Phát hiện vi khuẩn salmonella bằng phương pháp realtime PCR

i

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

LỜI CẢM ƠN


Với tất cả chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS.
Phạm Thu Thủy và TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt
những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học
và Môi trường cùng quý thầy cô giáo trong Viện đã tận tình dạy bảo, truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, giúp tôi có một nền tảng vững chắc để bước
vào đời.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình, bạn bè và những người
thương yêu tôi, luôn bên cạnh an ủi và động viên tôi giúp tôi có thêm sức mạnh để
vượt qua những khó khăn và có niềm tin vào cuộc sống.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Minh Nhật, bạn Phạm Thị Huế
lớp 49 SH và 2 em Lê Thị Vân và Nguyễn Thị Ngọc Bích lớp 50 SH đã nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Nha Trang, tháng 07 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Hà

ii

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI NÓI ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 3
1.1.1. Phân loại Salmonella 3
1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella 4
1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella 7
1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella 9
1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella 11
1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra 14
1.2.1.Trên thế giới 14
1.2.2. Ở Việt Nam 15
1.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella 16
1.3.1. Phương pháp PCR 17
1.3.2. Phương pháp Realtime PCR 19
1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 22
1.4.1. Tính cấp thiết của đề tài 22

1.4.2. Mục tiêu của đề tài 22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu 24
2.1.1. Mẫu 24
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 24
2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 24
2.2. Nội dung nghiên cứu 30
2.3. Phương pháp nghiên cứu 31
iii

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

2.3.1. Phân lập và nuôi cấy Salmonella 31
2.3.2. Nhuộm Gram 34
2.3.3. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard
®
SV Genomic DNA Purification System
35
2.3.4. Xác định nồng độ DNA bằng điện di gel agarose và đo OD 36
2.3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella 38
2.3.6. Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella 40
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 43
3.2. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram 46
3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 47
3.3.1. Khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella 47
3.3.2. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella 50
3.4. Tách chiết DNA tổng số 51
3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52
3.5.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52

3.5.2. Kết quả chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 53
3.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ mồi invA1,2 55
3.5.4. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 56
3.6. Phản ứng Realtime PCR khuếch đại đoạn gen invA 57
3.6.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 57
36.2. Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 58
3.6.3. Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại 60
3.6.4. Kết quả xây dựng đường chuẩn Realtime PCR phát hiện Salmonella 62
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65



iv

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Bp : Base pair
BPW : Nước pepton đệm (Buffer Pepton Water)
CFU : Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit)
DNA : Deoxyribonucleic Acid
dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate
dsDNA : Double Strand Deoxyribonucleic Acid
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
ELISA : Kỹ thuật miễn dịch men (Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay)
FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (Food and Drug Administration)
LDC : Lysine Decarboxylase

MR : Methyl Red
OD : Mật độ quang (Optical Density)
PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)
PE : Polyethylene
RNA : Ribonucleic Acid
RV : Rappaport – Vassilisdis
SPI : Hệ thống gen gây độc (Salmonella pathogenicity island)
TBE : Tris Boric acid EDTA
TE : Tris EDTA
TNF : Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)
TSA : Tryptone Soya Agar
VP : Voges – Proskauer
WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

v

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella 4
Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella 7
Bảng 1.3. Kháng nguyên của một số chủng Salmonella 9
Bảng 1.4. Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen 12
Bảng 2.1. Các thông số của cặp mồi invA1,2 39
Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng 45
Salmonella phân lập được 45
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của các chủng
Salmonella 50

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn
Salmonella 51
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59















vi

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi 5
Hình 1.2. Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella 8
Hình 1.3. Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S. typhimurium 13
Hình 1.4. Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S. typhimurium 13

Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR 20
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 30
Hình 2.2. Quy trình phân lập Salmonella 32
Hình 3.1. Các chủng Salmonella sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường RV ở điều
kiện pH 7,4 và nhiệt độ 44
o
C 43
Hình 3.2. Các khuẩn lạc của Salmonellas sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường XLD
ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37
o
C 44
Hình 3.3. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn S2 sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường
TSA ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37
o
C 44
Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn S2 sau khi nhuộm Gram 47
Hình 3.5. Thí nghiệm lên men đường của các chủng vi khuẩn Salmonella 49
Hình 3.6. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 51
Hình 3.7. DNA tổng số của các chủng Salmonella 52
Hình 3.8. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 53
Hình 3.9. Kết quả khảo sát độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 54
Hình 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ mồi của cặp mồi invA1,2 56
Hình 3.11. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 57
Hình 3.12. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58
Hình 3.13. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59
Hình 3.14. Biểu đồ nóng chảy (Melt curve chart) của phản ứng Realtime PCR 61
Hình 3.15. Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Melt curve peak chart) của phản ứng Realtime
PCR 62
Hình 3.16. Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR 63

1


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

LỜI NÓI ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm hiện đang là vấn đề cấp thiết và đáng lo ngại của
toàn cầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng cao đặc biệt là các vụ ngộ độc
thực phẩm hàng loạt. Các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể là do tác
nhân sinh học (vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng ), tác nhân hóa học, tác nhân
vật lý hay do các tác nhân khác. Trong đó tác nhân sinh học là nguyên nhân phổ
biến và nguy hiểm nhất đặc biệt là các vi khuẩn và độc tố của chúng tiết ra. Chúng
không chỉ gây hại cho sức khỏe của người tiêu dùng một cách tức thì mà còn có thể
gây ra những hậu quả nghiêm trọng và lâu dài.
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có hơn 2.500
kiểu huyết thanh (serotype), là các trực khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí tùy ý,
có thể di động, có khả năng sinh hơi khi lên men dextrose. Chúng được tìm thấy
phổ biến trong các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như: các loại thịt,
trứng, hải sản và các sản phẩm từ chúng. Vi khuẩn này được xác định là tác nhân
gây nhiễm độc thức ăn nguy hiểm nhất hiện nay. Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn
ở người, Salmonella còn gây ra các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương
hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh
về đường hô hấp ở cả người và động vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe và nền kinh
tế của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Việt Nam.
Do vậy, việc phát hiện sớm Salmonella là rất cần thiết. Tuy nhiên ở Việt
Nam, việc phát hiện Salmonella hầu hết chỉ dựa trên phương pháp truyền thống:
nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch. Các quy trình này rất
phức tạp, độ nhạy thấp và đặc biệt là rất tốn thời gian ít nhất phải mất từ 2 đến 6
ngày. Đó cũng là lý do giải thích vì sao để tìm được nguyên nhân gây ra các vụ ngộ

độc thực phẩm phải mất cả tuần. Kỹ thuật Realtime PCR là kỹ thuật sinh học phân
tử mới được phát triển từ kỹ thuật PCR truyền thống có độ nhạy cao, vừa cho kết
quả định tính vừa kết quả định lượng và đặc biệt là rút ngắn thời gian phát hiện (<
24 giờ) so với các phương pháp truyền thống và các phương pháp sinh học dựa trên
2


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

PCR cổ truyền khác nhưng hiện nay ở nước ta chưa có một công trình nào về ứng
dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được
công bố.
Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng
phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:
 Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua
tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định
danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa.
 Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime
PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở
khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm.
 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định
lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra
lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm.

3


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

Chương 1. TỔNG QUAN


1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella
1.1.1. Phân loại Salmonella
a. Phân loại khoa học
Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Salmonella
Loài: Salmonella bongori & Salmonella enterica
b. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên
Ðến nay người ta đã xác định được hơn 2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi
Salmonella. Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S. enterica và S.
bongori. S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica (S.
enterica I), S. salamae (S. enterica II), S. arizonae (S. enterica IIIa), S. diarizonae
(S. enterica IIIb), S. houtenae S. enterica IV) và S. indica (S. enterica VI). Loài S.
bongori còn được gọi là Salmonella V ( Popoff, 2001).

