Khảo sát tình hình nhiễm listeria monocytogenes trong rau xà lách

1



LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu đồ án, em đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ
tận tình của thầy cô và bạn bè. Nhân đây em xin chân thành cảm ơn:
- Quý Thầy Cô Trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy chúng em trong
những năm học đại học.
- Đặc biệt TS Nguyễn Minh Trí và Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải đã hướng
dẫn em hết sức tận tình và chu đáo. Quý thầy cô trong bộ môn Hóa – Vi sinh đã
tạo điều kiện giúp đỡ em về tinh thần cũng như vật chất trong khi làm đề tài. Các
bạn trong khoa chế biến đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong quá trình làm.
- Gia đình đã động viên, ủng hộ, khích lệ con trong thời gian qua.
Nha Trang, tháng 6, năm 2011
Sinh Viên
Nguyễn Thị Thảo My









2


MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN 1
DANH MỤC CÁC BẢNG 4
DANH MỤC CÁC HÌNH 6
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 8
1.1. GIỚI THIỆU 8
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 9
1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI 9
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 10
2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH: 10
2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải 10
2.1.2. Rau xà lách 10
2.2. GIỚI THIỆU VỀ PHÉP THỬ CẢM QUAN CHO ĐIỂM 13
2.2.1 Giới thiệu về phép thử 13
2.2.2 Phương pháp tiến hành 14
2.2.3 Xử lý kết quả 14
2.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes 14
2.3.1. Sơ lượt về vi khuẩn 14
2.3.2. Giới thiệu chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria
monocytogenes 22
2.4. Các phương pháp định lượng Listeria monocytogenes trong thực phẩm. 26
2.4.1. Định nghĩa 26
2.4.2. Các phương pháp định lượng 26
CHƯƠNG III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
3


3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31
3.2.1. Xà Lách 31

3.2.2. Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 32
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 33
3.3.2. Quy Trình Thực hiện 34
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
4.1. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN XÀ LÁCH THEO CÁC CÁCH XỬ LÝ 39
4.1.1. Kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái rau xà lách
theo phương pháp cho điểm. 39
4.1.2. Kết luận 41
4.2. TÌNH HÌNH NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH 41
4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. 41
4.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý đến mức nhiễm Listeria monocytogenes43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
Phụ Lục 1 49
Phụ lục 2 56
Phụ lục 3 62


4


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Nội dung Trang
2.1 Thành phần hóa học của vi khuẩn gram (+) và gram (-) 16
4.1
Rau xà lách sau 5 ngày bảo quản lạnh (<4
0
C) theo các cách
xử lý

39
4.2
Kết quả dánh giá của cảm quan viên về chỉ tiêu màu sắc và
trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm
40
4.3 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở vùng kiểm tra 41
4.4 Liên hệ giữa nước tưới và mức nhiễm L. monocytogenes 42
4.5
Số lượng Listeria monocytogenes trong rau xà lách sau khi
đã qua xử lý.
44
4.6 Bảng Mac Crandy 56
4.7
Xây dựng thang điểm chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau
xà lách theo phương pháp cho điểm cảm quan.
57
4.8
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Vĩnh Hải
57
4.9
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Phú Sương 1
58
4.10
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Phú Sương 2
58
4.11
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau

Phước Hải
59
4.12
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes đường
Rhamnose tại vườn rau Phú Thạnh
59
4.13
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Đồng Nai
60
5


4.14
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Diên Phú 1
60
4.15
Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau
Diên Phú 2
61
4.16
Kết quả dương tính với tại Listeria monocytogenes vườn rau
Diên Phú 3
61

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Nội dung Trang
2.1 Xà lách cuộn 10
2.2 Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn 20
2.3 Các loại tiên mao ở vi khuẩn 21
2.4 Khuẩn mao ở vi khuẩn E. coli 22
2.5 Vi khuẩn Listeria monocytogenes 23
2.6 Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử 23
2.7 Buồng đếm hồng cầu 27
2.8 Phương pháp cấy trên đĩa từ các ống tăng sinh 28
3.1 Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu 31
3.2

Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các phương pháp xử
lý đến sự biến đổi bên ngoài của cây rau
33
3.3 Sơ đồ qua quá trình kiểm tra Listeria monocytogenes 33
3.4 Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh 34
3.5 Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes 36
3.6
Esculin dương tính (bên trái)_ Esculin dương tính (bên
phải)
36
3.7
Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường
Rhamnose_ dương tính (mầu vàng) âm tính (mầu xanh)
37
3.8 Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu 38
3.9 Sơ đồ cách tra bảng Mac Crandy 38
4.1
Biểu dồ biểu diễn tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở
các vùng kiểm tra
41
4.2 Máy hấp vô trùng 62
7


4.3 Phòng cấy vi sinh 62
4.4 Tủ sấy 62
4.5 Máy cân điện tử 62
4.6 Đường Rhamnose 62
4.7 Dung dich BPW 62
4.8 Ống canh thang chứa môi trường BLEB 63

