Bước đầu nghiên cứu cơ chế viêm của cá giò (rachycentron canadum) sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu và không có nhũ dầu bằng phương pháp mô học

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 i Đại học Nha Trang

Lời cảm ơn
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của thầy cô giáo
Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Trường ĐH Nha Trang và các anh chị tại Trung tâm
Nghiên cứu Quan trắc và Cảnh báo Môi trường dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Bắc
(CEDMA) - Viện NCNTTS 1. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm
Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Phòng thí nghiệm CEDMA đã
tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và tài trợ kinh phí để tôi hoàn thành tốt chương trình
thực tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts. Phan Thị Vân, Ths. Võ Anh Tú, Ks
Đồng Thanh Hà và Ks Nguyễn Thị Thu Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy trong suốt
quá trình tôi thực tập tốt nghiệp và hoàn thành bài khóa luận. Ths. Võ Anh Tú là người
hướng dẫn, người chị luôn theo sát, đóng góp ý kiến kịp thời và tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn chị vì sự giúp đỡ nhiệt tình và những ý kiến đóng
góp quý báu trong suốt thời gian qua. Đặc biệt tôi xin cảm ơn cô giáo hướng dẫn Ths.
Phạm Thị Thúy Nga đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại
trường Đại học Nha Trang.
Tập thể 49 Bệnh học đã cùng tôi đi suốt chặng đường 4 năm học với biết bao niềm
vui, sự thương yêu chân thành. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo chủ nhiệm và các
bạn vì những tình cảm đó và cho tôi học hỏi được rất nhiều điều từ cuộc sống.
Cuối cùng, lời cảm ơn chân thành nhất xin được gửi tới bố mẹ và gia đình đã luôn
bên cạnh, động viên, giúp tôi cố gắng vươn lên.
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có nhiều cố gắng, tuy nhiên
thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót nhất
định. Tôi rất mong được sự quan tâm, góp ý của các thầy cô, anh chị và các bạn để
khóa luận hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Bắc Ninh, ngày 15 tháng 6 năm 2011

SV: Nguyễn Thị Phương Huyền
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 ii Đại học Nha Trang

Mục lục
Lời cảm ơn i
Danh mục hình iv
Danh mục từ viết tắt vi
Phần I: LỜI MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu. 2
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
Phần II: TỔNG QUAN 3
2.1. Tình hình nuôi cá Giò trên Thế giới và ở Việt Nam 3
2.1.1. Tình hình nuôi cá Giò trên Thế giới 3
2.1.2. Tình hình nuôi cá Giò tại Việt Nam 4
2.2. Tình hình bệnh vi khuẩn trên cá Giò 4
2.2.1. Tình hình bệnh vi khuẩn cá Giò trên Thế giới 4
2.2.2. Tình hình bệnh vi khuẩn trên cá Giò tại Việt Nam 5
2.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản 6
2.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS trên thế giới
6
2.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS ở Việt Nam
7
2.4. Cơ chế viêm trong đáp ứng miễn dịch ở cá 8
Phần III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 10
3.2. Đối tượng nghiên cứu 10

3.3. Phương pháp nghiên cứu 11
3.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài 11
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 12
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 iii Đại học Nha Trang

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu mô học 14
Phần IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Kết quả nghiên cứu 17
4.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá Giò khỏe 17
4.1.2 Biến đổi mô học cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu 18
4.1.3 Biến đổi mô bệnh học cá Giò sau khi tiêm vắc xin không có nhũ
dầu 24
4.1.4 Biến đổi mô học cá Giò sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 33
4.2 Thảo luận 47
4.2.1 Quá trình viêm 47
4.2.2 Sự tiến triển của ổ viêm sau khi tiêm nhũ dầu, vắc xin và vắc xin
nhũ dầu 49
Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
5.1. Kết luận 53
5.2. Kiến nghị 54
Tài liệu tham khảo 55
Tài liệu tiếng Việt: 55
Tài liệu tiếng Anh: 56
Tài liệu Internet: 57