Các kiểu huyết thanh này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White
dựa vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng
nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar
antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen) (Popoff, 2001; WHO, 2005). Kháng
nguyên O là chuỗi phức hợp lipopolysaccharide nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
Kháng nguyên H được tạo thành bởi các tiểu phần protein roi (flagellin). Sự đa
dạng về vùng giữa của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H. Một
số kiểu huyết thanh như là S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin còn có thêm kháng
4


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

nguyên vi. Đây là loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polysaccharide của vi
sinh vật, có liên quan đến tính độc riêng với tế bào chủ.
Các kiểu huyết thanh gây bệnh cho người và động vật máu nóng chủ yếu
nằm trong S. enterica I chiếm tới 99,5%. Dưới loài này có 1.478 kiểu huyết thanh.
S. enterica II có 498 kiểu huyết thanh, S. enterica IIIa có 94 kiểu huyết thanh, S.
enterica IIIb có 327 kiểu huyết thanh, S. enterica IV có 71 kiểu huyết thanh, S.
enterica VI có 12 kiểu huyết thanh và S.bongori (V) có 21 kiểu huyết thanh (Bảng
1.1).
Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella
(Nguồn: Popoff, 2001)
1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella
a. Đặc điểm hình thái của Salmonella
Năm 1880, Eberth là người đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella được
phân lập từ lát cắt lách, hạch bạch huyết của bệnh nhân sốt thương hàn dưới kính
hiển vi điện tử.

Loài Salmonella Dưới loài Số kiểu huyết thanh

S. enterica S. enterica (I) 1.487
S. salamae (II) 498
S. arizonae (IIIa) 94
S. diarizonae (IIIb) 327
S. houtenae (IV) 71
S. india (VI) 12
S. bongori (V) 21
Tổng

2.501
5


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà


Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi
(Tế bào vi khuẩn có hình que, có lông xung quanh )
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, là vi khuẩn
Gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 µm x 2 – 5 µm (Holt,
2002). Đa số các loài đều có khả năng di động mạnh do có lông xung quanh thân trừ
S. gallinarum và S. pullorum gây bệnh cho gia cầm. Vi khuẩn dễ nhuộm màu với
các thuốc nhuộm thông thường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, bắt màu
đều ở toàn thân hay đậm ở hai đầu.
b. Tính chất nuôi cấy
Salmonella vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt độ
thích hợp là 37
o
C nhưng có thể phát triển được từ 6 – 42
o

C, pH thích hợp là 7,6,
phát triển được ở pH từ 6 – 9 (Holt, 2002). Ở pH > 9 hoặc < 4,5 vi khuẩn có thể bị
tiêu diệt. Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: 50
o
C trong 1 giờ, 70
o
C trong 15
phút và 100
o
C trong 5 phút.
- Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc
tròn đều, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, hơi ướt và trông lóng lánh.
- Trên môi trường Macconkey: Ở 35 – 37
o
C sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn
mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa.
- Trên môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): Nuôi cấy ở nhiệt độ
37
o
C vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn bóng, lồi, có chấm đen ở giữa,
đế môi trường màu hồng đậm (Aspinall, 1992).
6


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

- Trên môi trường SS (Salmonella – Shigella): Ở nhiệt độ 35 – 37
o
C, sau 18 – 24
giờ vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, không màu, nhẵn bóng và có chấm đen

ở giữa.
- Trên môi trường KIA (Kliger – Iron – Agar): Vi khuẩn lên men đường glucose
và không lên men đường lactose, nên phần thạch nghiêng vẫn giữ màu đỏ, phần
thạch đứng đổi màu vàng, nếu vi khuẩn có sinh H
2
S môi trường màu đen, vi
khuẩn sinh hơi làm nứt thạch (Aspinall, 1992).
Ở một số loài như S. paratyphi B, S. cholerae suis khi nuôi cấy trên thạch
peptone dày, sau 1 – 2 ngày khuẩn lạc hình thành bờ có chất dính, chất keo bọc.
Trên thạch thường, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (Rough) nhám, mặt
trong mờ.
c. Đặc tính sinh hoá
Salmonella có những đặc tính sinh hoá chủ yếu mà dựa vào đó mà người ta
có thể định hướng và phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác. Mỗi loại
Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi. Phần lớn
các chủng Salmonella lên men có sinh hơi các loại đường như glucose, mantose,
mannitol, galactose, arabinose (WHO, 2010).
Một số loài Salmonella cũng lên men các đường trên nhưng không sinh hơi
như: S. abortus equi, S. abortus bovis, S. abortus ovis, S. typh suis, S. typhi,
Riêng S. pulllorum không lên men đường mantose, S. choleraesuis không lên men
đường arabinose. Hầu hết các Salmonella không lên men lactose, saccharose.
Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không
sản sinh indol, một số sử dụng được cacbon ở dạng citrat, phân giải xanh methylen,
phản ứng MR (Methyl red), catalase dương tính (trừ S. choleraesuis, S. gallinarum
và S. pulllorum), phản ứng H
2
S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. abortus equi, S.
typhi suis) (Funk và cs, 2000; WHO, 2003).