4.9 Môi trường thạch OXA 63
4.10 Các ống giứ chủng vi khuẩn Listeria monocytogenes 63













8


CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. GIỚI THIỆU
Đã từ lâu thực phẩm là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của
sinh vật cũng như con người nói riêng. Xã hội phát triển, quan niệm ‘ăn no mặc
ấm’ không còn phù hợp nữa khi chất lượng cuộc sống đang ngày một được nâng
cao đối với đại bộ phận con người ngày nay. Minh chứng cho điều đó là thực phẩm
đang tràn ngập trên các thị trường, đa dạng về chủng loại, mẫu mã, hình thức.Vậy
khi mua hay ăn thức ăn chúng ta thường quan tâm trước nhất là khẩu vị hay độ an
toàn?
Theo thói quen và tập quán của người Á Đông và đặc biệt là ở Việt Nam,
người tiêu dùng đã quen với việc tới các chợ cóc, chợ tạm để mua thực phẩm tươi
sống về sử dụng. Người tiêu dùng nghĩ rằng thực phẩm tươi sống đảm bảo chất

dinh dưỡng và ngon miệng hơn so với các sản phẩm đông lạnh, nhưng việc đảm
bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho những mặt hàng này thì các cơ quan chức năng
không thể đảm bảo 100% tất cả các sản phẩm bày bán tại các chợ đó được kiểm
định. Các mặt hàng thực phẩm tươi sống được bày bán tại các chợ tiềm ẩn các
nguy cơ gây ra các bệnh dịch. Đối với thực phẩm đông lạnh: Các nước phát triển
trên thế giới đa phần sử dụng thực phẩm đông lạnh và là thực phẩm chính trong
các bữa ăn hàng ngày bởi nó được đảm bảo vệ sinh tuyệt đối, được cấp chứng nhận
về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Nhưng dù nói gì đi chăng nữa, chúng ta không thể làm lơ trước những vụ
ngộ độc nghiêm trọng do thực phẩm gây ra. Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong
năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc,
3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Riêng trong quý IV năm
2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các
tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở
lên [5]
Vấn đề an toàn thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có
nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như do nguyên liệu dùng chế
9


biến hay thực phẩm bị nhiễm dộc tố của vi khuẩn nhưng phần lớn nguồn gốc từ vi
sinh vật. Lâu nay, trong vấn đề an toàn thực phẩm, chúng ta chỉ lưu ý đến một số
loại vi khuẩn chủ yếu như E.coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringgens
mà chưa lưu ý đến một số loại khác như Listeria monocytogenes. Trong một đợt
dịch gần đây, các chuyên gia dịch tễ học Hoa Kỳ đã thống kê cho thấy tỉ lệ tử vong
35% do nhiễm Listeria monocytogenes ở người lớn không có thai nghén, 11% ở
những người dưới 40 tuổi và 63% ở những người trên 60 tuổi [18]
Điều đáng nói là ngành y tế nước ta vẫn chưa quan tâm nghiên cứu, tầm
soát. Có thể nói chúng ta đã bỏ sót loại vi khuẩn này là tác nhân gây ra nhiều bệnh
nguy hiểm, khả năng thực phẩm bị nhiễm Listeria monocytogenes tại Việt Nam

không phải là chưa từng xảy ra, mà vấn đề là công tác điều tra dịch tễ, sàng lọc và
thống kê tác nhân gây bệnh chưa đạt yêu cầu, cũng như nhận thức của cộng đồng
về an toàn vệ sinh thực phẩm chưa đầy đủ. Nguyên nhân không phải là vì chúng ta
không biết về những nguy hiểm do Listeria monocytogenes gây ra mà vì với các
phương pháp xét nghiệm lâu nay chúng ta áp dụng như soi trên kính, nhuộm v.v
chỉ thấy được các nhóm vi khuẩn chung, còn việc tìm cụ thể một vi khuẩn như
Listeria monocytogenes thì phải cần nhiều đến kỹ thuật chuyên môn vi sinh.
Xuất phát từ thực tế trên, cùng với sự định hướng và giúp đỡ nhiệt tình của
quý thầy cô, sau gần 3 tháng nghiên cứu đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài:
”Khảo sát tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong rau xà lách”.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogene ở rau xà lách và
tác dụng của cách rửa thường dùng đến mức nhiễm vi khuẩn này trên rau.
1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI
- Xác định lượng vi khuẩn Listeria monocytogene nhiễm trong rau xà lách
khi chưa qua bất kỳ xử lý nào.
- Ảnh hưởng của các cách rửa khác nhau: rửa dưới vòi nước chảy, ngâm rửa
với dung dịch nước muối 0,85% và ngâm rửa với thuốc tím 10 ppm đến số lượng
vi khuẩn Listeria monocytogene có trong xà lách
10


CHƯƠNG II: TỔNG QUAN
2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH:
2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải
Họ Cải (danh pháp khoa học: Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự
(Cruciferae), là một họ thực vật có hoa. Các loại cây trồng trong họ này gần như
đều có chứa chữ cải trong tên gọi. Họ này chứa một số loài có tầm quan trọng kinh
tế lớn, cung cấp nhiều loại rau về mùa đông trên khắp thế giới. Các loại rau họ cải
bao gồm cây bông cải xanh, rau diếp, xà lách, cải bắp, súp lơ và cải xoăn [9].