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 iv Đại học Nha Trang

Danh mục hình
Hình 1: Cá Giò (Rachycentroncanadum) 10
Hình 2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài 11
Hình 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 12
Hình 4: Vắc xin bất hoạt vi khuẩn Vibrio và nhũ dầu 13
Hình 5: Các bể bố trí thí nghiệm 13
Hình 6: Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học 14
Hình 7: Mô cơ cá Giò bình thường 17
Hình 8: Mô cơ cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu 3 ngày, H&E; ×40. 18
Hình 9: Ổ viêm hình thành trong mô cơ 3 ngày sau khi tiêm nhũ dầu 19
Hình 10: Biến đổi mô cá Giò tại ổ viêm 3 ngày sau khi tiêm nhũ dầu 20
Hình 11: Mô cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu 7 ngày 22
Hình 12: Ổ viêm 14 ngày sau khi tiêm nhũ dầu 23
Hình 13: Mô cơ cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu 21 ngày 24
Hình 14: Biến đổi mô cơ cá Giò 3 ngày sau khi tiêm vắc xin bất hoạt 25
Hình 15: Ổ viêm hình thành sau 7 ngày tiêm vắc xin. 27
Hình 16: Ổ viêm hình thành trong cơ 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, H&E; ×40 28
Hình 17: Hình thành 4 lớp tế bào tại ổ viêm 14 ngày tiêm vắc xin bất hoạt. 29
Hình 18: Ổ viêm hình thành trong cơ 21 ngày sau khi tiêm vắc xin 31
Hình 19: Các lớp tế bào trong ổ viêm sau 21 ngày tiêm vắc xin, H&E;× 1000 32
Hình 20: Mô cơ 1 ngày sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu, H&E;×100 33

Hình 21: Cấu trúc cơ bị biến đổi sau khi tiêm 1 ngày. 34
Hình 22: Tiêu bản mô cơ 3 ngày sau sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu, H&E. 35
Hình 23: Mô cơ cá Giò 3 ngày sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu, H&E; ×40 35
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 v Đại học Nha Trang

Hình 24: Biến đổi mô học cá Giò 3 ngày sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu 37
Hình 25: Tiêu bản mô cơ 7 ngày sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu 38
Hình 26: Ổ viêm (khoanh tròn) sau 7 ngày tiêm vắc xin nhũ dầu 38
Hình 27: Biến đổi mô tại ổ viêm 7 ngày sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu. 39
Hình 28: Các lớp tế bào hình thành sau 7 ngày tiêm vắc xin nhũ dầu, H&E; ×1000.
41
Hình 29: Tiêu bản mô cơ cá Giò 14 ngày 42
Hình 30: Ổ viêm sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 14 ngày, H&E; ×100. 42
Hình 31: Biến đổi mô tại ổ viêm sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 14 ngày. 43
Hình 32: Mô cơ sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 21 ngày. 45

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 vi Đại học Nha Trang

Danh mục từ viết tắt
BKD :

Bacteria Kiney Disease (Bệnh vi khuẩn ở thận)
CFA : Complete Freund’s Adjuvant (Chất bổ trợ hoàn chỉnh)
e :

erythrocyte ( Tế bào Hồng cầu)
ERM

:

Enteric Redmouth (Bệnh xuất huyết đường tiêu hóa)
FAO :

Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc)
H&E :

Hematocylin và Eosin
L :

Lympho bào
M :

Macrophago (Đại thực bào)
NTTS

:

Nuôi trồng thủy sản
O :

Drop oil (Giọt dầu)
SRBC

:

Seep Red Blood Cells (Hồng cầu cừu)
WBC

:

White blood cell (bạch cầu)



Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 1 Đại học Nha Trang

Phần I: LỜI MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Cá Giò (Rachycentron canadum) là một trong những đối tượng nuôi mới có giá trị
cao trong nghề nuôi cá biển Việt Nam. Tuy nhiên đây cũng là đối tượng gặp rủi ro
về dịch bệnh, nhất là vào thời điểm tháng 4-5 và tháng 8-9 hàng năm là thời điểm cá
Giò nuôi phát bệnh mạnh. Trong số những tác nhân gây bệnh thì vi khuẩn chiếm tỷ
lệ khá lớn, đã phân lập được một số loài: Vibrio alginiticus, V.vulnificus, V.cholene,
V.parahaemolyticus, V.anguillarum và một loài Pseudomonas sp (Phan Thị Vân và
ctv, 2006). Bệnh do vi khuẩn Vibrio gặp với tỉ lệ cao lên tới 100% ở cá nuôi lồng,
58,3% ở cá nuôi ao và mọi kích cỡ đều có thể nhiễm bệnh (Đỗ Thị Hòa và ctv,
2008). Năm 2000, bệnh Vibriosis đã phát tán thành dịch trên cá Giò giống ở Đài
Loan với tỉ lệ chết khoảng 45% gây thiệt hại khá lớn.
Những nghiên cứu trước đây cho thấy phòng bệnh vi khuẩn cho cá bằng vắc xin
có hiệu quả cao, khắc phục được nhược điểm của việc sử dụng hóa dược trị bệnh
như: bệnh Vibriosis, bệnh do Vibrio mùa lạnh, bệnh xuất huyết đường tiêu hóa
(ERM), bệnh lở loét (furunculosis) (Ellis 1997; Gudding và ctv,1997) trên cá Hồi.
Trước tình hình phát triển của nghề nuôi cá biển và dịch bệnh ngày càng gia tăng,
Bộ Thủy sản đã giao cho Viện nghiên cứu NTTS 1 thực hiện đề tài “Nghiên cứu và
sản xuất vắc xin phòng bệnh Vibriosis trên cá Giò”. Đến nay đề tài đã đạt được
một số thành công bước đầu và đang tiến hành giai đoạn thử nghiệm vắc xin trên cá
Giò tại một số tỉnh như Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa.
Theo Robert R.J và ctv (2001), nhiều loại vắc xin chưa được sử dụng trong các sản
phẩm thương mại do gây nên phản ứng viêm cục bộ tại vị trí dẫn truyền kháng
nguyên. Viêm là một đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu đầu tiên của cơ thể trước
sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Đặc điểm cơ bản của phản ứng viêm là tăng tính
thấm thành mạch, hóa ứng động bạch cầu đến ổ viêm, tiết các chất nhằm tiêu diệt
hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương. Khi viêm không lành sẽ có thể trở
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 2 Đại học Nha Trang

