ứng dụng phương pháp pcr phát hiện vi khuẩn aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (pangasianodon hypophthamus) bị bệnh xuất huyết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN




LƯƠNG MỸ THUẬN





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN







ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
VI KHUẨN Aeromonas hydrophila
PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus)
BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

Cần Thơ, 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN




LƯƠNG MỸ THUẬN




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
VI KHUẨN Aeromonas hydrophila
PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus)
BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH





Cần thơ, 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM ƠN

Được làm và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp là mong muốn của các sinh
viên. Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu
cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị.
Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy
sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và
nghiên cứu tại trường.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã
tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt
thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tình quan tâm động
viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập.
Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị
Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu

Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan
lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.













PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas
hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất
huyết” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A.
hydrophila. Đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp
sinh hóa truyền thống và kit API 20E. Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi
khuẩn A. hydrophila phân lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ
quan (gan, thận và tỳ tạng) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A.
hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit
API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20
o
C. Sau khi phục hồi trên môi

trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng
sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách bằng 2
cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng
với nước muối sinh lý). Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala
et al (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và ctv (2008).
Kết quả điện di sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu
DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện diện
của vi khuẩn A. hydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp.
Điện di sản phẩm PCR của 7 chủng A. hydrophila mà không qua bước chiết
tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được
DNA của A. hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di.
Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A.
hydrophila là 1ng/µl (hàm lượng DNA). Phương pháp PCR với hàm lượng
thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép
phát hiện A. hydrophila hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các
chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri, Pseudomonas putida,
Eschericchia coli).











PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
Chương 1: GIỚI THIỆU 1
Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam 3
2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản 3
2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh 4
2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra 5
2.5 Sơ lược về vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá tra 7
2.6 Phương pháp PCR 9
2.6.1 Khái niệm về PCR 9
2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR 11
2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản 12
2.6.4 Đối chứng 13
2.6.5 Hạn chế của PCR 13
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15
3.1.1 Thời gian 15
3.1.2 Địa điểm 15
3.1.3 Nội dung thực hiện 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 15
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iv
3.3.2 Nguồn vi khuẩn 16
3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn 17
3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 18
3.3.5 Phương pháp PCR 18
3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR 20
3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. hytrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22
4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn 23
4.3 Phát hiện vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp PCR 24
4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 26
4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 27
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
5.1 Kết luận 30
5.2 Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC 1 34
PHỤ LỤC 2 35
PHỤ LỤC 3 37

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al.,
2007). 16
Bảng 3.2: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài. 17
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui
trình PCR phát hiện A. hydrophila. 19
Bảng 4.1: Bảng kết quả thu mẫu cá tra bị bệnh. 22

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 10
Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất
huyết và mắt lồi đục). 22
Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường Aeromonas
agar + Ampicillin. 23
Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường NA…………… 23
Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila 24
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A. hydrophila 25
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của
chủng A. hydrophila. 26
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila xác định độ
nhạy của phương pháp. 27
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương
pháp phát hiện A. hydrophila. 28

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
Chương 1
GIỚI THIỆU
Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An
Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,… Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị
trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn.
Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể. Năm 2006, sản
lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu
về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy
sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng
ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra
đạt 380.489 tấn, khối lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch
xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với
cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007).
Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, do chi
phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến
(50-60 con/m
2

ao), đã làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quản lý tốt
môi trường nước ao nuôi. Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và
Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường
Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006). Cá tra là một
loài cá kinh tế và khi có dịch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên
cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng
ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan,
2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh
Hương, 2006), nghiên cứu khả năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri và
Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang
(Phan Khắc Huy, 2008),…
Bệnh xảy ra trên cá tra do nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm,
dinh dưỡng,…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh
nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra. Các loại bệnh do
tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột,
trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh
đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phổ biến và xuất
hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007).
Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A. hydrophila nói
riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát
hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Cũng như Ngô Minh Dung (2007)
gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra, sau đó tái
định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1
tuần để đọc kết quả, hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục
Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng
kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả. Cụ thể
Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả

định danh vi khuẩn sau khi dùng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit
API 20E để định danh E. ictaluri trên cá tra, đã kết luận phương pháp PCR
cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần 1 ngày, Nguyễn Hà
Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila
sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt. Do đó để chẩn đoán nhanh
và chính xác vi khuẩn A. hydrophila trên cá giúp cho người nuôi phát hiện kịp
thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng
phương pháp PCR. Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi
khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm góp phần vào việc
chuẩn hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh ở cá tra.
Mục tiêu nghiên cứu
Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập
từ cá tra bị bệnh xuất huyết.
Nội dung nghiên cứu
- Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân
lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết.
- Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila.
- Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila.




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), cho biết
7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD,

tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm
32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,9%; còn lại là các loại thủy sản khác. Theo Thứ
trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm:
Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết
với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới
nhằm đẩy giá nguyên liệu tăng lên. Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng
cho các doanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh
bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008).
Tình hình nuôi thủy sản ở ĐBSCL
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi
thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn
70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa diện tích nuôi
toàn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn). Diện
tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây.
Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tấn; năm 2002
là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng
773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn. Quy
hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước
mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày
càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL
(Phạm Đình Đôn, 2006). Song song với việc tăng diện tích và năng suất NTTS
thì vấn đề dịch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa dạng do
nhiều tác nhân.
2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản
Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước
càng bị ô nhiễm do chất thải từ các ao nuôi. Cùng với sự ô nhiễm do chất thải
từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn. Đối
với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào
chăn nuôi (thông thường 1,5-2 kg thức ăn/1 kg sản phẩm), ngoài ra còn lượng
thức ăn dư thừa lắng xuống tạo ra nguồn chất thải rất dễ phân hủy hữu cơ gây

ô nhiễm môi trường là nguy cơ phát sinh và lây lan dịch bệnh. Cùng với tác
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
động môi trường do chất thải trong sản xuất chế biến công nghiệp, cũng góp
phần tác động đến chất lượng môi trường nước ảnh hưởng đến cả kinh tế và
môi trường sinh thái (Phạm Đình Đôn, 2006).
Mặt khác do nước ta nằm trong khu vực diễn biến thời tiết ngày càng phức
tạp, ảnh hưởng đến môi trường nuôi thủy sản làm cho động vật thủy sản dễ bị
sốc. Cuối năm 2007, chương trình phát triển của Liên Hiệp Quốc đã xác định:
Việt Nam là 1 trong 5 vùng bị tác hại của biến đổi khí hậu nặng nề nhất thế
giới. ĐBSCL là vùng đất thấp ven biển Đông của Việt Nam nên sẽ là khu vực
bị tác hại nặng nề nhất do biến đổi khí hậu (Lệ Thu, 2008).
Theo các nhà khoa học, 10 năm qua, diện tích NTTS ở ĐBSCL đã tăng hơn
2,37 lần, sản lượng tăng vọt lên 3,68 lần nhưng cũng làm cho nguồn nước bị ô
nhiễm nặng, đe dọa sự mất cân đối trong chiến lược qui hoạch thủy lợi hiện
nay. Ước tính mỗi năm, hoạt động NTTS đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 4
triệu tấn bùn ở dạng chất thải hữu cơ gần như chưa được xử lý. Mầm bệnh từ
các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn chất thải này ra hệ thống sông rạch làm chất
lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề. Thực tế cho thấy nuôi cá tra, cá ba
sa trong ao hầm, chỉ có khoảng 17% thức ăn được cá hấp thụ, phần còn lại
khoảng 83% hòa lẫn, lắng đọng trong môi trường nước thành chất hữu cơ
phân hủy đã làm cho môi trường bị suy thoái (Trần Khánh Linh, 2007).
2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh
Theo Từ Thanh Dung (2005).
Thời kỳ ủ bệnh: Đây là thời kỳ từ khi nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào
cơ thể đến lần thứ nhất xuất hiện triệu chứng bệnh, lúc này triệu chứng bệnh
bình thường của cá bị thay đổi. Trong thời kỳ ủ bệnh sinh vật ký sinh tìm cách
tích lũy dinh dương để tăng cường độ sinh sản và hoạt động, ký chủ tạo ra
những yếu tố miễn dịch phòng vệ.
Thời kỳ dự phát: Là thời kỳ chuyển tiếp từ lúc xuất hiện bệnh đầu tiên đến

bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá.
Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ
ràng, quá trình trao đổi chất, hình thái cấu tạo, các tổ chức cơ quan bên trong
biến đổi.
Thời kỳ khỏi bệnh: Thời kỳ này nếu cơ thể chống chịu tốt với mầm bệnh thì
cơ thể sẽ khỏi bệnh.
Thời kỳ phục hồi: Cơ thể hoạt động bình thường, chức năng sinh lý hoàn toàn
hồi phục.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra
Theo nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam (2007).
Cá tra cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ
biến. Các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do
virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi
trường, dinh dưỡng hoặc do các vi sinh vật gây ra.
Bệnh do giáp xác ký sinh
Bệnh trùng mỏ neo
Trùng gây bệnh có tên Lernaea, có dạng giống mỏ neo, cơ thể có chiều dài 8-
16mm, giống như cái que, đầu có mấu cứng giống mỏ neo cắm sâu vào cơ thể
cá. Trùng thường ký sinh ở da, mang, vây và mắt cá.
Bệnh rận cá (Argulosis)
Trùng gây bệnh thuộc giống Argulus, có hình dạng giống con rệp nên còn gọi
là rận cá hay bọ cá, bọ ve, nhìn thấy được bằng mắt thường.
Bệnh nấm thủy mi ( Saprolegiosis)
Do 2 giống nấm Saprolegnia và Achlya gây ra gồm có Saprolegnia
parasitica, S. ferox, Achlya spp. Cá bị bệnh có dấu hiệu trên da cá xuất hiện
những vùng trắng xám, giống đám bông mềm. Nhiệt độ nước 18-25
o

C thích
hợp cho nấm phát triển.
Bệnh Ký Sinh Trùng
Bệnh trùng bánh xe ( Trichodinosis)
Dấu hiệu: thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt. Cá
thường nổi đầu và tập trung nơi có nước chảy, đôi khi nhô đầu lên mặt nước
lắc mạnh đầu. Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuống đáy
rồi chết.
Bệnh trùng quả dưa (Ichthyopthisiosis)
Trùng quả dưa ký sinh trên da, mang và vây. Trùng bám thành các hạt lấm tấm
rất nhỏ, có thể thấy được bằng mắt thường. Biểu hiện là da và mang cá có
nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt. Cá nổi đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ
do trùng bám nhiều ở mang, phá hoại biểu mô mang làm cá ngạt thở. Ngoài ra
nghành trùng bào tử sợi Myxosporidia, sán 16 móc Dactylogyrus, sán 18 móc
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
Gyrodactylus,… cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho cá tra. Trần Văn Tếch
(2008) đã phân tích mẫu cá tra bị bệnh vàng da phát hiện có (Dactylogyrus,
Trichodina, Myxobolus, Bucephalopsis,…) nhưng chưa xác định ký sinh trùng
là tác nhân gây bệnh vàng da trên cá tra.
Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas
Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromonas gồm có A.
hyrophila, A. caviae và A. sobria. Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều chất
hữu cơ. Cá con dễ mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thể gây chết đến 80%.
Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)
Tác nhân gây bệnh do Pseudomonas fluorescens, P. anguilliseptica, P.
Chlororaphis. Cá bị bệnh này có dấu hiệu xuất huyết từng đốm nhỏ trên da,
xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể chảy máu, tuột
nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn.
Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella.