2.1.2. Rau xà lách
Là loại rau có mặt trong danh sách loại rau được ăn sống nhiều nhất cùng với
xà lách xoang, rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô (cải cúc), rau má, rau thơm
gia vị (húng, tía tô, húng quế ).[7]

Hình 2.1: Xà lách cuộn
a. Nguồn gốc
Xà lách là loại cây thân thảo, ngắn ngày, dùng để ăn lá có nguồn gốc từ khu
vực Địa Trung Hải, được chú ý làm thức ăn cho người cách nay khoảng 4.500
năm. Đến nay, cây rau xà lách được trồng ở khắp nơi trên thế giới. Hiện tại có
khoảng 2 loại xà lách khác nhau: xà lách cuốn bắp tròn, xà lách cuốn bắp dài [9]
11


Với người Việt Nam, xà lách thật sự quen thuộc khi hầu như luôn có mặt
trong các bữa ăn hàng ngày. Xà lách là rau ăn kèm nhiều loại thực phẩm khác nhau
như các món : riêu cua, riêu cá, bánh tôm, nem rán, bún chả, bún riêu, bún ốc Theo
thống kê, hiện lượng người tiêu thụ khoảng 200g rau/ người/ ngày [7]
b.Thành phần và công dụng của xà lách
Cứ 100 gam xà lách sẽ cung cấp khoảng 2,2 gam carbohydrate, 1,2 gam
chất xơ, 90 gam nước, 166 microgram vitamin A, 73 microgram folate (vitamin
B9). Xà lách còn chứa rất nhiều muối khoáng với những nguyên tố kiềm, nhờ đó
giúp cơ thể “dọn dẹp” máu, giúp tinh thần tỉnh táo và giúp cơ thể tránh được nhiều
bệnh tật. Là một kho cung cấp chất xơ, giàu cellulose nên xà lách còn giúp ruột co
bóp, nhờ đó giúp thoát khỏi tình trạng táo bón. Cải xà lách đem lại giấc ngủ tốt vì
có chứa một chất gây ngủ là letucarium. Đối với bệnh nhân tiểu đường, xà lách là
một loại thực phẩm lý tưởng vì thuộc nhóm rau cải có thành phần carbohydrate
thấp hơn 3%. Xà lách còn chứa một hàm lượng đáng kể chất sắt nên là một loại
thực phẩm rất tốt cho những người bị thiếu máu do thiếu sắt [9]
Nhờ có chứa nhiều beta-carotene nên xà lách được các nhà y học xem là

một ứng cử viên tiềm năng trong việc ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim
mạch, thấp khớp, đục thủy tinh thể Một nghiên cứu đã được thực hiện tại ĐH Y
khoa Utah (Mỹ) cho thấy rau xà lách có thể làm giảm tần suất rủi ro bị ung thư
ruột kết ở cả nam lẫn nữ, do trong cải xà lách có chứa một tác nhân kháng ung thư
là lutein. Do hàm lượng nước cao và các vitamin nên ăn xà lách còn giúp người sử
dụng có một làn da tươi mát. Ngoài những công dụng trên, ăn xà lách còn hưởng
được vô số lợi ích khác như giảm stress, chống lở loét, các bệnh nhiễm trùng
đường tiểu hóa….
Theo Đông y Trung Quốc thì xà lách vị đắng ngọt, hơi hàn. Công năng ích
ngũ tạng, thông kinh mạch, cứng gân cốt, lợi tiểu tiện và làm trắng răng đẹp da.
Dùng chữa tăng huyết áp viêm thận mạn, sữa không thông sau sinh nở [8]
12


c. Kỹ thuật trồng xà lách:
Thời vụ: Xà lách có thể trồng được quanh năm nhưng vụ Đông xuân và
Xuân hè cho năng suất cao hơn. Nếu trồng trong vụ Hè phải có giàn che nắng, hệ
thống nước tưới đẩy đủ.
Giống: Sử dụng một số giống có năng suất cao, kháng sâu bệnh tốt (xà lách
dún Trang Nông, xà lách hai mũi tên, xà lách búp Mineto ). Xử lý hạt giống trước
khi gieo bằng Rorval, Aliette, Benlat C, Viben C… Lượng giống gieo cho 500m
2
:
300g. Sau khi gieo phủ một lớp đất mỏng đã trộn phân huồng hoai, phủ một lớp
rơm mỏng. Mùa khô cần tưới đủ ẩm
Đất: Có thể trồng cải trên nhiều loại đất khác nhau, chủ động tưới tiêu. Đất
cần được cày xới, phơi ải trước 10 ngày trước khi lên liếp. Nên xử lý vôi trước khi
gieo trồng 30kg/500m
2
. Mùa mưa cần che phủ đất bằng rơm hoặc bạt nilon để hạn