thành viêm mãn tính, sinh sản có giới hạn về không gian thời gian và ngừng lại khi
hết kích thích.
Nghiên cứu cơ chế viêm là một phần quan trọng trong nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch của cơ thể cá sau khi tiêm vắc xin. Những nghiên cứu đi sâu vào tìm hiểu cơ
chế viêm trên cá sau khi tiêm vắc xin còn hạn chế. Do đó, Viện nghiên cứu NTTS 1
đã cho phép tôi thực hiện nội dung nghiên cứu nhỏ với tiêu đề “Bước đầu nghiên
cứu cơ chế viêm của cá Giò (Rachycentron canadum) sau khi tiêm vắc xin có
nhũ dầu và không có nhũ dầu bằng phương pháp mô học”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.
 Nghiên cứu biến đổi mô học tại vùng tiêm kháng nguyên.
 Bước đầu nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các thành phần
chính trong vắc xin gồm nhũ dầu, vi khuẩn bất hoạt và nhũ dầu kết hợp với vi
khuẩn bất hoạt.
1.3. Nội dung nghiên cứu
 So sánh biến đổi mô học tại vị trí tiêm nhũ dầu, vi khuẩn bất hoạt và vắc xin
nhũ dầu trên cơ cá Giò bằng phương pháp mô học ở 1, 3, 7, 14, 21 ngày sau khi
tiêm.
 Bằng phương pháp mô học có thể phát hiện được một số loại tế bào tham gia
trong phản ứng viêm của cá Giò.





Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 3 Đại học Nha Trang

Phần II: TỔNG QUAN


2.1. Tình hình nuôi cá Giò trên Thế giới và ở Việt Nam
2.1.1. Tình hình nuôi cá Giò trên Thế giới
Cá Giò (Rachycentron canadum) là đối tượng nuôi mới có nhiều triển vọng, đã
được nhiều nước trên thế giới từ Bắc Mỹ tới châu Á tiến hành nghiên cứu và đưa
vào sản xuất. Ở khu vực Bắc Mỹ đã cho sinh sản nhân tạo thành công bằng cách
tiêm hooc môn sinh dục cho cá bố mẹ thu ngoài tự nhiên và tiến hành nuôi thương
phẩm cá Giò (Arnold, 2002; Lê Xân và Nguyễn Quang Huy, 2005). Hiện nay, cá
Giò được nuôi thương mại ở rất nhiều nước trên thế giới như Mexico, Mỹ, Trung
Quốc, Philippin… (FAO, 2006).
Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thuỷ sản ở Châu Á phát triển mạnh, đặc
biệt là nghề nuôi biển. Cá Giò được xem là đối tượng mới với nhiều ưu điểm và
tiềm năng để phát triển thành đối tượng nuôi thương phẩm, có giá trị kinh tế cao. Cá
Giò có thể trở thành ứng viên xuất sắc cho sự phát triển trong tương lai của ngành
nuôi trồng thuỷ sản ở khu vực này. Mặc dù tình hình nuôi cá Giò hiện nay còn gặp
không ít khó khăn, song theo đánh giá của Niels Svennevig (2001) thì những điều
kiện phát triển ban đầu của cá Giò dường như còn tốt hơn so với cá hồi Đại Tây
Dương.
Tại Trung Quốc, từ năm 1992 đã bắt đầu tiến hành nuôi cá Giò (Yu, 1999) đến
năm 1997 đã có được công nghệ sản xuất giống hàng loạt (Yeh, 1998). Cá Giò
nhanh chóng chiếm ưu thế và trở thành loài nuôi công nghiệp trong hệ thống nuôi
lồng xa bờ. Đến năm 1999, Trung Quốc đã có 4 trại sản xuất cá bột và cá giống,
riêng năm 1998 sản xuất được 1,4 triệu cá bột; năm 1999 sản xuất được trên 2 triệu
cá bột chuyển cho các vùng nuôi trong nước và xuất khẩu sang Việt Nam.
Đài Loan là nước đầu tiên nghiên cứu về sinh sản nhân tạo giống cá Giò từ năm
1990 và đến năm 1997 đã đưa ra được quy trình công nghệ sản xuất con giống hàng
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 4 Đại học Nha Trang