7


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella
Loài S. enterica
S.
bongori
Dưới loài
S.
enterica
S.
salmae
S.
arizonae
S.
diarizonae
S.
houtenae
S.
indica
Đặc điểm
sinh hóa

Sorbitol + + + + + - +
Glucose + + + + + + +
Saccharose - - - - - + -
Mannitol + + + + + + +

Lactose - - - (75%) +(75%) - d -
γ-Glutamyl-
tranferase
+
(*)
+ - + + + +
β-
Glucuroidase
d d - + - + -
KCN - - - - + - +
Galacturonae - + - + + - +
Mucate + + + - (70%) - d +
Salicine - - - - + - -
Dulciol + + - - - d +
ONPG (2h) - - + + - - -
LDC + + + + + + +
VP - - - - - - -
Malonate + + + + - - -
“*”: Trừ S. typhimurium và S. dublin
“+”: ≥ 90% phản ứng dương tính
“-”: ≤ 90% phản ứng âm tính
“d”: Cho kết quả khác nhau giữa các phản ứng
(Nguồn:
1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella
Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O); kháng
nguyên roi (H) và kháng nguyên vi. Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ lipopolysaccharide
gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn. Nội độc tố gồm 3 lớp:
lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A).

8

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà


(Nguồn: )
a. Kháng nguyên thân O
Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O (lipopolysaccharide) khác nhau.
Kháng nguyên O có cấu trúc dạng sợi lipopolysaccharide được bộc lộ trên bề mặt tế
bào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh. Kháng nguyên O gồm hai
phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang. Phần nhân cơ bản giống nhau
trong tất cả Salmonella. Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị oligosidic
lặp lại. Chính các chuỗi ngang này quyết định tính đặc hiệu của mỗi nhóm
Salmonella.
b. Kháng nguyên vi
Kháng nguyên vi là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vi khuẩn, nó
có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành. Chức năng chính của kháng
nguyên vi là khả năng kết dính, tương tác với vi khuẩn và với các nhân tố khác.
Kháng nguyên vi có ở một số kiểu huyết thanh như: S. typhi, S. paratyphi C và S.
dublin.

Kháng nguyên H
(Roi)
Màng trong
Lớp peptidoglycan
Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên O
Màng ngoài
Tua riềm
Nội bào

Hình 1.2. Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella
9


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

c. Kháng nguyên roi H
Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các
kiểu huyết thanh của Salmonella. Các protein này vừa tham gia chức năng cấu trúc
vừa có khả năng đáp ứng miễn dịch cao. Do đó kháng nguyên H được chọn làm đối
tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ cho việc tạo vacxin tái tổ
hợp.
Bảng 1.3. Kháng nguyên của một số chủng Salmonella
Chủng
Salmonella
Nhóm huyết
thanh
Kháng nguyên O
(somatic)
Kháng nguyên roi H
(flagella)
Phase 1 Phase 2
S. paratyphi A A 1 , 2, 12 a (1, 5)
S. typhimurium B 1, 4, (5), 12 i 1, 2
S. agona B 4, 12 f, g, s -
S. derby B 1, 4, (5), 12 f, g (1, 2)
S. typhi D 9, 12 (Vi) c 1, 2
S. enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7)
(Nguồn:
1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella

a. Khả năng gây bệnh
Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người hoặc chỉ gây
bệnh cho động vật, nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người và vừa gây bệnh
cho động vật. Trong đó những loài Salmonella có thể gây bệnh cho người được
quan tâm nhiều hơn cả. Ví dụ:
- S. typhimurium và S. enteritidis: Vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có
khả năng gây bệnh cho động vật, có thể gặp ở các nước khác nhau trên thế giới.
Chúng là căn nguyên chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do
Salmonella.
10