chế cỏ dại và rửa trôi phân. Không nên trồng liên tục nhiều vụ rau cải trên cùng
chân đất. Lên luống: cao 15  20cm, rộng 90cm, rãnh 30cm, đất mặt luống phải
bằng phẳng, tơi xốp không gồ ghề để dễ phủ bạt và đục lỗ. Bón lót: toàn bộ phân
chuồng (200kg hữu cơ Humix), 30kg lân vi sinh, 30kg Bánh dầu, 3kg Ure, 3kg
Kali. Phủ bạt: dùng bạt kích cỡ 90cm, kéo căng, dùng ghim tre ghim thật chặt,
hoặc đắp đất cố định bạt.
Sâu và bệnh hại: Sâu hại chính trên cây họ cải gồm sâu xanh, sâu khoang,
sâu tơ, sâu xanh da láng sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh phòng trị: BT, Vi-BT,
Dipel, Delfin,
Amectin , Thiamectin, Centari….
Bệnh hại chính:
Chết cây con, thối nhũn, đốm vòng: sử dụng Aliette, COC85, Ridomil,
Monceren, Validacine phun phòng trị. Liều lượng phun có ghi trên bao bì sản
phẩm, chú ý ngừng phun thuốc trước khi thu hoạch 8-10 ngày.
Thu hoạch và bảo quản: Sau khi cấy ra ruộng 35  40 ngày có thể thu
hoạch, không để quá già làm giảm chất lượng sản phẩm, khi thu dùng dao cắt sát
gốc. Bảo quản cẩn thận, tránh để sản phẩm bị dập nát và bụi bặm bám vào, nên
đóng gói trước khi vận chuyển, phải đảm bảo tươi, sạch khi đưa ra tiêu thụ [8]
13


2.Những nghiên cứu khoa học về rau xà lách:
Nghiên cứu trồng rau xà lách trong một số dung dịch thủy canh nhằm sản
xuất rau an toàn của tác giả Lê Văn Thiên.
Nghiên cứu sự hút thu Cu, Pb, Zn và tìm hiểu khả năng sử dụng phân bón
để giảm thiểu sự tích lũy chúng trong rau cải xanh và rau xà lách của PGS.TS
Nguyễn Xuân Cự.
Studies on lettuce seed germination-I .Coumarin induced dormancy (nghiên
cứu sự nẩy mầm của rau xà lách và chất gây ngủ ở xà lách) của A.M.M.Berrie, W.
Parker, B.A.Knights and M.R.Hendrie. Departments of Botany and Chemistry,

University of Glasgow, Glasgow, France W.2.
Studies on irrigation systems to grow lettuce (Lactuca Sativa l.) Transplants
(Nghiên cứu trên hệ thống thủy lợi để phát triển rau xà lách) của S. Nicola,
J.Hoeberechts, E. Fontana.
2.2. GIỚI THIỆU VỀ PHÉP THỬ CẢM QUAN CHO ĐIỂM
2.2.1 Giới thiệu về phép thử
Trong thực tế nhiều khi người ta muốn so sánh nhiều mẫu với nhau về
nhiều tính chất cảm quan ở các mức độ khác nhau. Phép thử cho điểm thường
dùng để xác định xem mức độ khác nhau về một tính chất cảm quan nào đó giữa
hai hay nhiều sản phẩm là bao nhiêu.
Trong phép thử này người thử sẽ nhận được đồng thời tất cả sản phẩm đánh
giá. Những người này thường là những chuyên gia cảm quan, đã có thời gian dài
huấn luyện và làm việc trong lĩnh vực này. Sau khi nếm thử, người thử sẽ đánh giá
cường độ của tính chất cảm quan của mỗi sản phẩm thông qua một điểm số tương
ứng với một thuật ngữ mô tả cường độ tính chất ấy đã được quy định sẵn. Thang
điểm thường dùng trong phép thử này là thang điểm 6. Thang điểm hay thuật ngữ
mô tả cường độ là do người điều hành thí nghiệm lựa chọn, tuy nhiên cần tránh
những thuật ngữ không rõ nghĩa [11]
14


2.2.2 Phương pháp tiến hành
Để đảm bảo cho chất lượng của phép thử người ta lập phiếu chuẩn bị thí
nghiệm.Trên phiếu cũng gồm các nội dung như trật tự trình bày mẫu cho mỗi
người thử và cho mỗi lần cặp, các bộ mã số ngẫu nhiên dùng cho các mẫu, bảng
ghi lại kết quả cho điểm của người thử…
Trên phiếu trả lời của phép thử này ngoài phần giới thiệu của nội dung phép
thử thì cần ghi lại thang điểm sử dụng với những thuật ngữ mô tả cấp độ của tính
chất cần so sánh [11]
2.2.3 Xử lý kết quả