Bệnh do vi khuẩn E. tarda gây ra. Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da
(phía mặt lưng). Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng
bên trong cơ và da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do
vây đuôi bị rách, gẫy. Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ,
khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng
cơ xung quanh. Ngoài ra, Trần Thị Ngọc Hân (2006) thí nghiệm gây cảm
nhiễm trên cá tra bằng 2 phương pháp ngâm và tiêm E.ictaluri kết quả đến
ngày thứ 10 bên ngoài cá có hiện tượng xuất huyết vây đuôi, trên thận có đốm
trắng.
Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản
mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm, tác nhân vi khuẩn
được coi là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy
sản (Inglish et al., 1993). Mặc khác theo Buler (2004) vi khuẩn không chỉ tồn
tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo
chất lượng nước (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008). Vi khuẩn A.
hydrophila là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và thường
gặp trên cá tra hiện nay.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
2.5 Sơ lược về vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá tra
Tác nhân gây bệnh
Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ
Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria. Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không
di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi
khuẩn di động bao gồm (A. hydrophila, A. caviae, A. sobria), đặc tính chung
của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ có 1 tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình
que ngắn, hai đầu tròn, phản ứng oxidase dương tính, khử nitrat, không mẫn

cảm với thuốc thử O/129. Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được
phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A. hydrophila (trích
dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008).
Theo Bergey (1957), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao
gồm 3 loài A. hydrophila, A. caviae, A. sobria. Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh
xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi,… là bệnh do vi khuẩn A.
hydrophila. Vi khuẩn A. hydrophila phát triển trên môi trường thạch có khuẩn
lạc tròn, màu vàng rất nhạt, rìa đều hơi lồi, ướt, nhẵn bóng. Vi khuẩn di động
(có 1 tiêm mao), gram âm, oxidase dương tính, kháng với O/129, hiếu khí và
hiếm khí không bắt buộc, có khả năng lên men, hình que ngắn dài 2-3 µm, hai
đầu hơi tròn. Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28-30
o
C, sinh
trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 (trích dẫn bởi Từ Thanh
Dung, 2008).
Theo Lewis & Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống
Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt
quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi
và cá tự nhiên, theo Angka (1990) A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá
tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung,
2007).
Bên cạnh đó trong báo cáo của Saitanu et al., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A.
hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép.
Dấu hiệu bệnh lý
Cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không
có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên (thân,
các gốc vây, quanh miệng), hậu môn xuất huyết, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá
basa xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng
to, thận sưng, ruột dạ dày bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

8
dịch nhờn có mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu
(Bùi Quang Tề, 2006).
Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện
từng mảng đỏ trên cơ thể, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên
lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng, mắt lồi mờ đục, xoang
bụng chứa dịch nội tạng hoại tử.
Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều
loài cá khác. Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A. hydrophila và
Pseudomonas fluorescens. Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ trên mặt nước, trên
thân xuất hiện điểm xuất huyết nhỏ li ti, nếu bệnh nặng thì các gốc vây cũng
xuất huyết. Bụng cá trương to, thành ruột xuất huyết, cá ít ăn hoặc bỏ ăn. Các
tia vây lưng, hậu môn và vây đuôi bị rách xơ xác (Bộ thủy sản, 2008).
A. hydrophila, A. caviae và A. sobria cả 3 loài phân lập được trên cá khi có
dấu hiệu bệnh nhiễm khuẩn huyết, mặt dù A. hydrophila là loài thường gặp
nhất. Thỉnh thoảng cũng phân lập được vi khuẩn gram âm khác như
Pseudomonas fluorescens (theo Roberts & Horne 1978, Schaperclaus 1926)
hoặc Proteus rettgeri trên cá bị nhiễm khuẩn huyết (theo Bejerano et al.
1976), có thể phân lập được đĩa cấy thuần của một chủng, hoặc kết hợp nhiều
chủng thì gây ảnh hưởng cao hơn (trích dẫn bởi Inglis et al, 1993).
Phân bố và lan truyền bệnh
Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) bệnh nhiễm trùng do A. hydrophila thường gặp ở
nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung
Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,…Ở Việt Nam, các loài cá nuôi
lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, tra, basa, trôi,
chép, mè, trê,… Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70%. Bệnh có
thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt và cá bố mẹ. Ở Việt
Nam bệnh do A. hydrophila có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập
trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuất hiện nhiều
vào đầu mùa mưa, mùa có nhiệt độ 25-28