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

- S. typhi: Chỉ gây bệnh cho người, là vi khuẩn quan trọng nhất trong các căn
nguyên gây bệnh thương hàn (typhoid fever).
- S. paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương
hàn, tỷ lệ phân lập đứng sau S. typhi.
- S. choleraesuis: Là nguyên nhân thường gặp trong các ca nhiễm khuẩn huyết do
Salmonella ở nước ta.
- S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh cho người, nhưng cũng có thể gây bệnh cho
động vật. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập cao hơn ở nước ta.
- S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây
bệnh viêm dạ dày – ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường gặp ở các nước Đông
Nam Á.
b. Cơ chế gây bệnh thương hàn
Bệnh thương hàn (typhoid fever) do S. typhi và các S. paratyphi A, B, C gây
ra. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị
nhiễm bẩn. Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 10
5

đến 10
7
cfu/g.
Sau khi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non
rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột. Ở đây vi khuẩn nhân
lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm
sàng bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác, tới gan
theo mật đổ xuống rồi được đào thải qua phân; Tới thận, một số vi khuẩn được đào
thải ra ngoài theo nước tiểu.
Vi khuẩn thương hàn gây bệnh bằng nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần
kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị trí tổn
thương thường ở các mảng payer. Đây là biến chứng hay gặp do bệnh nhân ăn sớm
chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng.
Nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất
ba. Giai đoạn toàn phát thân nhiệt tăng cao, sốt “hình cao nguyên”. Thân nhiệt tăng
11


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

nhưng nhịp tim không tăng. Bệnh nhân thường có dấu hiệu li bì, có thể hôn mê,
trụy tim mạch, tử vong. Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng
lâm sàng khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại
trong túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài nhiều năm. Họ trở thành nguồn lây
bệnh rất nguy hiểm.
Bệnh phó thương hàn (paratyphoid fever) có những triệu chứng như bệnh
sốt thương hàn nhưng nhẹ hơn.
c. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn
Bệnh xảy ra thường là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm
bị nhiễm Salmonella. S. typhimurium và S. enteritidits là tác nhân chính gây ra các

vụ ngộ độc thực phẩm ở người. 75% các vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm như
hải sản, thịt, trứng bị nhiễm 2 chủng vi khuẩn này (Lee và cs, 2009).
Thời gian ủ bệnh trung bình kéo dài từ 10 đến 48 giờ. Đây là điểm khác
biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ vài
giờ. Sau thời gian ủ bệnh, bệnh nhân lên cơn sốt, nôn và ỉa chảy. Khác với sốt
thương hàn, bệnh nhân ngộ độc do nhiễm Salmonella chỉ sốt nhẹ có trường hợp
không có dấu hiệu sốt. Ở người lớn, rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ 2 đến 5
ngày rồi tự khỏi.
Một số rất ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn, có thể kéo dài
nhiều tháng.
1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella
Đến nay genome của nhiều chủng Salmonella đã được giải trình tự và công
bố (Bảng 1.4). Bộ gen của Salmonella dài hơn 4,5 Mbp trong đó thành phần GC
chiếm 50 – 52%. Genome của các chủng Salmonella không giống nhau khác nhau
ở chiều dài hệ gen và thành phần GC. Ví dụ như chiều dài hệ gen của S.typhi là
4.809.037 bp, trong đó thành phần GC chiếm 52,09% còn của S. typhimurium là
4.857.432 bp và 52%. Theo nghiên cứu gần đây nhất, hệ gen 2 chủng này khác
nhau 10 – 15%.




12


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

Bảng 1.4. Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen
Chủng huyết thanh (Serovar) Đơn vị thực hiện
Arizonae RSK2980 Đại học Washinton St. Louis

Bongori 12419 Sanger
Choleraesuis Đại học Chang Gum
Diarizonae CDC 01-0005 Đại học Washinton St. Louis
Dublin Salmonella.org
Enteritidis PT4 Sanger
Enteritidis PT8 Salmonella.org
Gallinarum 287/91 Sanger
Paratyphi A ATCC9150 Đại học Washinton St. Louis
Paratyphi B SPB7 Đại học Washinton St. Louis
Paratyphi C Shu-Lin Liu
Pullorum Salmonella.org
Typhi CT18 Sanger
Typhi TY2 Wisconsin
Typhimurium LT2 Đại học Washinton St. Louis
Typhimurium SL1344 Sanger
Typhimurium DT104 Sanger
(Nguồn: )