Trường hợp có 3 mẫu trở lên người ta thường dùng phương pháp phân tích
phương sai ANOVA (Analysis of Variance). Phương pháp giúp tính được chuẩn F
để kiểm định xem liệu ba mẫu có khác nhau không? Nếu có ta sẽ dùng chuẩn tiếp
t
student
để xác định mẫu nào khác mẫu nào hoặc các thành viên cho điểm có khác
nhau không.
Chuẩn F là tương quan giữa phương sai tính riêng cho từng yếu tố (mẫu hay
người thử) so với phương sai sai số của từng thực nghiệm. Nếu giá trị F tính được
lớn hơn hoặc bằng giá trị F
tc
ở một mức ý nghĩa nào đó thì sự khác nhau về yếu tố
đó được coi là có nghĩa ở mức ý nghĩa đó [11]
2.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes
2.3.1. Sơ lượt về vi khuẩn
2.3.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật.
Vi sinh vật (microorganisms) là tên gọi chung tất cả các vi sinh vật nhỏ bé,
muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi.
Chúng sống mọi nơi trên trên trái đất, ngay cả trong những nơi mà điều kiện
tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển cúa chúng. Trong đường
ruột của con người có không dưới 100  400 loài vi sinh vật khác nhau, chúng
chiếm tới 1/3 khối lượng khô của phân. Chiếm số lượng cao nhất trong đường ruột
15


của người là vi khuẩn Bactiroides Fragilis, gấp 100  1000 lần số lượng của vi
khuẩn Escherichia coli. Ở độ sâu 10.000m của Đông Thái Bình Dương, nơi hoàn
toàn tối tăm lạnh lẽo và có áp suất cao người ta vẫn phát hiện thấy có khoảng 1
triệu  10 tỉ vi khuẩn/1ml (chủ yếu là vi khuẩn Lưu huỳnh). Ở dộ cao tới 84 km
người ta vẫn phát hiện thấy có vi sinh vật. Mặt khác khi khoang lớp đá trầm tích

sâu tới 427m ở châu nam cực người ta vẫn phát hiện vi sinh vật sống.
Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường
kính cúa phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2  2 µm, chiều dài cơ thể
khoảng 0,5-8,0 µm. Những hình dạng chyủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que,
hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có sợi Mỗi tế bào vi khuẩn đều rất nhỏ và trong
suốt.Vì thế khi dùng phương pháp soi tươi (phương pháp giọt treo) dưới kính hiển
vi chỉ có thể thấy được đại thể về hình dạng và tình trạng di động của chúng hoặc
muốn biết vi khuẩn đó là gram dương hay gram âm dùng phương pháp nhuộm
gram.
Có khả năng hấp thụ nhiều, chuyển hóa nhanh. Chẳng hạn vi khuẩn lactic
(Lactobacillus) trong một giờ có thể phân giải lượng đường Lactozơ nặng hơn 1000 
10000 lần khối lượng của chúng, còn ở nấm men rượu (Sacharomyces cerevisiae) là
110, ở vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas là 1200, ở vi khuẩn thuộc chi Azotobacter là
2000. Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ của vi sinh vật dẫn đến những tác dụng
hết sức lớn lao của chúng trong thiên nhiên cũng như hoạt động sống của con người.
Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh. So các vi sinh vật khác thì vi sinh vật
có tốc độ sinh trưởng và sinh sôi nẩy nở cực kỳ lớn. Vi khuẩn Escherichia coli
trong điều kiện thích hợp cứ khoảng 12  20 phút lại phân cắt 1 lần. Thường tính
chung khoảng 20 phút phân cắt 3 lần, 24 giờ phân cắt 72 lần, và từ 1 tế bào ban
đầu sẽ sinh ra 4.722.366.500.000.000.000.000 tế bào (nặng 4722 tấn). Tất nhiên
trong thực tế không thể tạo ra các điều kiện sinh trưởng lí tưởng như vậy được cho
nên số lượng vi khuẩn thu được trong 11 ml dịch nuôi cấy thường chỉ đạt từ 10
8

10
9
. Thời gian thế hệ của Sacharomyces cerevisiae là 120 phút, cuả vi khuẩn lam
là 23 giờ.
16

Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị. Người ta nhận thấy số
lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào vi sinh vật.
Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên sức sống ở nhiệt độ nitơ lỏng (-196
0
C),
thậm chí ở nhiệt độ của hidro lỏng (-253
0
C). Chúng dồng thời cũng dễ phát sinh
biến dị bởi vì thường là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc
trực tiếp với môi trường sống. Tần số biến dị ở vi sinh vật là 10
-5
 10
-10
. Hình thức
biến dị là đột biến gene và dẫn đến nhiều thay đổi về hình thái cấu tạo, kiểu tao đổi
chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, tính đề kháng…. [1]
2.3.1.2. Cấu tạo của vi sinh vật:
a.Thành tế bào :
Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ sự chuyển
động của tiên mao (flagellum), giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ
quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên
quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể
(bacteriophage).
Năm 1884 H.Christian Gram đã phát hiện ra phương pháp nhuộm phân biệt
để phân chia vi khuẩn thành 2 nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (G+) và vi
khuẩn Gram âm (G-). Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi
định loại vi sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như
sau:
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của gram (+) và gram (-)

Gram dương Gram âm
Thành phần
Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào

Peptidoglycan 30-95 5-20
Acid teicoic (Teichoic acid)

Cao 0
Lipid Hầu như không có

20
Protein Không có hoặc có ít

Cao
17


Peptidoglycan là loại polyme xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi 3 thành phần:
- N-Acetylglucosamin ( N-Acetylglucosamine, NAG)
- Acid N-Acetylmuramic (N-Acetylmuramic acid, NAM)
- Tetrapeptid chứa cả D- và L- acid amin
b. Màng sinh chất:
Màng sinh chất hay Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi
khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp
phospholipid (PL), chiếm 30  40% khối lượng của màng, và các protein (nằm
trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60  70% khối lượng của màng. Đầu
phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước, đuôi hydrocarbon không tích điện,
không phân cực, kỵ nước.
Cytoplasmic membrane có các chức năng chủ yếu sau đây:
 Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

 Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào
 Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của
bao nhày (capsule)
 Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl
quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)
 Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp.
 Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao
c. Tế bào chất :
Tế bào chất (TBC- Cytoplasm) là phần vật chất dạng keo nằm bên trong
màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic,
hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử
thấp.
18


Bào quan đáng lưu ý trong TBC là ribosom. Ribosom nằm tự do trong tế
bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của TBC. Ribosom gồm 2 tiểu phần
(50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn
vị Svedberg - đại lượng đo tốc độ lắng khi siêu ly tâm).
Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt
glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt
dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh.
Ở loài vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus
còn gặp tinh thể độc (parasoral body) hình quả trám, có bản chất protein và chứa
những độc tố có thể giết hại trên 100 loài sâu hại (tinh thể độc chỉ giải phóng độc
tố trong môi trường kiềm do đó các vi khuẩn này hoàn toàn vô hại với người, gia
súc, gia cầm, thuỷ hải sản- có hại đối với tằm).
d. Thể nhân:
Thể nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng
nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi

nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó
là 1 nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép
(ở Xạ khuẩn Streptomyces có thể gặp nhiễm sắc thể dạng thẳng). NST ở vi khuẩn
Escherichia coli dài tới 1mm (!), có khối lượng phân tử là 3.10
9
, chứa 4,6.10
6
cặp
base nitơ. Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn.
Ngoài NST, trong tế bào nhiều vi khuẩn còn gặp những ADN ngoài NST.
Đó là những ADN xoắn kép có dạng vòng khép kín, có khả năng sao chép độc lập,
chúng có tên là Plasmid.
e. Bao nhầy:
Bao nhầy hay Giáp mạc (Capsule) gặp ở một số loài vi khuẩn với các mức
độ khác nhau:
- Bao nhầy mỏng (Vi giáp mạc, Microcapssule)
19


- Bao nhầy (Giáp mạc, Capsule)
- Khối nhầy (Zooglea)
Muốn quan sát bao nhầy thường lên tiêu bản với mực tàu, bao nhày có màu
trắng hiện lên trên nền tối.
Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid
và protein.Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose,
acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic
Ý nghĩa sinh học của bao nhầy:
- Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, bảo vệ vi khuẩn tránh bị thực bào
(trường hợp Phế cầu khuẩn-Diplococcus pneumoniae).
- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn.

- Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan )
- Giúp vi khuẩn bám vào giá thể (trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như
Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans ).
i. Tiên mao và khuẩn mao :
Tiên mao (Lông roi, flagella) không phải có mặt ở mọi vi khuẩn, chúng
quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi
lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương
pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên
mao. Để xác định xem vi khuẩn có tiên mao hay không còn có cách thử gián tiếp
nhằm biết khả năng di động của chúng. Cấy bằng que cấy nhọn đầu vào môi
trường thạch đứng chứa 0,4% thạch (agar-agar), còn gọi là môi trường thạch mềm.
Nếu thấy vết cấy lan nhanh ra xung quanh thì chứng tỏ là vi khuẩn có tiên mao, có
khả năng di động.
Tiên mao có thể gốc (basal body), gồm 1 trụ nhỏ được gắn với 4 đĩa tròn (vi
khuẩn G
-
) có dạng vòng nhẫn (ring), ký hiệu là các vòng L, P, S và M. Vòng L
nằm ngoài cùng, tương ứng với lớp liposaccarid của màng ngoài; vòng P tương
20


ứng với lớp peptidoglycan, vòng S tương ứng với lớp không gian chu chất; vòng
M nằm ở trong cùng. Vi khuẩn G
+
chỉ có 2 vòng: 1 vòng nằm ngoài tương ứng với
thành tế bào và 1 vòng trong tương ứng với màng sinh chất. Xuyên giữa các vòng
là 1 trụ nhỏ (rod) có đường kính 7nm. Bao bọc tiêm mao ở phần phía ngoài là một
bao ngắn có hình móc (hook). Sợi tiên mao (filament) dài khoảng 10  200m và
có đường kính khoảng 13  20nm. Đường kính của bao hình móc là 17nm.
Khoảng cách giữa vòng S và vòng M là 3mm, giữa vòng P và vòng L là 9nm, giữa

vòng P và vòng S là 12nm. Đường kính của các vòng là 22nm, đường kính các lỗ ở
các vòng là 10nm. Khoảng cách từ mặt ngoài của vòng L đến mặt trong của vòng
M là 27nm. Sợi tiên mao cấu tạo bởi loại protein có tên là flagellin, có trọng lượng
phân tử là 30.000  60 000. Một số vi khuẩn có bao lông (sheath) bao bọc suốt
chiều dài sợi, như ở trường hợp chi Bdellovibrio hay vi khuẩn tả Vibrio cholera.