loạt (Chang và ctv, 1999). Cho đến nay Đài Loan là nước dẫn đầu về sản xuất giống
và nuôi thương phẩm cá Giò, chiếm 80% lồng nuôi biển với sản lượng đạt 1.500 tấn
năm 1999 (Su và ctv, 2000) và đạt 5.000 tấn năm 2004 (Nguyễn Quang Huy và ctv,
2008).
Ngoài ra, cá Giò đã và đang được sản xuất giống và nuôi thương phẩm tại một số
nước như Nhật Bản, Mỹ, Austraylia, Trung Quốc, Malaysia, Singapo, Cu Ba, Hàn
Quốc và Việt Nam…
2.1.2. Tình hình nuôi cá Giò tại Việt Nam
Việt Nam được xem là nước đứng “hàng thứ 3” trên thế giới về sản xuất giống và
nuôi cá Giò (Niels Svennevig, 2001). Những năm gần đây, bên cạnh các đối tượng
nuôi biển khác như cá Song (Epinephelus spp), cá Hồng (Lutjanus spp), cá Cam
(Seriola dummerili), tôm Hùm (Panurilus spp), Trai ngọc (Pinctada spp)…, cá Giò
là đối tượng nuôi hấp dẫn và được nuôi khá phổ biển ở các vùng kín sóng gió ở các
tỉnh như Quảng Ninh, Hải phòng, Nghệ An ở phía Bắc và Vũng Tàu, Kiên Giang và
nhất là khu vực phía Nam (Nguyễn Quang Huy, 2002). Cá Giò đã được các nhà
khoa học Viện Nghiên cứu Hải sản bắt đầu nghiên cứu từ năm 1995, đến nay công
nghệ sản xuất giống đã và đang được hoàn thiện. Đây được đánh giá là đối tượng
nuôi có giá trị kinh tế cao, tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi, tỷ lệ sống, năng suất
nuôi cao (KHCN&KT Thủy sản, 2004).
2.2. Tình hình bệnh vi khuẩn trên cá Giò
2.2.1. Tình hình bệnh vi khuẩn cá Giò trên Thế giới
Cá Giò được đánh giá là nhạy cảm với ba nhóm tác nhân chính là virus, vi khuẩn
và kí sinh trùng làm cản trở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản
cũng như nuôi thương phẩm. Các bệnh virus Lymphocystis và bệnh ký sinh trùng
Myxosporidosis do Trichodina spp, Neobenedenia spp và Amylodinium spp cũng có
thể ảnh hưởng đến cá Giò (Kaiser và Holt, 2005). Tuy nhiên, theo các báo cáo thì
bệnh do vi khuẩn gây ra lại chiếm tỷ lệ khá lớn như bệnh Mycobacteriosis,
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản

Khóa luận tốt nghiệp - 2011 5 Đại học Nha Trang

Vibriosis và Streptococcosis do các tác nhân Mycobacterium marinum, Vibrio
anguillarum và V. ordalii, Pasteurella piscicida và Streptococcus spp (Liao và ctv,
2004; Lowery và Smith, 2006).
Năm 2000, bệnh Vibriosis phát tán thành dịch trên cá Giò giống ở Đài Loan, tỉ lệ
chết khoảng 45%. V.alginolyticus đã thấy xuất hiện trên cá Giò ở kích thước 100-
120g và 8-12 g và được phân lập, xác định là tác nhân gây bệnh chính, ngoài ra còn
có sự có mặt của V.vulnificus và V.parahaemolyticus (Rajan và ctv, 2001) với tỷ lệ
nhiễm tới 100% (Reed và Francis-Floyd, 2002) và tỷ lệ chết trên 80% (Liu và ctv,
2004). Theo Liu và ctv (2004) đã xác định vi khuẩn Vibrio là một tác nhân gây
bệnh chính trên cá Giò với những biểu hiện như: xuất huyết mang, đầu, bụng và các
gốc vây, đặc biệt là các vây ngực, xuất huyết trong gan và ruột, đôi khi có thể là
viêm loét vây lưng và cơ bụng (Liu và ctv, 2006).
2.2.2. Tình hình bệnh vi khuẩn trên cá Giò tại Việt Nam
Ở nước ta mùa vụ dịch bệnh của cá Giò khá rõ ràng, xuất hiện vào các tháng 11 và
12 trong năm. Tỷ lệ chết cao 50% - 60%, nhất là vào thời điểm cuối năm gắn với
thời tiết lạnh và thường chết vào gần sáng. Cá chết ở kích cỡ nhỏ hơn 0.6kg chiếm
tới 65% (30.90% với cá kích cỡ nhỏ hơn 0.4kg và 35,95% với cá kích cỡ từ 0.4 đến
0.6kg). Tỷ lệ chết giảm dần theo kích cỡ cá từ nhỏ đến lớn, điều này có thể cho thấy
cá nhỏ nhạy cảm với tác nhân gây bệnh hơn.
Đối với bệnh vi khuẩn đã phân lập được một số loài vi khuẩn sau: Vibrio
alginiticus, V.vulnificus, V.cholene, V.parahaemolyticus, V.anguillarum và 1 loài
Pseudomonas sp. Hai nhóm vi khuẩn Vibrio spp và Pseudomonas sp luôn tồn tại
trong nước biển, khi điều kiện môi trường thay đổi xấu làm cá yếu, vi khuẩn sẽ xâm
nhập và gây thành bệnh (Phan Thị Vân và ctv, 2006).
Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2008), bệnh Vibriosis đã được phát hiện trên cá Giò
nuôi tại trang trại ở Khánh Hòa. Cá bệnh xuất hiện các vết thương tổn trên bề mặt
cở thể, tróc vẩy và xuất huyết dưới da, nặng hơn có các vết loét sâu trên bề mặt cơ

thể. Cá bệnh bơi lờ đờ trên mặt nước, kém ăn hoặc bỏ ăn, chết lác đác và mọi kích
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 6 Đại học Nha Trang

thước cá đều có thể nhiễm bệnh. Bệnh Vibriosis có tỷ lệ gặp cao ở cá nuôi lồng
(100%), cá nuôi ao gặp thấp hơn (58,3%). Một số loài vi khuẩn Vibrio spp đã phân
lập được từ nội tạng cá bệnh, trong đó Vibrio anguillarum đã gây bệnh trong điều
kiện nhân tạo (60-80%) với liều tiêm 0,3ml huyền dịch có mật độ vi khuẩn 4.10
6
-
4.10
7
tb/ml sau 3 ngày tiêm.
2.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản
2.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS trên thế giới
Vắc xin là một chế phẩm có tính kháng nguyên từ toàn bộ hoặc một phần chiết từ
sinh vật nhiễm bệnh, được sử dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch đặc trưng
của vật chủ mẫn cảm. Vắc xin phòng bệnh trong NTTS được bắt đầu nghiên cứu và
phát triển từ năm 1973, đến cuối những năm 1987 thì được đưa vào sử dụng
(Newman và ctv, 1993). Tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vắc xin phòng bệnh vi
khuẩn và 2 loại vắc xin phòng bệnh virus được đăng ký bản quyền và sử dụng cho 6
đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá Hồi, cá Chẽm
Châu Âu, cá Chẽm Châu Á, cá Rô phi, cá Turbot, và cá Bơn đuôi vàng. Tại Na Uy,
việc sử dụng vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn gây ra tỏ ra rất có hiệu quả. Những
nghiên cứu trước đây cho thấy phòng bệnh cho cá bằng vắc xin ở quy mô thương
mại đã được thực hiện rất hiệu quả trong nghề nuôi cá hồi nhằm phòng ngừa các
bệnh do vi khuẩn: Bệnh do Vibrio (vibriosis), bệnh do Vibrio mùa lạnh (cold water
vibriosis), bệnh xuất huyết đường tiêu hóa (enteric redmouth-ERM), bệnh lở loét