Genome của Salmonella có 5 hệ thống gen gây độc là SPI – 1 (Salmonella
pathogenicity island), SPI – 2, SPI – 3, SPI – 4 và SPI – 5. Tất cả các kiểu huyết
thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm
vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm
gen này nằm trong hệ thống gen SPI – 1 có mặt trong tất cả các Salmonella, từ
nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I.
InvA là một bản gen luôn có mặt trong cụm gen inv. Do vậy trong nhiều nghiên
cứu, gen invA được sử dụng để xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella (Rahn
và cs, 1992; Chiu và Ou, 1996; Daniele và cs, 2006). Ngoài gen invA người ta còn
13

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

sử dụng trình tự 16S rRNA (Fey và cs, 2004), agfA (Doran và cs, 1993), viaB
(Hashimoto và cs, 1995), spvR (Mahon và Lax, 1993), spvC (Chiu và Ou, 1996)
để phát hiện Salmonella.

Hình 1.3. Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S. typhimurium
(Nguồn:

Hình 1.4. Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S. typhimurium
(Nguồn:
invA
14


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra
1.2.1.Trên thế giới
Salmonella là một trong những chủng vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay.
Bất kỳ thực phẩm tươi nào có nguồn gốc từ động vật như thịt gia súc, thịt gia cầm,
sữa và các sản phẩm của chúng, hải sản cùng với một số rau, quả đều có thể nhiễm
vi khuẩn Salmonella (Malonry và cs, 2004). Salmonella có thể xâm nhiễm và gây
bệnh cho người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dưới nước và trên cạn.
Đây là nguyên căn chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm, bệnh thương hàn và
phó thương hàn ở nhiều quốc gia trên thế giới.
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới có
hơn 1,3 tỉ trường hợp bị nhiễm Salmonella trong đó xấp xỉ 3 triệu trường hợp tử
vong (Lee và cs, 2009).
Trong đó, chỉ tính riêng ở Mỹ, hàng năm có tới 1,34 triệu người nhiễm

Salmonella (Lee và cs, 2009). Trong số đó có 25,6% trường hợp phải nhập viện và
khoảng 30,6% trường hợp tử vong gây tổng thiệt hại kinh tế lên tới hàng tỉ USD.
Trong thời gian gần đây, các vụ ngộ độc hàng loạt do Salmonella liên tiếp xảy ra ở
Mỹ. Sau biến cố ngộ độc thực phẩm do cà chua nhiễm khuẩn Salmonella xảy ra vào
tháng 6 năm 2008 khiến trên 250 người mắc bệnh và làm một người chết, đến năm
2009, Salmonella lại xuất hiện trở lại trong các sản phẩm có chất bơ như bánh quy
giòn, các thanh kẹo và kẹo bơ đậu phộng của ít nhất 343 công ty thực phẩm ở 46
tiểu bang của Mỹ làm trên 400 người bị bệnh và ba người tử vong. Ngoài ra các
sản phẩm khác như trứng, xúc xích cũng bị nhiễm Salmonella với tỷ lệ rất cao, gây
ra các cơn đại dịch Salmonella ở đất nước này. Các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi
hơn 560 tấn xúc xích do Công ty Daniele International sản xuất do nghi bị nhiễm vi
khuẩn này. Đặc biệt là theo thống kê gần đây nhất của Trung tâm an toàn về Trứng
(Egg Safety Center) vào năm 2010 cứ 20.000 quả trứng ở Mỹ lại có một quả có
chứa vi khuẩn Salmonella (chiếm hơn 1% số lượng trứng tiêu thụ mỗi năm) trong
đó vi khuẩn S. enteritidis chiếm tỷ lệ cao nhất đã làm cho 1.300 người mắc bệnh
trong vòng từ tháng 5 đến tháng 7 nhiều gấp ba lần so với mức trung bình hằng
năm của giai đoạn này.
15


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

Cũng tương tự, ở Đan Mạch, theo thống kê năm 1995 có 2.911 trường hợp
nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và
các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này. Đến năm 2001, tổng chi phí để khắc
phục hậu quả do Salmonella lên tới 25 triệu USD.
Theo số liệu thống kê của Pháp năm 1995, trong số 7.449 bệnh nhân bị
nhiễm độc thức ăn đã có tới 3.131 bệnh nhân do Salmonella gây ra.
Năm 1999, ở Hàn Quốc nghiên cứu cho thấy 25,9% mẫu thịt gà tươi sống
cũng bị nhiễm Salmonella.