Hình 2.2: Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn
Tiên mao của vi khuẩn có các loại khác nhau tuỳ từng loài :
- Không có tiên mao (vô mao, atrichia)
- Có 1 tiên mao mọc ở cực (đơn mao, monotricha)
- Có 1 chùm tiên mao mọc ở cực (chùm mao, lophotricha)
- Có 2 chùm tiên mao mọc ở 2 cực (song chùm mao, amphitricha)
- Có nhiều tiên mao mọc khắp quanh tế bào (chu mao, peritricha)
- Có loại tiên mao mọc ở giữa tế bào như trường hợp vi khuẩn Selenomonas
ruminantium.
21



Hình 2.3: Các loại tiên mao ở vi khuẩn
Kiểu sắp xếp tiên mao liên quan đến hình thức di động của vi khuẩn. Tiên mao
mọc ở cực giúp vi khuẩn di động theo kiẻu tiến - lùi. Chúng đảo ngược hướng bằng
cách đảo ngược hướng quay của tiên mao. Vi khuẩn chu mao di động theo hướng nào
thì các tiên mao chuyển động theo hướng ngược lại. Khi tiên mao không tụ lại về một
hướng thì vi khuẩn chuyển động theo kiểu nhào lộn. Tốc độ di chuyển của vi khuẩn
có tiên mao thường vào khoảng 20  80µm/giây, nghĩa là trong 1 giây chuyển động
được một khoảng cách lớn hơn gấp 20  80 lần so với chiều dài của cơ thể chúng.
Các chi vi khuẩn thường có tiên mao là Vibrio, Spirillum, Pseudomonas,
Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus Ở các chi Clostridium, Bacterium,
Bacillus có loài có tiên mao có loài không. Ở cầu khuẩn chỉ có 1 chi

(Planococcus) là có tiên mao. Xoắn thể có một dạng tiên mao đặc biệt gọi là tiên
mao chu chất (periplasmic flagella), hay còn gọi là sợi trục (axial fibrils), xuất phát
từ cực tế bào và quấn quang cơ thể. Chúng giúp xoắn thể chuyển động được nhờ
sự uốn vặn tế bào theo kiểu vặn nút chai.
f. Khuẩn mao và Khuẩn mao giới:
Khuẩn mao (hay Tiêm mao, Nhung mao, Fimbriae) là những sợi lông rất
mảnh, rất ngắn mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có
đường kính khoảng 7  9nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2  2,5nm), số lượng
khoảng 250-300 sợi/ vi khuẩn. Kết cấu của khuẩn mao giản đơn hơn nhiều so với
tiên mao. Chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể (nhiều vi khuẩn gây
22


bệnh dùng khuẩn mao để bám chặt vào màng nhầy của đường hô hấp, đường tiêu
hoá, đường tiết niệu của người và động vật).

Hình 2.4: Khuẩn mao ở vi khuẩn E.coli
Có một loại khuẩn mao đặt biệt gọi là khuẩn mao giới (Sex pili, Sex pilus-số
nhiều) có thể gặp ở một số vi khuẩn với số lượng chỉ có 1  10/ vi khuẩn. Nó có cấu
tạo giống khuẩn mao, đường kính khoảng 9-10nm nhưng có thể rất dài. Chúng có thể
nối liền giữa hai vi khuẩn và làm cầu nối để chuyển vật chất di truyền (ADN) từ thể
cho (donor) sang thể nhận (recipient). Quá trình này được gọi là quá trình giao phối
(mating) hay tiếp hợp (conjugation). Một số thực khuẩn thể (bacteriophage) bám vào
các thụ thể (receptors) ở khuẩn mao giới và bắt đầu chu trình phát triển của chúng [1]
3. Các loài vi khuẩn:
Vi sinh vật được chia thành nhiều nhóm khác nhau.Những nhóm chủ yếu là
vi khuẩn, xạ khuẩn (Actinomycetes), vi khuẩn lam (Cyanobacteria), và nhóm vi
khuẩn nguyên thủy Micoplatma (Mycoplasma), Ricketxi (Ricketsia), Clamidia
(Chlamydia) [1]
2.3.2. Giới thiệu chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria

monocytogenes.
Listeria spp là giống vi khuẩn gram dương, kị khí tùy ý, có hình gậy ngắn,
mảnh, không hình thành bào tử. Chúng gồm 6 loài: L. monocytogenes, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii và L. grayi . Tuy nhiên, trong đó chỉ có loài
L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh thực sự ở người [16][14]
23


Các loài vi khuẩn Listeria spp dung nạp với những điều kiện khắc nghiệt
như độ pH thấp, nhiệt độ thấp và điều kiện muối cao [3][14]. Do đó chúng có thể
được tìm thấy trong nhiều môi trường, bao gồm đất, nước thải, nước, chất thải và
các loại thực phẩm. Do toàn cầu hoá và sự tiêu thụ gia tăng của các thức ăn nhanh
trên toàn thế giới, nên L. monocytogenes đã trở thành là một tác nhân gây bệnh cơ
hội thực phẩm quan trọng hiện nay [18]