(furunculosis) (Ellis 1997; Gudding và ctv, 1997).
Hiện nay, có nhiều phương pháp sử dụng vắc xin trong NTTS khác nhau như:
tiêm, cho ăn, ngâm, tắm, phun… Tuy nhiên, phương pháp tiêm được áp dụng khá
phổ biến nhất là trong nghề nuôi cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar). Tiêm vắc xin
có thể tiêm xoang bụng hoặc tiêm cơ. Nhiều tác giả thông báo rằng việc tiêm kháng
nguyên vào cơ tạo nên lượng kháng thể lớn hơn so với tiêm vào xoang bụng. Cá
giống được tiêm vắc xin vào xoang bụng nhiều tháng trước khi đưa cá ra nuôi lồng
ở biển. Đây là phương pháp có hiệu quả nhất để kích thích sản xuất kháng thể toàn
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 7 Đại học Nha Trang

thân cũng như tạo được hiệu quả bảo vệ tốt nhất. Phương pháp này cũng cho phép
việc sử dụng chất bổ trợ nhằm gia tăng đáp ứng miễn dịch. VD: Tiêm SRBC (sheep
red blood cell) vào cơ cá chép tạo nên lượng kháng thể cao hơn so với tiêm vào tĩnh
mạch (Rijkers và ctv 1980). Ngoài ra còn phải kể đến các nhân tố khác tác động tới
hiệu quả sử dụng vắc xin ở cá như tuổi cá, mùa vụ, nhiệt độ
Chất bổ trợ là chất làm tăng đáp ứng miễn dịch, bao gồm nhiều chất khác nhau, cơ
chế tác dụng của chúng rất đa dạng và nhiều trường hợp vẫn chưa được làm rõ.
Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, đặc biệt với kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức,
có thể được tăng cường khi kết hợp kháng nguyên với chất bổ trợ như trường hợp
vắc xin phòng bệnh Aeromonas (Paterson và ctv, 1981), hoặc BKD (Klonz và ctv,
1983). Trong các trường hợp này có lẽ có vai trò tăng cường đáp ứng miễn dịch của
kháng nguyên hoặc có tác dụng kích hoạt đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu hoặc
cả hai vai trò này. Do hiệu quả bảo vệ khi sử dụng chất bổ trợ mang lại trong các
loại vắc xin hiện hành mà mọi thử nghiệm đánh giá hiệu quả vắc xin hiện hành đều
sử dụng kết hợp với chất bổ trợ. Tuy nhiên, một số chất bổ trợ mang lại hiệu quả
bảo vệ cao trong thử nghiệm vẫn chưa được sử dụng trong các sản phẩm thương
mại do các chất này gây nên phản ứng viêm cục bộ tại vị trí dẫn truyền kháng

nguyên và gây ra các tác dụng phụ khác. Nhìn chung kháng nguyên hòa tan cần
phải được sử dụng phối hợp với chất bổ trợ mới có thể tạo nên đáp ứng miễn dịch
dịch thể.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và phát triển vắc xin trên cá còn hạn chế. Đến nay,
ở nước ta chưa có bất kỳ một loại vắc xin nào đã phát triển và ứng dụng thành công
trong NTTS và thích ứng được với nhu cầu thị trường. Năm 2006, Bộ Thủy sản
cũng đầu tư một dự án sản xuất vắc xin cho các đối tượng cá Tra, cá Basa, cá Mú,
cá Giò, cá Hồng nuôi công nghiệp nhưng cũng chưa có kết quả. Những nghiên cứu
về miễn dịch học, trong đó có tìm hiểu cơ chế viêm trên đối tượng thủy sản ở nước
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 8 Đại học Nha Trang

ta còn ở giai đoạn sơ khởi và chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào nghiên cứu cơ chế
viêm ở cá sau khi tiêm vắc xin.
2.4. Cơ chế viêm trong đáp ứng miễn dịch ở cá
Viêm là hiện tượng xảy ra ở tổ chức tế bào, là phản ứng phòng vệ của sinh vật
trước sự tấn công hay kích thích từ bên ngoài lên cơ thể thông qua phản xạ của hệ
thống thần kinh. Đây là một quá trình bệnh lý cơ bản, bao gồm một số quá trình nhỏ
sau:
 Biến đổi về chất của tổ chức tế bào tại vùng viêm
Tại vùng viêm, dưới tác dụng của tác nhân gây bệnh gây ra một số tế bào sẽ bị
chết. Khi chứng viêm bắt đầu, biến đổi về chất của tế bào xảy ra ưu tiên ở chính
giữa ổ viêm, còn xung quanh biến đổi về chất không rõ ràng. Nguyên nhân làm thay
đổi về chất của tế bào do trao đổi chất bị rối loạn, thiếu chất dinh dưỡng cung cấp
đến và do những kích thích cơ và hóa học cục bộ của tác nhân gây bệnh. Mặt khác,
hệ thống tuần hoàn bị rối loạn, làm tế bào phát sinh những biến đổi gây hoại tử. Kết
quả của quá trình này tạo ra các chất phân giải như protein và các axit hữu cơ.

