). Một số vi sinh vật
có khả năng ôxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng lại sinh ra các

sản phẩm chưa được ôxy hóa hoàn toàn (ketoacid, acid gluconic, acid
malic, acid fumaric ). Nhiều quá trình ôxy hóa không hoàn toàn có ý
nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì chúng sản sinh ra nhiều
sản phẩm có giá trị.
III. Chuỗi hô hấp (respiratory chain) và phosphororyl hóa ôxy
hóa (oxidative phosphorylation)
Khác với vi khuẩn kị khí, vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp ATP mạnh mẽ
hơn nhiều nhờ có chuỗi hô hấp và ATP - synthetase. Hai hệ thống này nằm ở
màng tế bào Prokaryota hoặc màng trong ti thể của tế bào Eukaryota. Năng
lượng thoát ra được chuyển thành ATP, một phần nhỏ giải phóng ra ở dạng
nhiệt. Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép, gồm nhiều enzyme vận
chuyển electron và hydro, các coenzyme và nhóm thêm, các dehydrogenase và
hệ thống vận chuyển. Các thành phần quan trọng nhất tham gia vào ôxy hóa
hydro là :
- Flavoprotein là các enzyme chứa nhóm thêm là FMN hoặc FAD - vận
chuyển hydro.
- Protein Fe-S vận chuyển electron, chứa nguyên tử Fe, vừa liên kết với S
của cysteine vừa liên kết với S của H
2
S. Cysteine là một phần của chuỗi
polypeptide, có thể coi trung tâm Fe - S là nhóm thêm của chuỗi polypeptide.
Các protein Fe - S cũng tham gia vào sự cố định N, khử
sulphite, khử nitrite, quang hợp
- Quinol: nằm ở màng trong của ti thể, ở vi khuẩn G
-
là ubiquinol
(CoQ), vi khuẩn G
+
là naphtoquinol và ở lục lạp là plastoquinol. Quinol,
đặc biệt là CoQ có đặc tính ưa lipid do đó lắp vào lớp lipid kép của màng,

vận chuyển hydro hoặc enzyme.

109
- Cytochrome: vận chuyển electron, không vận chuyển hydrogen.
Cytochrome nhận electron từ quinol, trong quá trình vận chuyển một số
lượng H
+
tương đương với số lượng electron bị tách vào môi trường (hình
5.6).
C
y
t C
y
t
C
y
t C
y
t
Hình 5.6 Sơ đồ chuỗi hô hấp

Trong quá trình vận chuyển 2[H] từ NADH
2
đến O
2
có 3 bước
chuyền electron liên quan đến tạo thành ATP và được biểu thị bằng hệ số
P/O (mol ATP/mol nguyên tử O). Hệ số P/O = 3 khi 2[H] được chuyền
qua NAD
+
và P/O = 2 khi 2[H] từ succinate qua FAD đến O
2
. Do đó 1mol
glucose khi phân giải qua chu trình EMP và TCA với tất cả [H] tách ra
được chuyển vào chuỗi hô hấp để tạo thành nước sẽ tạo 38 ATP. Sự tính
toán trên đúng với ti thể và một số vi khuẩn. Tuy nhiên, ở một số vi khuẩn
do chỉ có 2 vị trí phosphoryl hóa nên sự hô hấp hiếu khí glucose chỉ cho
26 ATP (như ở E. coli không có NAD, Proteus vulgaris không có
cytochrome C).
Cơ chế phosphoryl hoá ôxy hoá (sự tạo thành ATP trong chuỗi hô
hấp) được giải thích theo thuyết hoá thẩm thấu của Mitchell (1979). Theo
thuyết này, màng tế bào vi khuẩn và màng trong ti thể không thấm các ion
kể cả H
+
và OH
-
và kém dẫn điện. Sự sắp xếp các protein của màng (các
thành phần vận chuyển electron, permease, ATP - sinthetase ) khiến

màng mang tính chất không đối xứng. Sự định hướng không gian của các
phân tử enzyme dẫn đến trao đổi chất có đặc tính vectơ. Chuỗi hô hấp bao
gồm một dãy các chất vận chuyển hidro và electron sắp xếp luân phiên
trong màng. Do sự ôxy hoá cơ chất mà phía trong màng có sự tiêu thụ H
+

