Giáo trình di truyền học part 8 pps

164
thụ tinh như sinh sản hữu tính.
2. Phân tích bộ bốn và lập bản đồ ở vi nấm
Nấm men có nhiều đặc trưng để trở thành mô hình lý tưởng cho
nghiên cứu di truyền ở eukaryote. Nấm men là một eukaryote đơn bào,
chu kỳ sống chỉ khoảng 90 phút, có thể thu đuợc nấm men với số lượng
lớn khi nuôi trên môi trường đặc. Bộ gen của nấm men chứa khoảng 12
megabase với 6.000 gen phân bố trên 16 nhiễm sắc thể. Nấm men là
eukaryote đầu tiên được giải mã bộ gen.
Chu trình sống của nấm men gồm hai giai đoạn có thể chuyển đổi
qua lại. Tế bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng đơn bội.
Trong cả hai trường hợp, tế bào mẹ tạo chồi giống hệt nó. Những tế bào
lưỡng bội này có thể tiếp tục sinh trưởng bằng mọc chồi và có thể trãi qua
giảm phân tạo 4 bào tử đơn bội (haploid) trong một nang (ascus) được gọi
là tetrad. Bào tử đơn bội (haploid spore) của kiểu kết cặp khác nhau (a với
α) sẽ qua thụ tinh tạo thể lưỡng bội. Những bào tử của kiểu kết cặp giống
nhau sẽ tiếp tục sinh trưởng bằng nẩy chồi.
Nấm men được xem là E. coli của các tế bào eukaryote, có thể sử
dụng nấm men để phân tích đột biến. Tế bào nấm men đơn bội được gây
đột biến bằng tia X, sau đó sàng lọc các kiểu hình đột biến trên môi trường
nuôi cấy. Đầu tiên nuôi cấy tế bào nấm men trên môi trường giàu dinh
dưỡng để tất cả các tế bào phát triển. Đĩa nuôi cấy này sau đó được nhân
lên qua đĩa sao chép chứa môi trường chọn lọc hoặc điều kiện sinh trưởng
đặc biệt. Chẳng hạn, các đột biến nhạy cảm nhiệt độ có thể sinh trưởng
trên các đĩa gốc nhưng lại không sinh trưởng trên các đĩa sao chép ở nhiệt
độ giới hạn. So sánh các khuẩn lạc ở đĩa gốc với đĩa sao chép sẽ phát hiện
được những đột biến nhạy cảm với nhiệt độ.
Lớp nang khuẩn (Ascomycetes) có đặc điểm là khi các tế bào lưỡng
bội phân chia giảm nhiễm sẽ tạo ra các bào tử nằm trong một vỏ bao được
gọi là nang (ascus). Các cơ thể này có các đặc điểm thuận lợi cho phân

tích di truyền:
Các vi nấm có thể tồn tại ở dạng đơn bội, nên tất cả các gene có thể
biểu hiện trực tiếp thành kiểu hình.
Các vi nấm này có thể tạo ra số lượng cá thể lớn ở thế hệ sau nên có
thể phát hiện các sự kiện di truyền hiếm và có thể ước lượng được tần số
tái tổ hợp một cách chính xác.


165
Vòng đời
s.dưỡng
(đơn bội)
Giảm phân
Nảy chồi
Nảy chồi
Kết hợp hình thành hợp t

ử
Nảy chồi
Nang chứa 4 bào
tử túi dị hợp
Vòng đời
s.dưỡng
(đơn bội)
Vòng đời
s.dưỡng
(đơn bội)
Nảy chồi Nảy chồi
Dinh
dưỡng

Dinh
dưỡng
Hình thành bào tử
Thiếu nitrogen

Hình 7.2 Chu trình sống của nấm men.
Tế bào nấm men có thể sống ở dạng sinh dưỡng đơn bội hay dị bội. Tín hiệu
chuyển từ đơn bội sang dị bội xuất hiện theo dạng kết hợp và tín hiệu chuyển từ
dị bội sang đơn bội là sự giảm phân trong quá trình hình thành bào tử.
Trong chu trình sống, chỉ có hợp tử là lưỡng bội, sẽ trải qua giảm
phân ngay sau khi được tạo thành, tạo các bào tử đơn bội, bào tử nẩy mầm
hình thành giai đoạn cây. Ở một số loài các bộ bốn tạo thành trải qua một
lần phân chia nguyên nhiễm nữa để tạo ra từng cặp gồm hai bào tử giống
hệt nhau. Ở mốc vàng cam bánh mì (N. crassa), các bào tử xếp thảng hàng
trong nang theo một trật tự xác định liên quan trực tiếp đến tiến trình của
giảm phân (hình 7.3). Hầu hết các loại nấm mốc khác, sản phẩm của giảm
phân không sắp xếp theo một trật tự đặc biệt trong nang như mốc bánh mì.

166
Tế
chia sau khi
thành chro
bào phân
hình
matid
Giảm phân I
Giảm phân II
Nguyên phân

Hình 7.3 Mốc vàng cam bánh mì (Neurospora crassa) là mô hình nghiên cứu
phân li trong giảm phân
- Lập bản đồ di truyền bằng phân tích bộ bốn
Đối với trường hợp bộ bốn không theo thứ tự:
Ví dụ: khi lai các tổ hợp của hai gene AB × ab. Sự thụ tinh cho nhân
lưỡng bội AB/ab và nó chia giảm nhiễm ngay.
Nếu không có trao đổi chéo xảy ra hoặc trao đổi chéo đôi xảy ra trên cùng
hai chromatid thì sẽ có bộ bốn: 2 AB : 2ab, gọi là kiểu đôi cha mẹ
(parental ditype – PD).
Nếu trao đổi chéo xảy ra trên cả bốn chromatid của mỗi cặp nhiễm sắc thể
kép, sẽ có 2AB : 2aB, gọi là bộ bốn kiểu đôi không cha mẹ (Nonparental
ditype – NPD) hay còn gọi là kiểu đôi tái tổ hợp (Reconbinational ditype –
RD)
Trường hợp tạo ra mỗi nang bốn loại bào tử có kiểu gene khác nhau: 1AB
: 1Ab : 1aB : 1ab được gọi là kiểu bốn (tetratype)
Phân tích bộ bốn cho phép xác định hai gene liên kết. Khi hai gene không
liên kết thì tần số bộ bốn kiểu đôi bố mẹ và kiểu đôi không bố mệ bằng
nhau (PD = NPD). Ngược lại khi hai gene liên kết, kiểu PD có tần số lớn
hơn kiểu NPD. Tần số tương đối của các kiểu bộ bốn khác nhau được sử
dụng để xác định bản đồ khoảng cách giữa hai gene liên kết.