o
C.
Ở Châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa
xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22
o
C, đây là khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn
này phát triển (Esteve et al., 1993 trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007).
Chẩn đoán bệnh
Theo Từ Thanh Dung (2008), chẩn đoán bệnh do Aeromonas là dựa vào các
dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ xuất hiện bệnh, kết quả phân lập bằng phương pháp
truyền thống. Để phát hiện bệnh nhanh và ở giai đoạn sớm của bệnh cần áp
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), hoặc ELISA (Enzyme
Linked Immunosorbent Assay).
Một số nghiên cứu về A. hydrophila
Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận
tỷ lệ chết thường cao ở 20,5
o
C và 17
o
C, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15
o
C và 12
o
C,
còn ở 9
o
C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and
Stevenson, 1988; trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007).

Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A.
hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật
độ vi khuẩn 3x10
4
-3x10
8
CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x10
4
-8,5x10
8
CFU/ml),
tiêm ở cơ (8x10
4
-8x10
8
CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x10
4
-4,6x10
8

CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới
da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD
50
là 10
6,4
CFU/ml (trích dẫn
bởi Ngô Minh Dung, 2007).
Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng
A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 10
3

đến 10
7
CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi
khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD
50
lần lược là 3,68x10
6
CFU/ml, 2,64x10
6

đến 4,52x10
6
CFU/ml và 1,96x10
6
đến 1,45x10
7
CFU/ml.
2.6 Phương pháp PCR
2.6.1 Khái niệm về PCR
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) do
Karl Mullis et al phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo
dòng DNA invitro không cần có sự hiện diện của tế bào (trích dẫn bởi Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2007). Nguyên tắc của phản ứng PCR (xem hình 2.1).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2003)
PCR là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm từ

một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi
(oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA, các nucleotide tự do và dung dịch
đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra
nhanh chống, thậm chí với một tiểu phần virus. Hiện nay PCR được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh.
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ( 2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều
chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn là:
Giai đoạn 1 (biến tính – denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) cuả phân tử, thường là 94-
95
o
C trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch
đơn.
Giai đoạn 2 (lai –hybridization): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn
Tm của các mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ
này dao động trong khoảng 40-70
o
C. Tùy thuộc vào Tm của các đoạn mồi sử
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
dụng mà thời gian bắc cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là
giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
Giai đoạn 3 (tổng hợp –extension): Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, đó là điều
kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo
nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase
hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân lên trong chu kỳ lại làm
khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng DNA
được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau (n) chu kỳ nhân bản sẽ tạo
ra 2
n
bản DNA từ một khuôn ban đầu.
PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen
của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự
đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản. PCR cũng được dùng để
phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và
giữa các quần thể. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh
vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng
ở trên tôm hiện nay được chẩn đoán bằng PCR như virus đốm trắng (WSSV),
virus đầu vàng (YHV), virus gây hội chứng Taura (TSV), virus gây hoại tử cơ
quan tạo máu và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV) (Đặng Thị Hoàng Oanh,
2007).
Không chỉ đối với vi khuẩn mà cả virus, multiplex PCR (mPCR) đã có những
bước phát triển mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả
chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm thời gian và công sức. Yang et al.
(2006) đã phát triển phương pháp m PCR phát hiện đồng thời hai loại virus
IHHNV và WSSV trên tôm he.
2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR
DNA khuôn: Khuất Hữu Thanh (2003) khuôn DNA có vai trò rất quan trọng,
ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng tối ưu với các đoạn khuôn hoàn
toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì
hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn.
Enzyme: DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các
đặc tính của DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà
hiệu quả phản ứng khác nhau.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản
ứng PCR. Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược
không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5
o
C và nhiệt độ
nóng chảy của mồi khoảng 72
o
C. Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30
nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi
dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị
Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005). Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể
bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn
PCR không thành công. Tỷ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-
75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững. Tuy nhiên trình tự G-C
không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi. Các mồi chọn phải đặc trưng cho
trình tự DNA cần khuếch đại. Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự nằm
giữa hai mồi không quá lớn 1 kb. Sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi
đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do. Do đó đầu 5’ của mồi có
thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter). Thể
tích mồi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM. Thể tích mồi thường được xác định dựa
vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006).
Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP) khoảng 20-200 µM/ mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp
sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự
khuếch đại “ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Nồng độ Mg
2+
: Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) ion Mg