và phía màng ngoài giải phóng H
+
. Trong sự ôxy hoá NADH
2
, 6H
+
đã

110
được vận chuyển ra phía ngoài qua 3 núm. Việc vận chuyển proton do hô
hấp làm xuất hiện một gradien điện hoá giữa 2 phía của màng. Thế proton
này sẽ là động lực của sự phosphoryl hoá nghĩa là sự tạo thành ATP. Quá
trình được xúc tác bởi ATP - sinthetase, enzyme này chuyển năng lượng
phát ra từ dòng electron thành liên kết esterphosphate cao năng của ATP.
ATP - sinthetase gặp ở các màng tham gia vào sự chuyển hoá năng lượng
là màng ti thể, lục lạp và màng tế bào vi khuẩn. Có lẽ, dòng H
+
từ ngoài đã
đi qua rãnh của ATP - sinthetase trở vào bên trong ti thể hoặc vi khuẩn,
năng lượng thoát ra được dùng cho phản ứng phosphoryl hoá tạo ATP.
IV. Sự vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào
Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường
xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt
chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác chúng

thải ra các sản phẩm trao đổi chất. Giữa môi trường xung quanh và môi
trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này
chính là màng tế bào chất.
Tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Sự xâm nhập của
nước và các chất hòa tan qua màng tế bào là một quá trình động học; tế
bào sống không bao giờ ở trạng thái cần bằng với các chất của môi trường
chung quanh. Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào vi sinh vật tuân
theo một trong hai cơ chế: khuếch tán đơn giản (hay còn gọi là vận chuyển
thụ động hay vận chuyển xuôi dòng) và vận chuyển chủ động (vận chuyển
ngược dòng).
Theo cơ chế khuếch tán thụ động các phân tử đi qua màng nhờ sự
chênh lệch nồng độ (trong trường hợp các chất không điện phân) hay
chênh lệch điện thế (trong trường hợp các ion) ở hai phía của màng. Hàng
loạt nghiên cứu đã khẳng định, trừ nước ra rất ít hợp chất có thể được vận
chuyển qua màng theo cơ chế nói trên.
Trái lại, đa số các chất hòa tan qua màng do cơ chế vận chuyển đặc
biệt. Những phân tử vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân
tử chất hòa tan và chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng, từ đây
các phân tử chất hòa tan được chuyển vào tế bào chất. Kiểu khuếch tán
này được gọi là khuếch tán xúc tiến. Các phân tử protein vận chuyển
(carrier protein) nói trên gọi là protein thấm – permease.
Sự vận chuyển các chất nhờ permease có thể là thụ động (không cần
năng lượng của tế bào) hoặc chủ động (cần năng lượng). Theo cơ chế vận
chuyển thụ động, chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một vị trí đặc biệt
trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng).
Phức hợp “chất hòa tan - permease” được vận chuyển theo hai phía của

111
màng nhờ sự chênh lệch nồng độ ở một chất nào đó, nghĩa là sự vận
chuyển diễn ra theo kiểu “xuôi dòng”. Sự vận chuyển thụ động nhờ

permease đã được chứng minh ở một số vi sinh vật.
Tuy nhiên, vi sinh vật có khả năng tích lũy một số chất với nồng độ
cao hơn nhiều so với nồng độ bên ngoài. Chẳng hạn, nồng độ K
+
bên trong
một số tế bào vi sinh vật có thể lớn hơn nồng độ bên ngoài hàng ngàn lần.
Để đảm bảo độ trung hòa điện, tế bào cũng đồng thời thải ra bên ngoài các
ion H
+
hoặc Na
+
. Thêm vào đó, người ta đã phát hiện thấy ở các màng vi
khuẩn có hoạt tính của ATP - ase là enzyme có liên quan đến việc vận
chuyển các chất.
Rõ ràng, trong tế bào vi sinh vật ngoài cơ chế vận chuyển thụ động
còn tồn tại cơ chế vận chuyển chủ động nhờ permease. Sự vận chuyển này
được tiến hành ngược với gradien nồng độ nghĩa là theo kiểu “ngược
dòng”, năng lượng tiêu thụ có thể do ATP cung cấp.
Cho tới nay người ta đã phân lập được hàng loạt protein vận chuyển
trong các loài vi sinh vật. Giống như enzyme, chúng có tính đặc hiệu cơ
chất khác nhau. Một số có tính đặc hiệu gần như tuyệt đối. Chẳng hạn,
permease của galactose ở E.coli chỉ vận chuyển galactose. Các permease
của các đường và acid amin khác thể hiện tính đặc hiệu yếu hơn đối với
các chất hòa tan.
Điều đáng chú ý là trong vi khuẩn sự vận chuyển chủ động của hầu
hết các loại đường phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa và hệ thống
enzyme phosphotransferase. Hệ thống này bao gồm hai enzyme EI, EII và
một protein vận chuyển bền nhiệt (Hpr: heat stable carried protein) có khối
lượng phân tử thấp. Các thành phần protein của hệ thống này đã được
thuần khiết và phản ứng diễn ra theo hai bước.