167

Parent ditype
Nonparent ditype
Tetratype
PD
NPD
T

Hình 7.4 Phân tích bộ bốn
3. Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính (tái tổ hợp trong
nguyên phân)
Nhiều loại nấm có sợi dinh dưỡng kết hợp với nhau, làm cho các
nhân đơn bội từ các dòng cùng ở chung trong tế bào chất. Các thể dị nhân
(heterocaryon) được tạo nên có thể tồn tại lâu dài như ở N. crassa. Sự tạo
thành các thể dị nhân được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tương tác
giữa các gene, giữa các allele và giữa các gene của nhân với tế bào chất.
Trong một số trường hợp, sự so sánh các dị hợp tử và dị nhân cho thấy sự
khác nhau trong tương tác giữa các allele, có lẽ do:
- Tỷ lệ số lượng nhân và tương ứng các allele trong thể dị nhân có thể

168
khác nhau
- Các allele của các gene ở một nhân không được ngăn cách như ở giữa
các thể dị nhân.
Các nhân ở thể dị nhân đôi khi hợp nhau tạo nên đoạn lưỡng bội.
Hơn nữa trong quá trình chia nguyên phân tiếp theo, nhân lưỡng bội có thể
chịu tác động của hai quá trình: đơn bội hoá hoặc tái tổ hợp nguyên phân.
3.1. Sự đơn bội hoá (Haploidisation)
Sự đơn bội hoá có thể xảy ra ngẫu nhiên hoặc được gây tạo bởi chất
n-fluorphenylalanin.
Nếu như các nhân trong nhiều nguyên phân bị 1 nhiễm sắc thể (2n –
1) thì nhân lệch bội vừa xuất hiện trở nên không ổn định và tiếp tục mất
các nhiễm sắc thể khác của một bộ đơn bội, cho đến khi trở thành nhân
đơn bội (n) ổn định. Trong quá trình đó nhiễm sắc thể bị mất độc lập nhau,
các gene của cùng một nhiễm sắc thể có sự liên kết hoàn toàn. Dựa vào
đặc điểm này có thể xác lập sự liên kết dựa vào gene đánh dấu trên mỗi
nhiễm sắc thể.
3.2. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic recombination)

Tái tổ hợp trong nguyên phân là hiện tượng thường gặp ở nhiều sinh
vật, khi xảy ra trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng trong
nguyên phân.
Trong trường hợp này khoảng cách của gene đánh dấu xa tâm động
nhất, sự đồng hợp tử hoá thường xảy ra hơn cả (được coi là 100%) và sự
phân bố các gene được tính theo công thức:
D = Nab/Nb x 100%
D: khoảng cách của gene đến tâm động
Nb - tổng số các dạng phân li, đồng hợp tử theo b.
Nab - số các dạng phân li đồng hợp cả a và b, nếu như b là gene đánh
dấu xa tâm động nhất.
Bản đồ liên kết gene được xây dựng bằng tái tổ hợp giảm phân và tái
tổ hợp nguyên phân (trong chu trình cận hữu tính) có thứ tự gene xếp
giống nhau ở Aspergillus nidulans.
III. Nấm men như là E. coli của các tế bào eukaryote
1. Các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC)
Để xây dựng nhiễm sắc thể nhân tạo có chức năng như một phần bộ
gene của tế bào, để đảm bảo sự phân chia của nhiễm sắc thể cần có tâm
động (centromere). Thứ hai, phần đầu mút của nhiễm sắc thể thẳng dài

169
được giữ nguyên vẹn khi đưa vào tế bào, tránh được sự phân giải của
nuclease nhờ đoạn trình tự DNA lặp lại đặc biệt và phức hợp protein bao
đầu nhiễm sắc thể là telomere. Cuối cùng, DNA phải sao chép trước khi tế
bào phân chia vì vậy để nhiễm sắc thể nhân tạo sao chép phải có ít nhất
một điểm xuất phát sao chép.


c.
Đặc điểm

- Không thể sao chép tự động
- Điểm gắn vào ở vùng tương
đồng là LEU2
- Mỗi tế bào có một phiên bản
- Sao chép tự động
- Mỗi tế bào có nhiều phiên bản
- Sao chép tự động
- Mỗi tế bào có một phiên bản
- Phân ly trong giảm nhiễm như
là một nhiễm sắc thể
Plasmid
LEU2
ARS
CEN
b.
a.
Ori 1
AMP
Ori 2
AMP
Ori 2
LEU2
Ori 2
LEU2
Hình 7.5 Plasmid của nấm men
a. YIp: không chứa ori và không thể sao chép tự động
b. YEp: chứa điểm ori 1 và sao chép tự động
c. YCp: chứa tâm động và phân ly trong quá trình giảm phân
LEU2: gen nấm men, Ori 1: xuất phát sao chép của plasmid nấm men, Ori 2:
xuất phát sao chép của vi khuẩn, AMP: gen kháng kháng sinh của vi khuẩn

Vào những năm 1980, các nhà di truyền học phân tử đã đưa ra 3 yếu
tố chìa khóa cho một nhiễm sắc thể: centromere, telomere và điểm xuất
phát sao chép và sử dụng vật liệu từ tế bào nấm men là plasmid để cấu tạo
nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo.
Cho đến nay, ở eukaryote chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất đó
là plasmid vòng tròn 2 μm dài khoảng 6300 cặp base có nhiều trong tế bào