 Tăng cường sự thẩm thấu của các tế bào máu và dịch thể
Khi cơ thể sinh vật có chứng viêm, dịch thể và các tế bào máu thẩm thấu qua
thành mạch máu, đi vào tổ chức tế bào đang bị viêm. Tại ổ viêm, đầu tiên mạch
máu có sự thay đổi, do kích thích, động mạch nhỏ co lại, thời gian co rất ngắn sau
đó lại được nở ra các mao quản trong vùng viêm cũng nở ra, lúc này một lượng máu
lớn hơn bình thường được đưa đến mạch máu gần ổ viêm. Tính thẩm thấu qua vách
mạch máu cũng tăng lên, đặc biệt khi ổ viêm nặng. Nhiều thành phần máu được
thẩm thấu gồm: Globulin miễn dịch, hồng cầu thẩm thấu qua thành mạch máu một
cách bị động, các loại bạch cầu thẩm thấu một cách chủ động. Tại tổ chức tế bào bị
viêm, bạch cầu tiêu diệt tác nhân và các loại tế bào chết bằng cách bao vây và tiết
men để tiêu hóa, đây là hiện tượng thực bào. Các thể Globulin miễn dịch có nhiệm
vụ kết hợp với các kháng nguyên trung hòa độc tố. Như vậy, kết quả của quá trình
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 9 Đại học Nha Trang

thẩm thấu qua thành mạch máu là tiêu diệt tác nhân, trung hòa độc tố và làm sạch
vết thương.
 Tăng sinh tế bào
Cùng với hiện tượng tăng quá trình thẩm thấu của các thành phần máu qua vách
mạch máu, tới ổ viêm, các tế bào xung quanh ổ viêm có hiện tượng tăng sinh tế bào,
với mục đích phục hồi lại các tế bào đã chết của tổ chức, bao vây cô lập tác nhân.
Bất kỳ một chứng viêm nào của cơ thể sinh vật cũng xảy ra 3 quá trình nêu trên và
có quan hệ mật thiết với nhau. Đây cũng là một trong nhiều bản năng tự vệ của cơ
thể trước sự xâm nhập của tác nhân lạ.
Đến nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về cơ chế viêm của cá sau khi tiêm
vắc xin nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin trong phòng bệnh. Cơ chế hình thành
phản ứng viêm ở cá, nhìn chung tương tự như ở động vật có vú. Ngoại trừ điểm
khác biệt là cá không có histamine, chức năng xúc tác của histamine được thay thế

bởi 5-hydroxytryptamin (serotonin) (Nilsson & Holmgren 1992). Đáp ứng tế bào
trong phản ứng viêm trải qua 2 giai đoạn, thoạt đầu là sự gia tăng số lượng bạch cầu
trung tính từ máu chuyển đến, tiếp sau là sự xuất hiện của bạch cầu đơn nhân và đại
thực bào tại ổ viêm. Bạch cầu trung tính tập trung khoảng 1 giờ sau khi tiêm tác
nhân gây viêm và số lượng sẽ đạt cực đại sau 48 giờ (Afonso ctv,1998). Phản ứng
viêm được kích ứng và kiểm soát bởi một số yếu tố, bao gồm các amin gây giãn
mạch, các bổ thể, eicosanoid và cytokine được giải phóng trong đáp ứng đối với tổn
thương mô hoặc sản phẩm của các tác nhân gây bệnh. Các amin gây giãn mạch (5-
hydroxytryptamin) là các nhân tố tiền phát, phản ứng nhanh. Sau đó các yếu tố mới
được tổng hợp như eicosanoid và cytokine sẽ thu hút và hoạt hóa các bạch cầu. Sau
khi tới ổ viêm, bạch cầu sẽ giải phóng các yếu tố nhằm điều hòa phản ứng viêm
(Secombes 1996).


Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 10 Đại học Nha Trang

Phần III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Thời gian thực hiện từ 20/02/2010 tới 18/06/2010
 Địa điểm:
+ Tiến hành bố trí thí nghiệm và thu mẫu tại Cam Ranh - Khánh Hòa.
+ Tiến hành phân tích và xử lý mẫu tại: Phòng bệnh cá, Trung tâm Nghiên cứu
Quan trắc và Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực
miền Bắc - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc
Ninh).
3.2. Đối tượng nghiên cứu

Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Họ: Rachycentridae
Giống: Rachycentron (Kaup, 1826)
Loài: Rachycentroncanadum (Linnaeus, 1766).