Trước hết EI chuyển phosphate từ phosphoenolpyruvate (PEP) đến
Hpr:
Hpr + PEP Hpr - P + Pyruvate
Sau đó EII chuyển phosphate từ Hpr - P đến C
6
của đường đơn.
EI là chung cho nhiều loại đường nhưng EII lại đặc trưng cho mỗi
loại đường. Nghĩa là một đột biến nào đó ảnh hưởng đến việc tổng hợp EI
sẽ dẫn đến mất khả năng vận chuyển nhiều loại đường. Trái lại với đột
biến như thế đối với EII chỉ ảnh hưởng đến sự vận chuyển của một loại
đường (hình 5.7).




112












Glucose

Hình 5.7 Sơ đồ vận chuyển đường qua màng tế bào vi sinh vật
pyruvic
Trong
Màng

E
II
glucose
E
II

Glucose- 6P
PEP

Hpr-P
Hpr
Ngoài

V. Trao đổi chất và năng lượng
1. Các nguồn năng lượng ở vi sinh vật
Tùy theo bản chất của nguồn năng lượng sơ cấp, có hai con đường
cơ bản để cung cấp cho vi sinh vật: con đường quang dưỡng và hóa
dưỡng. Trong cả hai trường hợp, sự thu nhận năng lượng của tế bào được
liên hệ với sự vận chuyển electron qua màng, do đó tạo ra một gradient
electron proton từ phần này đối với phần kia của màng tế bào chất. Chính
gradien nồng độ ion là nguồn gốc của lực bơm proton (sự khác biệt điện
tích) có thể được dùng vào những mục đích khác nhau như vận chuyển
tích cực, sản xuất các chất giàu năng lượng, chuyển động v.v .
Trong thế giới vi sinh vật có sự khác biệt rất lớn về khả năng sử
dụng các nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn hiếu khí cũng giống như

động vật có khả năng tổng hợp ATP cho mình từ đường bị phân giải theo
con đường đường phân (glycolyse) và chu trình Krebs nhờ chuỗi hô hấp
trên màng tế bào chất (tương tự như chuỗi hô hấp ở màng trong của ty
thể).
Còn những vi sinh vật kị khí lại thu năng lượng cho hoạt động sống
của mình nhờ quá trình lên men của các loại đường hoặc nhờ một loại
chuỗi vận chuyển electron trong đó có sử dụng các hợp chất không phải là
ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng trong chuỗi vận chuyển. Ở
đây, chuỗi vận chuyển cũng khu trú trên màng tế bào chất tương tự như
chuỗi vận chuyển nằm trong các ty thể. Đối với các cơ thể quang dưỡng
thì lại khác, chúng có thể thu nhận năng lượng của ánh sáng.

113
Đứng về quan điểm năng lượng sinh học, thì ty thể, lục lạp và tế bào
vi khuẩn có nhiều nét tương đồng. Tất cả các vi khuẩn có trên màng tế bào
chất một hệ enzyme ATP - synthetase tương tự như ATP - synthetase của
các ty thể và lục lạp. Phức hợp protein vận chuyển qua màng đảm bảo
biến đổi dòng proton thành năng lượng trong mối liên kết phosphate ở
dạng ATP.
1.1.Các cơ thể quang dưỡng (phototroph) và quang tổng hợp
(photosynthesis)
Hình thái của cơ thể quang dưỡng và quang tổng hợp giữa vi khuẩn,
tảo, thực vật có sự khác biệt rõ ràng. Mặt khác, cấu tạo các cơ quan quang
hợp, sắc tố quang tổng hợp, cũng khác biệt (xem chương II). Đối với thực
vật, chất cho electron là H
2
O và quá trình quang hợp giải phóng ôxy phân
tử. Đối với vi khuẩn quang hợp không thải ôxy và chất cho electron là
những hợp chất vô cơ (như H
2