170
nấm men Saccharomyces cerevisiae. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều
bước tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men, gọi là YAC (yeast
artificial chromosome), có chứa các trình tự nucleotide quan trọng:
ARS (autonomously replicating sequence): trình tự sao chép tương tự ori
ở plasmid. CEN (centromere): trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi
và đi về 2 cực của tế bào như tâm động. 2 TEL (telomere): hai trình tự duy
trì hai đầu mút nhiễm sắc thể thẳng mà không bị cắt, vẫn sao chép và phân
chia

Chỉ cắt bằng EcoRI
Hình 7.6 NST nhân tạo của nấm men
TEL: telomere của nấm men, ARS 1: trình tự sao chép tự động, CEN 4: tâm
động của NST, URA 3 và TRP 1: các gen marker của nấm men, Amp: gen kháng
Ampicillin của pBR322, ori: điểm xuất phát sao chép của pBR322.
2. Những hiểu biết mới về tổ chức của các nhiễm sắc thể của nấm men
Nấm men là cơ thể eukaryote đơn bào, bộ máy di truyền của nó
giống với tế bào của cơ thể bậc cao. Các điểm xuất phát sao chép, tâm

171
động và telomere được xác định là một đoạn DNA nhỏ, tự do. Tế bào nấm
men đơn bội có 16 nhiễm sắc thể trong nhân, xếp thành dãy có chiều dài
khoảng 235.000 đến hơn 2 triệu bp. Tất cả có cấu trúc theo cùng bản đồ

chi tiết. Mỗi nhiễm sắc thể chứa một tâm động. Hai đầu nhiễm sắc thể
chứa đoạn lặp lại dài theo sau trình tự telomere ngắn. Trên nhiễm sắc thể
có chứa nhiều điểm xuất phát sao chép, ở cách nhau khoảng 30-40 kb.
Nhiễm sắc thể nấm men cũng tạo thành các đơn vị là các nucleosome chứa
lõi histon gồm H
2
A, H
2
B, H
3
và H
4
.
Điện di trên gel với trường dao động (pulse field gel
electrophoresis), tách ra những nhiễm sắc thể nguyên vẹn và lập được
karyotype phân tử của nhiễm sắc thể nấm men. Dựa vào karyotype có thể
quan sát được các biến đổi chủ yếu trong cấu trúc nhiễm sắc thể. Qua
karyotype cho thấy, nhiễm sắc thể số I dài khoảng 235 kb là nhiễm sắc thể
nấm men nhỏ nhất. Nhiễm sắc thể số XII lớn nhất với kích thước khoảng
2060 – 3060 kb, sự khác nhau về kích thước của nhiễm sắc thể này do số
lượng gen của rRNA lặp lại với số lượng khác nhau, thường dao động
khoảng 100 – 200 bản sao ở những chủng khác nhau. Trình tự DNA của
nấm men được giải mã 100% vào tháng 4/1996.



Tâm động
a.
b.
Đoạn gần cuối

lặp lại
NST
Điểm khởi sự
sao ché
p
30 - 40 kb
Đoạn cuối

Hình 7.7 Nhiễm sắc thể nấm men
a. Các thành phần của NST. Mỗi sợi chứa 1 tâm động, nhiều điểm khởi sự sao
chép, các đoạn gần cuối lặp lại và đoạn cuối của chuỗi DNA.
b. Hệ gen của NST nấm men trên hình ảnh điện di.
Bản đồ di truyền của nấm men được xác định bằng phân tích bộ bốn.
Một đơn vị chức năng của tần số tái tổ hợp trong giảm phân khoảng 4400
cM, trung bình khoảng 3 kb/cM. Khoảng cách di truyền tỷ lệ với khoảng
cách vật lý. Bản đồ di truyền của nấm men dài khác thường so với bản đồ
di truyền của các nấm khác. Ví dụ: Neurospora crassa có cùng hàm lượng
DNA như nấm men nhưng bản đồ di truyền chỉ dài khoảng 15% bản đồ di
truyền của nấm men. Số lượng gene mã hoá protein của nấm men ít hơn
khoảng 6 – 10 lần số lượng gene của người. Từ khi chương trình giải mã

172
genome nấm men hoàn thành vào năm 1996, không thể nói chính xác có
bao nhiêu gene mã hoá cho protein ở nấm men. Số lượng gene mã hoá
protein của nấm men khoảng 6.000 – 6.500 gene ở nấm men.
3. Những hiểu biết mới về tái bản và phiên mã của bộ gen nấm men
Nấm men có thể hoàn thành một chu trình sao chép và phân chia
khoảng 1,4 giờ. Xuất phát điểm cho sao chép DNA của nấm men gồm
nhiều điểm giống với oriC của E. coli. Đó là vùng giàu AT được tách ra
khi có một protein khởi động gắn vào điểm kề bên. Các điểm xuất phát