Hình 2.5: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Hình 2.6: Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử.
Listeria monocytogenes vào những năm gần đây nổi lên như một tác nhân
gây bệnh từ thực phẩm quan trọng, ví dụ như ở Canada xẩy ra 12 vụ thiệt mạng do
vi khuẩn này gây ra với thiệt hại ước tính 19 triệu USD [18], nhiều bệnh nhân nữ ở
bênh viện Hùng Vương, Tp HCM có dấu hiệu thai bị tổn thương, nhau thai bị
nhiễm L. monocytogenes.[5]
24


2.3.2.1. Hình thái và cấu tạo
Listeria monocytogenes là một loại trực khuẩn gram dương, ngắn, nhỏ,
không sinh bào tử, nhờ có tiên mao mọc ở cực nên chúng có kiểu chuyển động
xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt ép [3]

2.3.2.2. Khả năng chịu đựng
Chúng có thể chịu được độ mặn và pH ở khoảng rộng giữa 5 và 9, không
chịu được nóng L. monocytogenes thuộc loại ưa lạnh, khả năng đặc biệt của chúng
là sống rất dai và phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2.5
0
C và cao đến 44
0
C [3]
2.3.2.3. Phân bố và nguồn lây nhiễm
Listeria monocytogenes có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên và bị cách ly
khỏi nước, đất và chất thực vật. Vi khuẩn này có thể truyền qua cơ thể người qua
đường ăn uống những thực phẩm nhiễm bẩn hoặc ăn sống. Sự nhiễm bẩn có thể
xảy ra bất kỳ khâu nào trong quá trình sản xuất sản phẩm từ nông trường, khâu chế
biến, phân phối, bảo quản,… những loại thực phẩm đặc biệt liên kết với loài
Listeria monocytogenes gồm: sản phẩm sữa đặc biệt như pho mát mềm, kem,
bơ…, thịt pate và thịt jambon, thịt gà, trứng, hải sản, các loại rau ăn sống, thức ăn
chế biến sẵn hay để lạnh [3].
2.3.2.4. Đặc điểm gây bệnh.
Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes được gọi chung là bênh
Listeriosis là tình trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm
bị nhiễm Listeria monocytogenes. Loại vi khuẩn Listeria monocytogenes được Tổ
chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực
an toàn vệ sinh thực phẩm [19].
Bệnh Listeriosis là căn bệnh đơn phát của con người và động vật, đặc biệt là
những người suy giảm miễn dịch hoặc đang mang thai bị gây ra bởi loại vi khuẩn
Listeria monocytogenes. Sự nhiễm khuẩn này trên cừu và một số động vật khác
thường xuyên có liên quan đến hệ thần kinh, các biểu hiện chính là nhiễm trùng
huyết và gan bị hoại tử. Các bệnh như viêm màng não, viêm phổi, sảy thai, viêm
25

nội tâm mạc và một số bệnh di căn đều có liên quan đến Listerioris Đây thực sự
là một trong những bệnh thực phẩm quan trọng [16].
Biểu hiện gây bệnh: L. monocytogenes là một nguồn gây bệnh nội bào.
Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ.
Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào và gây
nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có
thể thâm nhập bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai, đẻ non, hoặc nhiễm trùng máu.
Hiện nay liều lượng gây bệnh của L. monocytogenes hiện vẫn chưa được nghiên
cứu.
Những người có nguy cơ nhiễm trùng Listeria monocytogenes cao:
 Phụ nữ mang thai và thai nhi / trẻ sơ sinh.
 Những người lớn tuổi.
 Những người có hệ thống miễn dịch suy yếu: Những người bị AIDS
dễ bị nhiễm Listeria hơn 300 lần so với những người có hệ miễn dịch
bình thường.
Phụ nữ mang thai nguy cơ mắc bệnh nhiễm Listeria monocytogenes gấp 20
lần so với người lớn khỏe mạnh khác. Nếu một người phụ nữ mang thai phát triển
Listeria monocytogene trong ba tháng đầu của thai kỳ của mình, có thể đẻ non.
Biểu hiện căn bệnh giống như cúm nhẹ với ớn lạnh, mệt mỏi, đau đầu cũng như
đau cơ bắp và khớp. Bệnh nhiễm Listeria monocytogenes ở giai đoạn sau trong
mang thai có thể dẫn đến thai chết lưu hoặc dị tật.Tỷ lệ tử vong chiếm gần 20 
40% ở trẻ sơ sinh nhiễm Listeria monocytogenes bùng phát sớm và ở trẻ bùng phát
muộn là 0  20%. Tỷ lệ tử vong ở trẻ lớn là dưới 10%. Não úng thủy, chậm phát
triển tâm thần là những di chứng thường gặp ở trẻ sống sót. Bệnh thường không
ảnh hưởng nặng đến sức khỏe và tính mạng của mẹ. Trẻ sơ sinh có thể được sinh
ra với bệnh nhiễm Listeria monocytogenes nếu mẹ ăn thực phẩm bị ô nhiễm trong
thai kỳ. Người khỏe mạnh có thể tiêu thụ các loại thực phẩm bị ô nhiễm mà không
trở thành bệnh, nhưng những người có nguy cơ nhiễm trùng Listeria