S, S) hoặc hợp chất hữu cơ (isopropanol)
(xem thêm chương VII).
1.2. Các cơ thể hóa dưỡng và ôxy hóa sinh học
Phần lớn vi khuẩn không có cơ quan và sắc tố quang hợp. Chúng lấy
năng lượng hữu ích cho các quá trình tổng hợp của tế bào nhờ giải phóng
năng lượng trong các phản ứng hóa học.
Sự trao đổi chất của các cơ thể hoá dưỡng nói chung bao gồm 3 giai
đoạn:
- Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào.
- Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi trung gian
(pyruvate, acetyl - CoA) và tạo năng lượng hữu ích (ATP).
- Phân giải triệt để các chất trao đổi trung gian thành CO
2
và H
2
O
với việc tạo ra lượng lớn ATP. Đó là những phản ứng ôxy hóa cơ chất hữu
cơ và vô cơ.
Quá trình ôxy hóa một cơ chất A có thể xem là một chuỗi phản ứng
mà trong đó cơ chất A mất đi các eletron của mình. Cơ chất A gọi là chất
cho electron sẽ biến thành một sản phẩm được ôxy hóa. Tương tự, một
hợp chất B khác gọi là chất nhận electron sẽ biến thành sản phẩm khử.
Trong phần lớn trường hợp, một hợp chất A là một chất hữu cơ có
thể xem là chất được hydro hóa, như vậy thì quá trình ôxy hóa về thực
chất là một quá trình khử hydro (dehydrogenation), trong khi đó quá trình
khử là quá trình hydro hóa (hydrogenation), tổ hợp hai quá trình này là
quá trình ôxy hóa khử (oxidoreduction).
Quá trình ôxy hoá:

114

- 2H+
AH
2
(chất cho hydro) A (sản phẩm ôxy hoá) + Năng lượng
- 2e
Quá trình khử:
+ 2H+
B (chất nhận hydro) BH
2
(sản phẩm khử)
+ 2e
Kết quả:
AH
2
+ B A + BH
2
+ Năng lượng

Trong chuỗi phản ứng, việc vận chuyển hydro hay electron từ cơ
chất sang chất nhận được thực hiện nhờ hàng loạt enzyme, các enzyme
này tạo thành chuỗi vận chuyển điện tử.
Các chất xúc tác thích ứng cao với quá trình ôxy hoá cơ chất là
những dehydrogenase. Những enzyme này đặc trưng cho một loại cơ chất
và tổ hợp với các coenzyme mà nó đóng vai trò là chất nhận hydro từ cơ
chất. Đó là các dẫn xuất của flavin (FMN, FAD) hoặc của pyridine (NAD,
NADP) và nhiều hợp chất khác. Ở các cơ thể hiếu khí, sự vận chuyển các
electron giữa coenzyme của dehydrogenase và ôxy phân tử được thực hiện
nhờ các hợp chất trung gian của cytochrome.
2. Các kiểu hô hấp
Thông thường khi chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử thì

gọi là quá trình hô hấp hiếu khí và vi sinh vật thuộc dạng này gọi là vi sinh
vật hiếu khí (aerobes). Khi chất nhận electron cuối cùng là một cơ chất
khác không phải là ôxy tự do, thì người ta gọi là quá trình lên men hoặc có
thể là quá trình hô hấp kị khí và vi sinh vật thực hiện các quá trình này gọi
là các cơ thể kỵ khí (anaerobes).
Trong số các cơ thể kỵ khí, chất nhận electron có thể là chất hữu cơ
hoặc chất vô cơ. Nếu chất nhận electron là chất hữu cơ người ta gọi là lên
men, nếu chất nhận là electron là chất vô cơ người ta gọi là hô hấp kỵ khí
(anaerobic respiration).
Hô hấp của một cơ thể hiếu khí là một quá trình vận chuyển electron
và proton qua màng với ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn
“hô hấp kỵ khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các
electron và proton đến chất nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxy
phân tử, như nitrate trong trường hợp hô hấp nitrate (nitrate respiration),
fumarate như hô hấp fumarate (fumarate respiration ) v.v