sao chép dài hàng ngàn đến hàng chục ngàn nucleotide. Khác với
prokaryote, mỗi nhiễm sắc thể eukaryote có nhiều điểm xuất phát sao chép
để quá trình sao chép genome của eukaryote có kích thước lớn hơn nhiều
xảy ra một cách nhanh chóng. Có khoảng 400 điểm xuất phát sao chép
phân bố trên toàn bộ 16 nhiễm sắc thể của nấm men. Sự sao chép xảy ra
trực tiếp trên nhiều điểm xuất phát sao chép. Sợi mạch kép được tạo thành
ở mỗi điểm xuất phát sao chép kéo dài và nối với sợi kép được tạo thành ở
một điểm khác. Khi sao chép trên 2 mạch đơn hoàn thành sẽ tạo ra 2 phân
tử DNA con giống hệt nhau.
Sự tổng hợp DNA chỉ xảy ra ở một giai đoạn trong chu trình tế bào,
đó là pha S. Ở nấm nấm men có 3 protein cần cho lắp ráp của replisome.
Đó là phức hợp DNA polymerase phối hợp hoạt động ở chẽ ba sao chép.
Phức hợp nhận biết điểm xuất phát (Origin recognition complex – ORC)
sẽ gắn vào trình tự xuất phát của nấm men như DnaA protein của E. coli.
Những phức tương tự được tìm thấy ở tất cả các eukaryote. Sự có mặt của
ORC làm bổ sung thêm 2 protein khác, Cdc6 và Cdt. Cả 2 protein này và
ORC làm kích hoạt helicase và những thành phần khác của replisome. Sự
gắn vào của helicase được xem là sự “xác nhận” (license) cho điểm xuất
phát, giúp lắp ráp replisome và bắt đầu tổng hợp DNA.
Trong số các gene mã hoá protein, intron chỉ có khoảng 4-5% tất cả
các gene của nấm men (276 gene chứa một intron đơn và 7 gene chứa 2
intron riêng rẽ), kích thước trung bình của intron khoảng 2000 nucleotide.
Tần số thấp của intron ở nấm men có lẽ liên quan với tần số thấp của các
gene giả (pseudogene) giống như intron, phổ biến ở eukaryote bậc cao.
Gene giả chứa trình tự mã hoá, nhưng vì thiếu intron và promoter phiên
mã nên trình tự mã hoá không được biểu hiện.
Gene mã hoá protein không chỉ là những dạng gene chức năng.
Genome của nấm men chứa số lớn gen tạo ra RNA không mã hoá, bao
gồm các gene lặp lại mã hoá cho rRNA, 274 gene của tRNA, trong đó có
80 gene chứa nhóm intron đặc biệt, 71 RNA nhân nhỏ (snRNA) tham gia

chức năng chế biến rRNA, 5 snRNA tham gia chế biến intron, một vài

173
RNA chưa biết chức năng và 3 RNA như là các tiểu đơn vị chức năng của
enzyme Rnase, endoribonuclease và telomere.
4. Những hiểu biết mới về ADN ty thể của nấm men
DNA ty thể (mitochondrial DNA – mtDNA) nấm men dài 4 lần hơn
DNA ty thể của người và những động vật khác. Hai yếu tố trên DNA ty
thể nấm men được cho là có kích thước lớn hơn so với các đối tượng khác:
trình tự giữa các gene (intergenic) và intron. Trình tự dài, giàu A-T của
vùng đệm “spacer” tách biệt với các gene của mtDNA. Hầu hết DNA của
spacer đều được dịch mã và một số trong chúng được duy trì trên mRNA
như đầu 5’ và 3’ kéo dài, không dịch mã. Yếu tố thứ hai là intron, chiếm
khoảng 25% genome ty thể nấm men và nó được xem là tạo ra sự khác
nhau về kích thước giữa mt DNA của nấm men và người.

RNA
tái tổ
RNA tái tổ
hợp nhỏ

hợp lớn

Hình 7.8 DNA ty thể nấm men

Câu hỏi và Bài tập
1. Hãy trình bày sự sinh sản vô tính của Chlamydomonas reihardii.
2. Hãy cho biết các kiểu dung hợp ở vi nấm.
3. Sự xác định giới tính ở vi nâm như thế nào? Cho ví dụ.
4. Các kiểu bộ bốn nào được tạo ra do dòng nấm men lưỡng bội có kiểu

174
gene AB/ab, nếu A và B liên kết hoàn toàn?
5. Trong 100 chu trình giảm nhiễm của Neurospora theo cách bình
thường có bao nhiêu bào tử được tạo thành?
6. Ý nghĩa của phân tích bộ bốn trong nghiên cứu di truyền.
7. Trình bày cấu tạo NST nhân tạo nấm men và ứng dụng của chúng.
8. Một chủng kháng kháng sinh của nấm men được phân lập, cho kết
cặp với một chủng hoang dại nhạy cảm với kháng sinh tạo thể lưỡng
bội. Sau khi sinh sản một vài thế hệ, chúng được kích thích để sinh
bào tử. Kết quả thu được bộ bốn nguyên phân chứa 8 bào tử gồm 4
bào tử kháng kháng sinh và 4 bào tử nhạy cảm kháng sinh. Hãy kết
luận về sự di truyền của tính kháng kháng sinh.

Tài liệu Tham khảo
1. Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục.
2. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB GD.
3. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ
xa, Đại học Huế
4. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin,
William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An
introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers.
5. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press.
London, UK.
6. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000.
Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control.
ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America.
7. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone
and Bartlett Publshers, Toronto, Canada.
8. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor.

The McGraw-Hill Companies.
9. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation.
Blackwell Scientific Publication.
10. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of
genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America.
11. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R.
2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San
Francisco, United States of America.

175


Chương 8
Di truyền Vi sinh vật và Công nghệ Gene
Các nghiên cứu của di truyền vi sinh vật về các enzyme giới hạn và
plasmid cũng như việc sử dụng chúng để tạo ra các phân tử DNA tái tổ
hợp đầu tiên trong ống nghiệm (in vitro) trong những năm đầu của thập
niên 1970 là cơ sở cho sự ra đời của công nhgệ sinh học hiện đại: kỹ thuật
di truyền (genetic engineering) - công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant
DNA technology). Sự ra đời và phát triển nhanh chóng của lĩnh vực này
không những đã đưa lại sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và các cơ chế hoạt
động của các gene và bộ gene mà còn trở thành lực lượng sản xuất trực
tiếp của xã hội, góp phần giải quyết những vấn đề thực tiễn đặt ra trong y-
dược học, nông nghiệp và môi trường.
Trong chương này chúng ta sẽ tìm hiểu: (i) Các công cụ thiết yếu của
kỹ thuật di truyền; (ii) Các phương pháp cơ bản của việc xây dựng DNA
tái tổ hợp in vitro; (iii) Tạo dòng gene ở vi khuẩn; (i) Phóng thích ra môi
trường các sinh vật được biến đổi gene; (vi) Sử dụng các vi sinh vật để
chuyển gene vào các thực vật và động vật; (vi) Tạo giống vi sinh vật mới
bằng kỹ thuật di truyền và một số ứng dụng khác của kỹ thuật di truyền.