S. enterica nhóm I hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan
trọng nhất trong số các chủng Salmonella.
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mặc dù chưa có thống kê nào về thiệt hại do Salmonella gây
ra, nhưng theo báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho
thấy, mức độ nhiễm khuẩn trong các sản phẩm chăn nuôi như thịt lợn, thịt bò, thịt
gà ở Hà Nội là 100%, trong đó 40% là nhiễm Salmonella. Salmonella có thể nhiễm
vào các sản phẩm này ở tất cả các khâu tính từ khâu chăn nuôi, giết mổ, vận
chuyển đến khâu bảo quản. Ở nước ta tỷ lệ động vật nuôi bị nhiễm Salmonella là
rất cao đặc biệt là ở lợn và bê ghé.
Ngoài ra, trong những sản phẩm được coi là đảm bảo để xuất khẩu cũng
chứa Salmonella. Chỉ trong 3 tháng cuối năm 2001, Cơ quan Lương thực và Dược
phẩm Mỹ (FDA) đã tịch thu và tiêu huỷ hàng trăm lô thực phẩm được nhập khẩu từ
Việt Nam, đặc biệt là mặt hàng hải sản bị nhiễm Salmonella. Thiệt hại kinh tế do
vấn đề tiêu huỷ lên đến hàng trăm ngàn USD. Điều này không những ảnh hưởng
đến nền kinh tế mà còn thực sự là mối lo ngại cho an toàn sức khoẻ cộng đồng.
Ở nước ta hướng nghiên cứu về gen độc tố của Salmonella còn ít, các đề tài
nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập và định danh các chủng Salmonella
trên các đối tượng là động vật nuôi như lợn, bê nghé (Nguyễn Thị Oanh, 2003; Cù
Hữu Phú, 1999; Trần Xuân Hạnh, 1995). Trong đó, việc xác định Salmonella chủ
yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống mất nhiều thời gian và công sức.
Hiện chỉ có một số ít công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cổ điển để phát
16


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

hiện Salmonella được công bố như đề tài “Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
bằng phương pháp PCR” của Trần Linh Thước (2005) hay đề tài “Phát hiện
Salmonella spp. trong thực phẩm bằng PCR” của Phẩm Minh Thu và cộng sự

(2000) Tuy nhiên sử dụng kỹ thuật này chỉ xác định sự có mặt của vi khuẩn mà
không cho kết quả định lượng chính xác số lượng bản sao DNA đích có trong mẫu
phân tích.
Những năm gần đây phương pháp Realtime PCR một trong những phương
pháp cải tiến mới nhất dựa trên nguyên lý PCR đã được ứng dụng chủ yếu vào việc
phát hiện các virus gây bệnh trên người và tôm. Cụ thể là công ty Nam Khoa đã
phát triển các kít Realtime PCR để đưa vào ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm
lâm sàng có trang bị PCR tại Việt Nam như kít Realtime PCR phát hiện và định
lượng HBV (Hepatitis B virus); kít RT Realtime PCR phát hiện và định lượng
HCV (Hepatitis C virus) – RNA và kít RT Realtime PCR định lượng HIV1
(Human immunodeficiency virus1 ) – RNA. Bệnh viện Nhi đồng 1 Thành phố Hồ
Chí Minh cũng đã thực hiện thành công kỹ thuật Realtime – PCR để chẩn đoán xác
định các tác nhân gây viêm não ở trẻ em hay các công trình nghiên cứu về ứng
dụng kỹ thuật này trong việc phát hiện các virus gây bệnh trên tôm như virus gây
bệnh đốm trắng (Phạm Thị Mỹ Hạnh, 2005), bộ kít Realtime PCR phát hiện virus
gây hoại tử khối u của công ty Nam Khoa Tuy nhiên chưa có một công trình
nghiên cứu nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR để phát hiện và định
lượng Salmonella trong các mẫu thực phẩm được công bố.
1.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện Salmonella như phương
pháp nuôi cấy truyền thống, quan sát hình thái dưới kính hiển vi, kiểm tra các đặc
tính sinh hóa, phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western
blot) và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR,
Trong đó các phương pháp nuôi cấy truyền thống, quan sát hình thái dưới
kính hiển vi, kiểm tra các đặc tính sinh hóa chỉ cho phép phân tích định tính
Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong mẫu, không
cho phép phân biệt được các chủng Salmonella hiện diện trong mẫu, hơn nữa các
17