115
Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng
hoạt động, hoặc được hoạt động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định.
Ví dụ như ở E. coli, vi khuẩn đường ruột này có chuỗi vận chuyển
electron với ôxy phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động
như cơ thể hiếu khí ) và chuỗi “hô hấp nitrate” hoạt động kỵ khí trong
môi trường nitrate, một chuỗi “hô hấp fumarate”, hoạt động kỵ khí trên
môi trường chứa cơ chất hữu cơ mà vi khuẩn này có thể lên men.
Hô hấp được đặc trưng trước hết là nơi khu trú của chuỗi vận
chuyển electron ở màng tế bào chất đối với các cơ thể nhân sơ và ở màng
trong của ty thể đối với các cơ thể nhân chuẩn. Hô hấp còn đặc trưng ở
bản chất của chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử. Sự ôxy hoá cơ
chất và đồng thời sự khử của ôxy được thực hiện nhờ một chuỗi phản ứng
enzyme, trong đó có sự tham gia của dehydrogenase và các coenzyme liên

kết với nó.
Cơ chế thường thấy ở hô hấp là con đường của các cytochrome gián
tiếp. Ngày nay người ta hoàn toàn biết rõ thành phần và cơ chế hoạt động
của các cytochrome này trong tế bào nhân chuẩn và trong một số cơ thể
nhân sơ.
Bên cạnh quá trình phosphoryl ôxy hoá cơ chất, còn tồn tại những
con đường khác, đặc biệt là con đường ôxy hoá trực tiếp nhờ các enzyme
vận chuyển các electron từ cơ chất đến ôxy với sự tạo thành H
2
O
2
.
FADH
2
+ O
2
FAD- oxydase FAD + H
2
O
2
Hợp chất này rất độc và cần phải được phân giải nhờ catalase,
peroxydase hoặc superoxyd dismutase tránh cho tế bào khỏi bị chết.
H
2
O
2
catalase H
2
O + 1/2 O
2

H
2
O
2
+ 2H
+
+ 2e
-

peroxydase 2H
2
O

Những con đường này tạo rất ít hoặc không tạo năng lượng hữu ích.
Một vi khuẩn không có enzyme trên, nhưng con đường phân giải trên buộc
chúng phải sống kỵ khí bắt buộc, bởi vì ôxy phân tử là tác nhân gây độc
với chúng. Có một số vi khuẩn chịu được hiếu khí như Streptococcus,
chúng không có catalase, nhưng có các enzyme flavin (NAD - oxydase và
NAD - peroxydase) cho phép chúng thực hiện sự cân bằng trong hô hấp ở
màng tế bào chất. Tuỳ thuộc vào số lượng và lượng các enzyme có thể
phân giải H
2
O
2
mà quyết định tính hiếu khí hay kỵ khí ở các vi khuẩn.
Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong
tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở
phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ

116

cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP). Về phương
diện trao đổi năng lượng, đây cũng là một quá trình ôxy hóa khử, nhưng
chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là
các phân tử ôxy. Quá trình này cũng giải phóng năng lượng nhưng ít hơn
nhiều so với quá trình hô hấp. Các hợp chất cho electron (AH
2
) và chất
nhận electron (B) đều là các hợp chất hữu cơ. Việc vận chuyển electron
được thực hiện nhờ NAD. Ở đây có sự khác biệt rõ rệt so với hô hấp về
bản chất của chất vận chuyển electron về sản phẩm cuối cùng
Cơ chế vận chuyển electron trong quá trình lên men được tóm tắt
như sau:
AH
2
NAD
+
BH
2


A NADH
2
B
3. Nghiên cứu sự trao đổi năng lượng
Sự khác biệt về các phản ứng ôxy hóa khử ở các nhóm vi sinh vật
khác nhau là một tiêu chuẩn dùng để định loại chúng, một số nhà nghiên
cứu đề xuất những phương pháp và môi trường có thể định loại nhanh
chóng và đơn giản các nhóm vi sinh vật.
3.1 Nghiên cứu kiểu hô hấp
Để xác định kiểu hô hấp của một loại vi khuẩn, trong phòng thí