I. Các công cụ thiết yếu của kỹ thuật di truyền
1. Các enzyme cắt giới hạn và một số enzyme khác
1.1. Các enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease)
Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi
khuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được
đưa vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và
hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít
trường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản
trong tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó
dưới sự kiếm soát của tế bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu
khi các phage lây nhiễm các tế bào vi khuẩn.
Công trình nghiên cứu đầu tiên xác nhận các tế bào vi khuẩn là những
hệ thống chứa các enzyme sửa đổi và enzyme cắt giới hạn thuộc về Daniel
Nathan và Hamilton Smith năm 1969 ở Haemophilus influenzae (giải
Nobel năm 1978; Hình 8.2). Đây là một trong những khám phá đầu tiên
cho phép phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp. Các enzyme này đều có
đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại
lai, nhưng có vai trò khác nhau. Các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai


176


trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl ở một số base
nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đích (recognition/ target
sequence). Trong khi các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá
hoạt tính của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc thù chừng
nào nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ.
Như vậy, enzyme cắt giới hạn là các enzyme đặc thù của vi khuẩn có
khả năng nhận biết và cắt DNA sợi kép tại các vị trí đặc thù, và được coi

là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của
các phage lạ hoặc DNA ngoại lai (Hình 8.1).
(a) (b)

Các vị trí
được bảo vệ
DNA phage bị cắt đoạn NSTvi khuẩn
Enzyme
giới hạn
Hình 8.1 (a) D.Nathan (trái) và H.Smith. (b) Enzyme giới hạn cắt vụn DNA của
phage lạ khi nó xâm nhập vào tế bào vi khuẩn.
* Tính chất của các enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện được ở các vi khuẩn mà không có ở
các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn được biểu thị bằng
ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết
xuất. Chữ cái đầu tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp
theo viết thường để chỉ loài (species), và nếu cần thêm chữ cái thứ tư để
chỉ nòi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme của
cùng một nòi dùng thêm số La Mã kèm theo sau (xem Bảng 8.1).
Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị
trí (specificity), nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc
thù để cắt ở vị trí xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà
chia ra hai loại chính: loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài
phạm vi đoạn nhận biết và loại II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên
trong đoạn nhận biết. Ở đây chúng ta chỉ xét các enzyme giới hạn loại II
vốn được xem là công cụ thiết yếu cho phép thao tác các gene trong kỹ
thuật DNA tái tổ hợp (hình 8.2).
Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn 4-8 cặp
base và có tính đối xứng xuôi ngược (palindrome).
Các enzyme giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt: cắt lệch và cắt thẳng.

177


Với kiểu cắt lệch, tạo ra các đoạn DNA có các đầu sợi đơn gồm một số
base bổ sung gọi là các đầu dính (cohesive/sticky ends); ví dụ BamHI,
HindIII và EcoRI. Với kiểu cắt thẳng, tức cắt cùng vị trí trên cả hai sợi của
DNA sợi kép, tạo ra các đoạn DNA có các đầu bằng (blunt ends); ví dụ
AluI, Hind II và SmaI. Các enzyme giới hạn này, đặc biệt là loại đầu, có
vai trò to lớn trong việc xây dựng các phân tử DNA tái tổ hợp in vitro
(Hình 8.2). Tất cả các đặc tính trên có thể minh hoạ ở sơ đồ sau:

Ngoài ra, các enzyme giới hạn có đoạn đích giống nhau mặc dù vị trí
và kiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, được gọi là các enzyme giới hạn
tương ứng (isoschizomers); ví dụ, SmaI và XmaI (Bảng 8.1).
Bảng 8.1 Các trình tự nhận biết và vị trí cắt của các enzyme giới hạn được
chọn lọc (mũi tên chỉ vị trí cắt; các trình tự ở đây được chỉ ra trên sợi 5'→3')
Nguồn vi sinh vật Tên enzyme Trình tự nhận biết
Arthrobacter luteus
AluI AG↓CT
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC
Escherichia coli RY13 EcoRI G↓AATTC
Haemophilus influenzae Rd HindII GTPy↓PuAC
Haemophilus influenzae Rd HindIII A↓AGCTT
Nocardia otitidis-caviarum
NotI GC↓GGCCGC
Providencia stuartii
PstI CTGCA↓G
Serratia marcescens

SmaI CCC↓GGG
Xanthomonas malvaccarum
XmaI C↓CCGGG
1.2. Một số enzyme khác thường dùng trong kỹ thuật di truyền
Bên cạnh các enzyme giới hạn là các enzyme chủ chốt trong lĩnh vực
công nghệ DNA tái tổ hợp nói trên, còn có nhiều enzyme khác. Tựu trung
có ba nhóm chính:
(i) Các DNA polymerase và RNA polymerase, kể cả các enzyme phiên
mã ngược (reverse transcriptase): được sử dụng khi cần tạo ra một số
lượng lớn các bản sao của các nucleic acid. Chẳng hạn, tạo các vật dò
(probe), xác định trình tự nucleotide, tổng hợp mồi, oligonucleotide và
DNA bằng PCR hoặc các cDNA và các gene từ các RNA,


178


(ii) Các ligase xúc tác các phản ứng nối các đầu 3' và 5' của các đoạn
DNA sợi đơn (DNA ligase) hoặc các đoạn RNA (RNA ligase), được sử
dụng trong kiến tạo DNA tái tổ hợp và tạo dòng nói chung. Đó là các
DNA ligase của E. coli; các DNA ligase, RNA ligase và polynucleotide
kinase của phage T4;
(iii) Các nuclease thuộc nhóm các enzyme phân cắt DNA (DNase)
hoặc RNA (RNase) một cách không đặc thù như các enzyme giới hạn đã
nói ở trên. Nhóm này bao gồm các enzyme DNase I tạo các "vết nứt"
(nick) trên DNA trong kỹ thuật đánh dấu mẫu dò, phát hiện các gene trong
chất nhiễm sắc; các nuclease S1 có khả năng cắt DNA sợi đơn nên được
dùng để loại bỏ các vòng trong tổng hợp cDNA hoặc để tách bỏ các đầu
mút sợi đơn so le trong các DNA; các exonuclease III của E. coli có hoạt
tính exonuclease 3' → 5' được dùng để tạo các cấu trúc sợi đơn ở một số