2+
là
thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg
2+
tối ưu để
thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM. Nước sử dụng cho phản ứng phải
tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không chứa các enzyme cắt hạn chế
và các enzyme phân hủy acid nucleic. Môi trường dung dịch đệm phải ổn
định. Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 29-50 µl.
Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) số lượng chu kỳ PCR
thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng. Sở dĩ như vậy là vì phản
ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng
theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm
hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của
phản ứng, (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, (3) các bản sao
vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau,…
2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản
Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì ứng dụng của PCR là: Phát hiện nhanh
tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn, giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi như: (1) Giúp chẩn đoán
bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết. (2) Phòng bệnh:
kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống. (3) Kiểm soát bệnh:
theo dõi kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu.
Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu - Sự nhiễm khuẩn
hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli.
Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây
bệnh, hay có thể là các loài đông vật thủy sản.
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR

là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký
sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay
được chẩn đoán bằng PCR bao gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng
(YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV),
virus gây hội chứng Taura (TSV).
2.6.4 Đối chứng
Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau.
- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để
kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm.
- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được
khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ.
2.6.5 Hạn chế của PCR
- Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn DNA có
chiều dài lớn hơn 3kb ( kết quả tốt với những đoạn DNA có chiều dài
nhỏ hơn 1,5 kb).
- Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước, dễ bị
tạp nhiễm do tính nhạy cảm và lỗi thao tác.
- Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì
enzyme gắn sai một nucleotic).
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do
vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết gây
ra. Bên cạnh đó việc phát hiện mầm bệnh riêng lẽ bằng PCR thường gây
tốn kém, do đó các nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chi phí bằng cách
sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR để phát hiện
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Trần Linh Phước, 2003;
trích dẫn bởi Phạm Thị Thu Trang, 2005).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15

Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2008 – 05/2009
3.1.2 Địa điểm
- Thu mẫu: Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp.
- Nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản –
Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần thơ.
3.1.3 Nội dung thực hiện
- Thu mẫu cá tra bệnh.
- Phân lập vi khuẩn ở các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) của cá tra bị bệnh
xuất huyết.
- Phục hồi vi khuẩn đã được định danh và trữ trong glycerol 50%. Cấy vi
khuẩn trực tiếp lên môi trường thạch đặc trưng Aeromonas agar +
Ampicillin.
- Tách vi khuẩn sang môi trường NA, nuôi tăng sinh vi khuẩn trong NB.
- Dùng phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila.
- Xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của phương pháp PCR.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ
- Máy chu kỳ nhiệt, máy so màu quang phổ, máy ủ, máy li tâm, máy
vortex, máy lắc, máy PCR, lò viba, bộ điện di, bàn đọc UV, bộ chụp ảnh
gel, máy vi tính.
- Cân điện tử, pipet tự động, tủ lạnh, tủ đông, tủ sấy, nồi autoclave.
- Ống eppendorf 1,5 ml và 0,5 ml.
- Đầu col pipet các loại.
- Ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh, ống đong, chai nấu môi trường.
- Đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, hộp quẹt.
- Hộp đá lạnh, giấy vệ sinh, găng tay, bọc nylon và viết lông dầu.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy phục hồi vi khuẩn: Nutrient Agar (NA), Aeromonas
agar + Ampicillin (18,35g agar + 1 lọ trong 500ml nước), Nutrient Broth
(NB).
- Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy điện di
TAE.
- NB (8g Nutrient Broth, trong 1 lít nước cất).
- TE (pH 8.0) gồm 10 mM Tris HCl và 1mM EDTA.
- Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Buffer 10X, MgCl
2
, dNTPs (10
mM), Taq DNA polymerase (5U), mồi, nước cất 2 lần.
- Cồn tuyệt đối, nước cất, NaCl.
Bảng 3.1 Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al.,
2007).






3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển
- Dự kiến thu khoảng 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe (mẫu
được thu từ tháng 12/2008 đến tháng 2/2009).
- Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống.
- Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí
và được phân tích ngay. Chỉ sử dụng những mẫu còn sống.

3.3.2 Nguồn vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn A. hydrophila được phân lập trên cá tra bị bệnh xuất huyết
ở các tĩnh Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp.
Tên mồi Trình tự
AeroFd (mồi xuôi) 5
’
CCAAGGGGTCTGTGGCGACA3
’

AeroRs (mồi ngược) 5
’
TTTCACCGGTAACAGGATTG3
’

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17

Bảng 3.2 Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài.









3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn
- Mẫu cá bệnh thu về phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản, được giữ sống
bằng cách bỏ vào thùng mướp có sục khí. Mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và

2 cá khỏe.
- Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của cá: màu sắc, vết thương, điểm xuất
huyết.
- Mổ cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng: điểm xuất huyết, mùi,
màu sắc các cơ quan nội tạng.
- Cấy vi sinh từ các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) lên môi trường NA
(Nutrient agar) và môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin.
Các thao tác được thực hiện bên ngọn đèn cồn và các dụng cụ được vô
trùng, để trách tạp nhiễm.
- Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30
o
C. Sau 18-24 giờ quan sát và ghi
nhận hình dạng của khuẩn lạc, nếu đĩa cấy chưa thuần tiếp tục tách ròng
sang đĩa NA để đạt đĩa cấy thuần.
Sau đó nhuộm gram, xem tính di động, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản. Nếu vi
khuẩn di động, gram âm, Oxidase dương tính, Catalase dương tính thì đem
nuôi trong môi trường lỏng NB (5ml) sau 18-24 giờ ở 28-30
o
C.
Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống, các chỉ tiêu sinh hoá
được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993). Sau đó định
danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E.
Kết quả định danh được 8 chủng A. hydrophila, sau đó trữ vi khuẩn trong ống
eppendorf có chứa 50% glycerol (nước cất:glycerol tỷ lệ 1:1) giữ ở (-20
o
C).
STT Địa điểm Cơ quan phân lập Ký hiệu
1

Sa Đéc

–

Đ
ồng Tháp

T
ỳ tạng

SD(tt)

2 Sa Đéc – Đồng Tháp Thận SD(t)
3 Mang Thích – Vĩnh Long

Tỳ tạng CA(tt)
4

Mang Thích
–

V
ĩnh Long

Th
ậ
n

CA(t)

5 Thốt Nốt – Cần Thơ Tỳ tạng TN(tt)
6

Th
ố
t N
ố
t
–

C
ầ
n Thơ

Th
ậ
n

TN(t)

7 Thốt Nốt – Cần Thơ Gan TN(g)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version