nghiệm người ta sử dụng môi trường VF (nước thịt - gan) đã chế đặc và
đưa vào ống nghiệm, rồi cấy giống vào sâu, dựa vào khả năng phát triển
trong các ống nghiệm ta biết được đó là loại hô hấp gì.
3.2 Dùng phản ứng oxydase
Phản ứng này cho phép sự có mặt của chuỗi hô hấp đang hoạt động
với cytochrome C ở màng nhờ TMPD (tetra - methyl - paraphenylene -
diamine). Phản ứng này đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn G
-
, phản ứng
dương tính với các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc (trừ Pseudomonas
maltophyla và Acinatobacter), phản ứng âm tính đối với các vi khuẩn kị
khí không bắt buộc trừ các Vibrio và Aeromonas. Đặc biệt đối với các vi
khuẩn đường ruột là có phản ứng âm tính mặc dù vi khuẩn này có chuỗi
hô hấp với các cytochrome.
3.3 Thử catalase
Enzyme catalase thường có ở các vi khuẩn G
-
, trừ các giống
Streptococcus và Lactobacilus. Khi có mặt H
2
O
2
, một vài giọt huyền phù
vi khuẩn có catalase dương sẽ làm sủi bọt giải phóng ôxy phân tử. Nếu:

117
- Sủi nhiều bọt: đó là huyền phù vi khuẩn hiếu khí
- Sủi ít bọt: vi khuẩn hiếu - kị khí
- Không có bọt: vi khuẩn kị khí
3.4 Phản ứng nitrate reductase

Sự khử nitrate có thể được nghiên cứu trên môi trường có nitrate
(môi trường lỏng hoặc đặc) để phát hiện sự có mặt của nitrite (nhờ thuốc
thử Griess), có thể dẫn đến 2 kết quả theo 2 cơ chế khác nhau:
- Khử nitrate đồng hóa được xúc tác bởi nitrate reductase B tạo
nitrite, chất này có thể được chuyển hóa tiếp thành muối ammon là nguồn
nitơ dễ được cơ thể sử dụng.
- Khử nitrate dị hóa hay “hô hấp nitrate” dưới ảnh hưởng của nitrate
reductase A và các enzyme khác, các nitrate sẽ được khử hoàn toàn thành
N
2
O và N
2
sẽ được giải phóng ngoài tế bào. Hô hấp nitrate là loại hô hấp
kị khí.
3.5 Nghiên cứu kiểu trao đổi chất
Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sử dụng glucose làm cơ chất,
loại đường được dùng phổ biến nhất ở nhiều loại vi khuẩn. Thí nghiệm
cần nuôi cấy ở 2 điều kiện hiếu khí và kị khí. Sau khi nuôi ở tủ ấm với
nhiệt độ thích hợp, có thể có 4 trường hợp xảy ra:
- Vi khuẩn lên men khi có giống phát triển trong canh trường và làm
acid hóa trong 2 ống nghiệm.
- Vi khuẩn ôxy hóa khi nó chỉ làm acid hóa trong ống nghiệm ở điều
kiện hiếu khí.
- Vi khuẩn bất hoạt khi không thấy acid hóa trong cả 2 ống nghiệm.
- Vi khuẩn kiềm hóa khi thấy môi trường bị kiềm hoá trong điều
kiện hiếu khí, điều này có thể thấy khi dùng peptone.
3.6 Khử các sản phẩm lưu huỳnh
Thí nghiệm khử các sản phẩm ôxy hóa của lưu huỳnh (sulfate,
sulfite, thiosulfate v.v ) có thể thấy rõ nhờ tạo ra hydro được lưu huỳnh
hóa (H

2
S ) phát hiện dưới dạng sulfua kim loại bị đen (sulfua sắt hay
sulfua chì ).
3.7 Đo mức độ hô hấp
Hô hấp kế (Respirometre) Warburg là dụng cụ đầu tiên dùng để xác
định mức độ sử dụng ôxy của tế bào sống. Nó bao gồm một bình cách
thủy chịu nhiệt để mẫu cần nghiên cứu. Mẫu này được đặt trong một bình
chứa nối với một áp kế, bình chứa mẫu và áp kế tạo thành một nhánh được