vùng trên phân tử DNA hoặc gây các đột biến mất đoạn tại các vùng đặc
biệt khi phối hợp với nuclease S1
2. Các vector
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là phân tử DNA được tạo ra trong
ống nghiệm bằng cách kết hợp các DNA từ các nguồn (loài) khác nhau,
theo một quy trình kỹ thuật nhất định, gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA.
Thông thường một phân tử DNA tái tổ hợp bao gồm một phân tử DNA
có bản chất là plasmid hoặc phage nguyên vẹn gọi là vector (thể tải) và
một đoạn DNA từ nguồn khác mang một gene hoặc yếu tố điều hòa mong
muốn được cho xen vào; nó được gọi là DNA ngoại lai (foreign DNA).
Vector là phân tử DNA có kích thước bé hoặc vừa phải, đóng vai trò là
vật trung gian mang truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tế
bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đường biến nạp (transformation)
hoặc tải nạp (transduction).
Có hai loaị vector thông dụng là các plasmid hoặc các phage.
Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiều ưu
thế nhất, bởi lẽ ở phần giữa của bộ gene có chứa một số gene không quan
trọng và không liên quan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen
đoạn DNA mong muốn vào đây. Các phage không chứa các gene kháng
thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các
vết tan dương tính (positive plaques) trên nền vi khuẩn.
Các plasmid của vi khuẩn tồn tại độc lập với nhiễm sắc thể trong tế
bào vi khuẩn (Hình 8.2). Chúng được sử dụng rộng rãi hơn cả, nhờ có các
đặc điểm sau: (i) Mỗi plasmid là một phân tử DNA sợi kép thường ở dạng
vòng và chỉ có một khởi điểm tái bản riêng; (ii) Có khả năng xâm nhập


179

vào tế bào vật chủ và hoạt động bình thường; (iii) Có kích thước bé,
thường chỉ vài ngàn cặp base nên dễ dàng tinh chiết; (iv) Số bản sao trong
mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao; (v) Một số plasmid có chứa các gene
kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi và phát hiện sự có mặt của plasmid
tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ.
Nói chung, các plasmid được tái bản bởi cùng một bộ máy tái bản
dùng cho nhiễm sắc thể vi khuẩn. Một số plasmid được sao chép với cùng
tỷ lệ như nhiễm sắc thể vi khuẩn, vì vậy trong một tế bào chỉ có một bản
sao của plasmid. Các plasmid được sao chép độc lập với nhiễm sắc thể ở
một tỷ lệ cao, vì vậy một tế bào có thể có nhiều hơn 50 bản sao mỗi loại.
Các gene trên các plasmid có mặt nhiều lần thông thường được biểu
hiện ở mức cao. Về bản chất, các gene này thường mã hoá cho các protein
(ví dụ như các enzyme) bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tác động của một hoặc
nhiều chất kháng sinh. Và như đã đề cập ở chương 5, các plasmid đi vào
các tế bào vi khuẩn tương đối dễ dàng. Điều này xảy ra trong tự nhiên và
có thể lý giải cho phạm vi và mức độ kháng các chất kháng sinh cao ở các
bệnh viện và mọi nơi. Các plasmid vì vậy được sử dụng một cách hiệu quả
trong các thí nghiệm biến nạp và tạo dòng ở các tế bào vi khuẩn.
Dưới đây ta hãy xét đặc điểm trúc của các plasmid vi khuẩn và một số
eukaryote đơn bào thường được sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp.
Plasmid pUC19 được xây dựng từ pBR322 và khởi điểm (ori) từ
pBR322 bắt nguồn từ plasmid pMB9. Vùng ký hiệu ORI trên hai plasmid
pBR322 và pUC19 là giống nhau, nhưng pUC19 có nhiều hơn 100 bản
sao trong mỗi tế bào E. coli trong khi pBR322 có khoảng 20 bản sao trong
mỗi tế bào (Hình 8.2).
EcoRI
Sal I
gene kháng
ampicillin
gene kháng

tetracycline
Pst I
ori
pBR322

Hình 8.2A Các plasmid pBR322 và pUC19. Ở đây cho thấy kích thước, khởi
điểm (ORI) và các vùng chứa gene kháng ampicillin và tetracyclin (Amp, Tet)
cũng như các gene của lac operon (ở pUC19). Hình pBR322 bên trái cho thấy vị
trí cắt của một số enzyme giới hạn trong các gene kháng ampicillin và
tetracyclin.
Ở hình 8.2B cho thấy cấu trúc chi tiết của các plasmid pUC19 (2.686


180


bp) và M13 mp 18 (7.253 bp).


Hình 8.2B Cấu trúc chi tiết của các plasmid pUC19 và M13 mp 18.
Sau đây là một số ví dụ khác về các plasmid pAMP và pKAN.
(1) Plasmid pAMP có kích thước 4539 bp, có một khởi đỉêm tái bản
riêng, một gene amp
r
kháng ampicillin, một trình tự 5'GGATCC3' được
nhận biết và cắt bởi enzyme giới hạn BamHI và một trình tự 5'AAGCTT3'
cho enzyme HindIII (Hình 8.3).
Việc xử lý pAMP bằng hỗn hợp của BamHI và HindIII sẽ sinh ra cả
hai đoạn có các đầu dính với đặc điểm sau: một đoạn 3755 bp mang cả
gene amp

r
và khởi điểm tái bản và một đoạn 784 bp.


181


(2) Plasmid pKAN có 4207 bp, một Ori riêng, một gene kan
r
có khả
năng kháng kanamycin, một vị trí cắt độc nhất bởi BamHI, một vị trí cắt
độc nhất bởi HindIII (Hình 8.3).
Việc xử lý pKAN bằng hỗn hợp của BamHI và HindIII sẽ sinh ra cả
hai đoạn có các đầu dính với đặc điểm sau: một đoạn 2332 bp và một đoạn
1875 bp với gene kan
r
(nhưng không có Ori).