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

phương pháp này có nhiều trở ngại là tốn thời gian phải mất từ 5 – 7 ngày, tốn
công sức và có độ nhạy thấp.
Sử dụng phương pháp miễn dịch học (dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu
kháng nguyên – kháng thể) giúp phân biệt được các chủng Salmonella, tuy nhiên
phương pháp này gặp phải một nhược điểm là dễ tạo kết quả dương tính giả.
Ngoài ra, các phương pháp sinh học phân tử cũng được sử dụng để phát
hiện Salmonella như phương pháp PCR, mutiplex PCR, Realtime PCR, Trong
đó, so với các phương pháp dựa trên PCR cổ điển (PCR, mutiplex PCR, nested
PCR) thì phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn như có độ
nhạy cao hơn, cho kết quả sớm hơn do không cần phải chạy điện di sau phản ứng
và đặc biệt phương pháp này giúp định lượng chính xác được Salmonella trong
mẫu và rút ngắn thời gian phân tích.
1.3.1. Phương pháp PCR
a. Nguyên lý
Nhân bản DNA bằng phản ứng PCR là một quy trình dựa trên sự hoạt động
của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn
và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kì của phản ứng. Một
chu kì gồm 3 bước:
 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được tăng lên 94 – 96°C, làm phá vỡ các liên kết
hydrogen để tách hai sợi DNA ra.
 Giai đoạn gắn mồi: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống
nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 45 – 60
o
C, để mồi có thể gắn vào sợi
DNA đơn.
 Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, enzyme DNA polymerase

hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới.



18


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

b. Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR
 Khuôn DNA
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn
100 ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.
 Mồi
Mồi (primer) là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một
thí nghiệm PCR. Để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao thì
mồi sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại và phải tuân thủ theo
những nguyên tắc về sự bắt cặp giữa các mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính,
nồng độ mồi,…
 Nhiệt độ bắt cặp của mồi
Nhiệt độ bắt cặp của mồi thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer
sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer
có khoảng 20 oligonucleotide:
Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5
o
C (1.1)
(Ta: nhiệt độ bắt cặp của mồi)
Tuy nhiên, công thức này chỉ có tính tương đối. Trên thực tế nhiệt độ bắt cặp

của mồi còn phụ thuộc vào các điều kiện, thành phần của phản ứng như: dung dịch
đệm,
 Enzyme
Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1 – 2,5 đơn vị (u)
cho 100 µl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25 µl. Nếu
nồng độ Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu
và làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng
enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn

19


GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

 Nồng độ các dNTP
Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphate) thường được sử dụng là
20 – 200 µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ ký sinh’’. Bên cạnh đó,
sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Mất
cân bằng trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA
polymerase.
 Nồng độ Mg
2+

Nồng độ Mg
2+
cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR.
Mg
2+
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, là cofactor cho enzyme Taq
polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nếu nồng độ Mg

2+
quá thấp thì Taq
polymerase sẽ hoạt động kém và hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ
Mg
2+
cao làm tăng hiện tượng bắt cặp giả và cho ra những sản phẩm không đặc
hiệu. Chính vì vậy phải có nồng độ tối ưu cho từng phản ứng. Thông thường, Mg
2+

được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 – 4 mM.
 Dung dịch đệm
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho
phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung
dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA
polymerase sử dụng.
1.3.2. Phương pháp Realtime PCR
a. Nguyên tắc
Nguyên tắc của Realtime PCR tương tự PCR truyền thống. Tuy nhiên
phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại
ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được thực hiện nhờ vào sự phát
tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang hoặc các mồi được đánh dấu
huỳnh quang được thêm vào PCR mix. Sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia
tăng tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phản ứng. Realtime PCR sử dụng máy