118
cố định chắc chắn trên ống có mức nước di động, sự di chuyển ở đây là do
sự giao động của mẫu nghiên cứu gây nên.
Bình chứa mẫu được nối với một nhánh của bình cong của áp kế và
được điều chỉnh để có một dung tích khí nhất định ở phần trên của mẫu
nghiên cứu. Để loại bỏ ảnh hưởng của CO
2
sinh ra trong quá trình hô hấp,
người ta đặt một ống nhỏ giữa bình đựng mẫu nghiên cứu, trong đó, chứa
KOH 10% để hấp thụ CO
2
do quá trình hô hấp sinh ra. Sự thay đổi áp suất
trong áp kế sẽ được tính chuyển nhờ dung tích ôxy tiêu thụ.
Với dụng cụ hô hấp kế này không những dùng để đo sự tiêu thụ ôxy
phân tử mà còn có thể nghiên cứu các phản ứng enzyme khác nữa, trong
đó sự thay đổi khí xuất hiện do khử carbonic, khử amin hóa.
4. Sự tích trữ và sử dụng năng lượng
4.1. Các mối liên kết giàu năng lượng
Tế bào sống tích trữ năng lượng vào các hợp chất và chúng có thể
được giải phóng dễ dàng khi tế bào cần. Phản ứng hóa học phổ biến là
thủy phân mối liên kết esterphosphate. Hợp chất được tế bào sử dụng

thuận lợi và thường xuyên nhất là ATP. Ngoài ra còn có các hợp chất giàu
năng lượng khác như các nucleotide UTP, GTP, CTP, TTP; các
acylphosphate, ví dụ như 1-3 diphosphoglycerate; các enolphosphate như
PEP; các acyl - thio - ester như CoA - SH.
CH
2


R - C - O ∼ P
Ví dụ: PEP (G = - 53,5 Kj.mole
-1
)
+ Các acyl - thioester: O

R - C - S ∼ P Ví dụ: Coenzyme A
4.2. Nguồn gốc hợp chất cao năng
ATP có thể được tổng hợp bằng hai cơ chế:
- Quá trình phosphoryl hóa cơ chất xảy ra trong tế bào chất.
- Quá trình phosphoryl hóa liên hệ với gradien electron và proton
xảy ra ở màng tế bào chất, ở đây người ta thấy có quá trình phosphoryl
ôxy hóa và phosphoryl quang hóa (photophosphorylation).
Trong cả hai trường hợp quá trình tổng hợp ATP phụ thuộc vào
lượng ADP và phosphate vô cơ.

119
+ Quá trình phosphoryl hóa cơ chất: trong quá trình này, một
phosphate vô cơ được liên kết (nhờ xúc tác bởi enzyme) với các sản phẩm
của sự phân giải. Hợp chất ôxy hóa là chất mang một mối liên kết
phosphate giàu năng lượng và có thể được chuyển đến ADP. Kiểu hình
thành ATP này thường thấy ở sự phân giải glucose theo con đường EMP

(giai đoạn ôxy hóa 3 - phosphoglyceraldehyd thành acid 1,3-
diphosphoglyceric và sự biến đổi hợp chất này thành acid pyruvic).
+ Quá trình phosphoryl hóa cũng liên hệ với gradien proton. Cả khi
vận chuyển electron trong quá trình hô hấp (hiếu khí hoặc kị khí) cũng
như trong quang hợp đã tạo ra một gradien proton quan trọng và nó là
năng lượng dự trữ (có thể được so với một tụ điện được nạp sẵn), năng
lượng dự trữ này có thể được thu hồi bằng cách để lại các proton một bên
màng mà người ta thường so sánh như một động cơ sản sinh ATP.
5. Sự trao đổi carbohydrate
5.1. Sự phân giải carbohydrate
Carbohydrate nếu ở dạng hợp chất có trọng lượng phân tử lớn phải
được thuỷ phân thành các dạng đường đơn để có thể đi vào các con đường
phân giải đường để cung cấp năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của
cơ thể hoặc tạo ra các hợp chất trung gian cần cho sự chuyển hoá trao đổi
chất.
5.2. Sự tổng hợp carbohydrate
Tương tự như các thực vật bậc cao, vi sinh vật có khả năng tổng hợp
các oligo - và polysaccharide. Lượng các oligo - và polysaccharide nội bào
đạt tới 60% khối lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào có
thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một
lượng lớn polysaccharide.
Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo
dài chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosaccharide (X).
Đơn vị monosaccharide này tham gia vào phản ứng ở dạng nucleotide -
monosaccharide được hoạt hóa, thường là dẫn xuất của uridine -
diphosphate (UDP.X) nhưng đôi khi cùng với các nucleotide purine và
pirimidine khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung như sau:
X.X.X.X.X.X + UDP - X = X.X.X.X.X.X.X. + UDP
(n - nhánh) (n + 1 - nhánh)
Trong trường hợp polysaccharide bao gồm hai loại monosaccharide

liên tiếp (X và Y) phản ứng chung xảy ra qua hai bước:
Bước 1: X.Y.X.Y.X.Y + UDP - X = X.Y.X.Y.X.Y.X. + UDP