Các khởi điểm tái bản
Vị trí
BamHI
Vị trí
BamHI
Vị trí
HindIII
Hình 8.3 Các plasmid có chứa khởi điểm tái bản (Ori), các điểm cắt của một số
enzyme cắt giới hạn và các gene kháng ampicillin (Amp
R
), kanamycin (Kan
R

).
Các đoạn này có thể quan sát được bằng cách cho hỗn hợp được phân
cắt chạy điện di (electrophoresis) trong gel agarose. Do sự tích điện âm
của các nhóm phosphate, DNA di chuyển về phía cực dương (anode) khi
cho mẫu chạy điện di. Các đoạn càng bé sẽ di chuyển càng xa trong bản
gel (Hình 8.4). Khả năng nối các đoạn DNA này trong kỹ thuật tái tổ hợp
in vitro chúng ta sẽ xét trở lại ở phần sau.

Hình 8.4 Mẫu điện di hỗn hợp các đoạn DNA của pAMP và pKAN (được cắt
bởi BamHI và HindIII) trong gel agarose.
Ë Các plasmid ở các vi sinh vật eukaryote
Như đã biết, các plasmid không chỉ giới hạn ở các vi khẩn. Chẳng hạn,
một số plasmid đã được nghiên cứu rộng rãi ở nấm men và được phát triển


182


thành các vector tạo dòng nấm men. Các plasmid này cũng đã được sử
dụng như là một "hệ thống đơn giản" để tìm hiểu cơ chế và sự điều hoà tái
bản DNA ở các tế bào eukaryote.
Một plasmid nấm men được quan tâm là vòng 2μ (2μ circle). Vòng 2μ
nay là một yếu tố nhiễm sắc thể phụ, mạch vòng 6,3 kb thấy có trong nhân
của hầu hết các nòi Saccharomyces cerevisiae. Nó không cung ứng cho tế
bào mang nó bất kỳ một lợi thể rõ ràng nào, nhưng nó được duy trì ổn
định ở khoảng 50 đến 100 bản sao trong mỗi bộ gene đơn bội của các tế
bào nấm men. Giống như các nhiễm sắc thể vật chủ, vòng 2μ được bao bởi
các nucleosome và tái bản được khởi đầu một lần trong mỗi lần phân bào
bằng các enzyme tái bản của vật chủ. Khởi điểm tái bản hai hướng được
bắt đầu tại một vị trí đặc thù gọi là trình tự tái bản tự trị ARS

("autonomous replication sequence").


Vòng 2
μ
Hình 8.5 Plasmid vòng 2μ ở nấm men.
Ở hình 8.5 cho thấy vòng 2μ có chứa trình tự ARS, gene FLP, ba gene
mã hoá các protein cần thiết cho điều hoà sự biểu hiện của gene FLP
(REP2, REP1 và D), và một bộ các đoạn lặp nhỏ cùng chiều (gọi là
"STB") cần cho sự phân chia về các tế bào con trong quá trình nguyên
phân và giảm phân.
II. Các phương pháp cơ bản của việc xây dựng DNA tái tổ hợp
in vitro
1. Phương pháp sử dụng các đầu dính
Bất kỳ đoạn DNA nào nếu được cắt bởi cùng một loại enzyme giới
hạn (ví dụ, EcoRI) cho các đầu dính thì có thể dính líp lại với nhau và
được nối bởi DNA ligase (hình 8.6). Phương pháp thành lập phân tử DNA
tái tổ hợp kiểu này lần đầu tiên được đưa ra bởi J.Mert và R.Davis năm
1972 bằng thực nghiệm trên các virus. Và sau đó, lần đầu tiên năm 1973,
H.Boyer và nhóm nghiên cứu của S.Cohen đã tạo ra được phân tử DNA
tái tổ hợp gồm vector là plasmid nhỏ pSC101 của E. coli và DNA ''ngoại


183


lai'' là một plasmid khác. Chính sự kiện này đã đặt nền móng và mở ra
triển vọng to lớn cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp sau này.

các đoạn DNA nối

ở các đầu dính
đầudính
đầu dính
DNA tái tổ hợp
+ DNA ligase
Hình 8.6 Hai phân tử DNA khác nhau được cắt bởi cùng một enzyme giới hạn
EcoRI tạo ra các đầu dính bổ sung nhau, bằng cách đó có thể khâu nối thành
phân tử DNA tái tổ hợp in vitro nhờ xử lý với DNA ligase.
2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng hợp các đầu bổ sung
Đối với các đoạn DNA được tạo ra bằng cách xử lý enzyme giới hạn
cắt thẳng như HindII chẳnghạn, thì việc nối các đoạn DNA có đầu bằng
được tạo ra có thể thực hiện theo hai cách sau: Nối trực tiếp bằng DNA
ligase của phage T4 hoặc tổng hợp thêm các đầu dính vào các đầu 3' một
số nucleotide bổ sung bằng cách sử dụng các enzyme end-transferase, rồi
sau đó các đoạn DNA như thế sẽ được nối với nhau bởi DNA ligase của vi
khuẩn. Cơ sở của phương pháp kết hợp DNA này được thực hiện lần đầu
tiên giữa DNA của virus SV40 với DNA của phage λ bởi L.Lobban và
D.Kaiser (1972), và D.Jackson và P.Berg (1972)
III. Tạo dòng gene ở vi khuẩn
Về nguyên tắc, kỹ thuật DNA tái tổ hợp hay tạo dòng (cloning) gồm
các bước chung nhất như sau: (1) Tách chiết và tinh sạch DNA thuộc các
nguồn khác nhau (gồm vector và DNA mang gene mong muốn); (2) tạo ra
phân tử DNA tái tổ hợp in vitro; (3) đưa phân tử DNA tái tổ hợp vào trong
tế bào nhận, thường là E. coli hoặc nấm men. Hình 8.7 mô tả một quy
trình kỹ thuật đơn giản như thế. Tuy nhiên, trên thực tế, sự phức tạp là ở
bước (4), phát hiện và phân lập các dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu.