120
Bước 2: X.Y.X.Y.X.Y.X + UDP - Y = X.Y.X.Y.X.Y.X.Y + UDP
Con đường tổng hợp polysaccharide phân nhánh ta còn biết rất ít.
Trong dịch chiết tế bào của một số loài nấm sợi có chứa enzyme kitine -
sinthetase xúc tác phản ứng chuyển các nhánh N - acetylglucosamine từ
UDP - acetylglucosamine đến phân tử nhận. Một cách tương tự việc tổng
hợp mannan của thành tế bào nấm men cũng bao gồm việc chuyển các
nhánh mannose từ GDP - mannose đến chất nhận. Trong việc tổng hợp
tinh bột ở Chlorella và glycogen ở Arthrobacter có sự tham gia của ADP -
glucose.
- Tổng hợp glycogen: Khi có điều kiện ngoại cảnh hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn thì chúng có thể tích lũy glycogen nhờ hệ enzyme trùng
hợp các glucose. Glycogen tích lũy dưới dạng các hạt trong chất ngyên
sinh mà chúng ta có thể phát hiện bằng cách nhuộm màu với iode (hình
5.8).








Hình 5.8 Sơ đồ tổng hợp glycogen
- Tổng hợp levan và dextran: Các levan (poly β- 2,6-fructose) và
các dextran (poly α-1,6 glucose) với sự phân nhánh α - 1,3 hoặc α -1,4
được tổng hợp từ saccharose theo phản ứng sau:

n saccharose n glucose + (fructose)
n
n saccharose (glucose)
n
+ n fructose
Sự hình thành những hợp chất này chính là nguyên nhân của hiện
tượng nhầy nhớt khi nuôi cấy một số loại vi khuẩn trên môi trường giàu
saccharose. Các hợp chất polysaccharide cùng với hợp chất nitơ sẽ hình
thành nên glycopeptide của thành tế bào.
6. Sự trao đổi protein
6.1. Sự phân giải protein
Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Đây là
một trong những thành phần quan trọng của xác bã động vật, thực vật và
vi sinh vật. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa to lớn

121
đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên.
Người ta gọi quá trình phân giải này là quá trình ammon hóa
(ammonification).
Muốn phân giải protein, cũng như các hợp chất cao phân tử khác,
trước hết vi sinh vật phải tiết ra protease ngoại bào và chuyển hóa protein
thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (polypeptide, olygopeptide). Các
chất này tiếp tục được phân hủy thành acid amin nhờ các peptidase ngoại
bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển
hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng
trong tổng hợp protein, một phần khác được phân giải theo nhiều con
đường khác nhau để tạo NH
3
, CO
2

và nhiều sản phẩm trung gian khác.
Những vi sinh vật không có khả năng sản sinh các enzyme phân giải
protein ngoại bào sẽ không đồng hóa được các loại protein thiên nhiên.
Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thủy phân của protein.
Rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình ammon
hóa trong tự nhiên. Đáng chú ý là các vi sinh vật sau:
- Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B. subtilis, Proteus vulgais,
Pseudomonas aeruginosa, E. coli
- Xạ khuẩn và nấm: Streptomyces griseus, S. fradiae, Aspergillus
niger, A. awamori, Penicillium camemberti, Mucor spp.,
Trong cơ thể vi sinh vật, các acid amin thường được chuyển hóa nhờ
quá trình khử amin, quá trình khử carboxyl hoặc đồng thời vừa khử amin
vừa khử carboxyl.
Khi phân giải các acid amin tùy theo từng loại phản ứng sẽ tạo các
sản phẩm trung gian, đây là tiền chất cho các phản ứng sinh tổng hợp hoặc
cần thiết cho một số quá trình trao đổi chất, như sự tạo thành acid fumaric
từ acid aspactic:
HOOC- CH
2
- CH (NH
2
) - COOH HOOC-CH=CH-COOH+ NH
3

hay tạo α - ketoglutaric từ acid glutamic, acid acetic từ glycine, acid
succinic từ aspactic ). Trong quá trình khử amin thủy phân có sự liên kết
với các ion H
+
và OH
-

như sự tạo thành acid lactic từ alanine:
CH
3
-CH(NH
2
)-COOH + H
2
O CH
3
-CHOH-COOH + NH
3