184

Các đoạn cắt bởi enzyme giới hạn
DNA ngoại lai
Nốicác đầu dính
Enz
y
me
g
iớih
ạ
n


Plasmid
ổ hợp
tái t
Biến nạp
Tế bào chủ
E
. col
i
Tế bào được biến nạp
Hình 8.7 Một quy trình kỹ thuật di truyền sử dụng vector là plasmid, các
enzyme cắt và nối là EcoRI và DNA ligase, và tế bào nhận là E. coli.
Trong tế bào chủ, phân tử DNA tái tổ hợp có thể biểu hiện gene mong
muốn (cho sản phẩm protein) hoặc tái bản độc lập nhiều lần để tạo ra hàng
loạt bản sao của nó, và khi tế bào chủ phân chia sẽ kéo theo hiện tượng tạo
dòng phân tử (molecular cloning). Mặt khác, do tốc độ phân chia rất
nhanh của các vi khuẩn nên có thể tạo hàng triệu bản sao mong muốn. Vì
thế nhà khoa học có thể tách dòng bất kỳ một gene nào để dùng cho

nghiên cứu hoặc cho sản xuất trên quy mô công nghiệp một số lượng lớn
các protein vốn là những chế phẩm y-sinh học nào đó.
1. Phân lập và tách chiết DNA ngoại lai
Bây giờ ta xét một quy trình kỹ thuật tạo dòng mà việc phát hiện DNA
tái tổ hợp dựa trên khả năng kháng thuốc do vector plasmid mang lại.
Giả sử đã tinh chiết được plasmid có chứa hai gene kháng ampicilline
và tetracycline, ký hiệu là Amp
R
và Tet
R
; và cũng giả thiết rằng gene Tet
R

có chứa điểm cắt của EcoRI, và phân tử DNA người có mang gene insulin.
2. Kiến tạo phân tử DNA tái tổ hợp in vitro
Trước tiên, dùng enzyme giới hạn đầu dính EcoRI (xem Bảng 8.1) để
cắt vòng plasmid tại giữa gene Tet
R
và cho cắt DNA người, trong số các


185


đoạn bị cắt có một đoạn mang gene insulin. Sau đó đem trộn lẫn hai loại
DNA trên trong ống nghiệm với DNA ligase. Kết quả là có thể xảy ra ba
trường hợp: (1) Plasmid tự nối lại thành mạch vòng như lúc đầu; (2) Đoạn
DNA tự nối lại thành mạch vòng; và (3) Plasmid tái tổ hợp có mang gene
insulin, và có thể mang một đoạn DNA không phải gene đó.
3. Chọn lọc vật chủ thích hợp và chuyển các gene vào các tế bào chủ

Đưa các DNA được xử lý vào các tế bào E. coli. Nếu phân tử có kích
thước lớn người ta phải xử lý vi khuẩn 'thể nhận' bằng chlorid calcium
(CaCl
2
) để làm cho màng trở nên thấm được dễ dàng. Sau đó đem cấy
riêng rẽ các vi khuẩn trên môi trường có ampicillin và theo dõi.

gene
Amp
R
DNA người
gene insulin
đầu dính
Biến nạp
Đặt các vi khuẩn lên môi trường
có bổ sung ampicilline
Chỉ có các vi khuẩn chứa DNA
tái tổ hợp sinh trưởng được
Nuôi cấ
y
Tinh chiết
DNA
gene Tet
R
Tạo dòng
Dòng
Lai hoá +
DNA ligase

Tế bào vi khuẩn

NST
vi khuẩn
DNA tái tổ hợp

Hình 8.8 Sơ đồ thí nghiệm tạo dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp có chứa
gene insulin người.
+ Nếu có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn có mang gene Amp
R
,
tức là chúng có mang plasmid ban đầu (trường hợp 1) hoặc plasmid tái tổ
hợp (trường hợp 3). Ngược lại, nếu chỗ cấy không xuất hiện khuẩn lạc,


186


chứng tỏ vi khuẩn mang DNA tự nối (trường hợp 2).
+ Kế đó, đem cấy riêng rẽ các vi khuẩn thu được sang môi trường có
tetracycline. Nếu có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn có mang gene
Tet
R
nguyên vẹn (trường hợp 1). Nếu không có khuẩn lạc, chứng tỏ vi
khuẩn đem cấy có mang DNA tái tổ hợp (trường hợp 3); vì gene Tet
R
bị
bất hoạt do đoạn DNA xen vào. Bằng cách theo dõi như vậy cho phép xác
định được dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp, nhưng vẫn chưa biết được
đâu là các dòng đặc hiệu, nghĩa là có mang gene insulin.
Hình 8.8 mô tả một quy trình đơn giản về tạo dòng vi khuẩn mang
gene insulin người.

4. Xác định các vi khuẩn tái tổ hợp
Về nguyên tắc, trong cả triệu phép thử mới có một tế bào mang gene
mong muốn. Với trường hợp trên đây chẳng hạn, người ta có thể sử dụng
phương pháp miễn dịch học bằng cách dùng kháng thể chống lại protein
được sinh ra bởi dòng vi khuẩn tương ứng (tức huyết thanh tìm gene
kháng insuline). Nói chung, để tìm dòng lai đặc hiệu người ta sử dụng các
mẫu dò là mRNA đặc hiệu.

Hình 8.9 Xác định dòng vi khuẩn mang plasmid có xen đoạn mDNA đặc hiệu.
Chẳng hạn, trong trường hợp nếu cần chọn dòng lai mang đoạn mRNA
cụ thể, người ta đem cấy đều các dòng vi khuẩn có chứa DNA tái tổ hợp
lên trên mặt thạch của hộp petri chứa môi trường nuôi cấy. Sau đó đóng
dấu lên màng lọc nitrocellulose, và thu được bản sao. Việc xử lý bản sao
bằng NaOH sẽ làm cho các tế bào vi khuẩn tan vỡ tại chỗ (in situ), và các
DNA thoát ra từ chúng sẽ bị biến tính (các sợi đơn tách rời nhau) và dính
vào màng lọc. Sau đó đem nhúng màng lọc này vào mẫu mRNA tương