Hình 1: Cá Giò (Rachycentroncanadum).
(Nguồn: Trung tâm khuyến ngư Quốc gia)
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 11 Đại học Nha Trang

Tên tiếng Việt: Cá Giò, cá Bớp, cá Bóp.
Tên tiếng Anh: Cobia, Black Kingfish, lemonfish.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài

Hình 2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài.



Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 12 Đại học Nha Trang

3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Vắc xin bất hoạt vi khuẩn Vibrio: PAH 3: 3: 3 (Do Viện Nghiên cứu NTTS 1 sản

xuất)

Hình 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm.


Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 13 Đại học Nha Trang


Hình 4: Vắc xin bất hoạt vi khuẩn Vibrio và nhũ dầu.


Hình 5: Các bể bố trí thí nghiệm

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 14 Đại học Nha Trang

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu mô học
Áp dụng phương pháp mô bệnh học ( Histopathological method ) truyền thống,
phương pháp này đã được ứng dụng cho nghiên cứu ở động vật thủy sản và được
giới thiệu bởi D.V Lightner (1996).
Sơ đồ khối các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học

Hình 6: Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học.
 Cố định và bảo quản mẫu: Dùng dụng cụ giải phẫu cắt lấy một miếng nhỏ
(khoảng 0,5cm

3
) mô từ cơ để cố định trong dung dịch fomalin 10%: 100ml;
Distilled water 900ml; Acidsodiumphosphate monohydrate (NaH
2
PO
4
.H
2
O) 0,4 g;
Anhydrous disodiumphosphate (Na
2
HPO
4
) 6,5g, tỷ lệ về thể tích giữa mẫu và dung
dịch cố định là 1/10. Mẫu này được giữ trong dung dịch cố định từ 24-48 giờ tùy
thuộc vào khối mẫu lớn hay nhỏ mà thời gian cố định khác nhau. Sau thời gian cố
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 15 Đại học Nha Trang

định, mẫu được bảo quản trong cồn Etanol 70%. Thời gian để bảo quản trong cồn
Etanol không giới hạn. Tuy vậy, mẫu càng nhanh xử lý các bước tiếp theo càng tốt.
Khi cố định và bảo quản cần ghi nhãn để tránh nhầm lẫn.
 Xử lý mẫu: Mẫu được lấy ra khỏi cồn 70% và được làm mất nước bằng cách
ngâm trong dung dịch cồn etanol với liều lượng tăng dần (70%, 95% và 100%)
trong 4 giờ cho mỗi nồng độ cồn. Sau đó tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch Methyl
salicylate từ 12-24h để làm mềm mẫu, rồi thấm parafin vào mẫu bằng cách ngâm
các mẫu này trong parafin nóng chảy (60
0

C) với thời gian ít nhất là 6h.
 Đúc mẫu trong Parafin: Lấy mẫu đã ngâm trong parafin, phân bố vào các
khuôn, ghi nhãn để không bị nhầm lẫn, sau đó đổ parafin nóng chảy vào khuôn,
dùng panh để sắp xếp mẫu vào chính giữa khuôn, chuyển vào dàn lạnh để khối mẫu
nhanh chóng đông cứng thành khối parafin chứa mẫu ở trong.
 Cắt và sấy mẫu: Mẫu sau khi đúc parafin xong, được gọt thành khối hình
thang cân hoặc hình chữ nhật. Sau đó, gắn lên máy Microtom và tiến hành cắt mẫu
với độ dày lát cắt 4-5µ. Lát cắt được đưa vào nước ấm 40-50
0
C trong khoảng 1-2
phút có thể lâu hơn để mẫu giãn hết cỡ không bị nhăn, trong nước ấm có bổ sung
lòng trắng trứng gà. Tiếp theo, dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và đặt lên
máy sấy ở nhiệt độ 45-60
0
C trong 1-4 giờ.
 Phương pháp nhuộm Hematoxyline và Eosin (H&E): Nhằm để phát hiện
những biến đổi trong tổ chức mô và tế bào khi nhiễm bệnh. Quy trình thực hiện
nhuộm H&E như sau:
 Làm mất parafin:
 Xilen I : 5 phút
 Xilen II: 5 phút
 Làm no nước mẫu:
 Etanol 100% 2-3 phút
 Etanol 100% 2-3 phút
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 16 Đại học Nha Trang

 Etanol 95% 2-3 phút

 Etanol 95% 2-3 phút
 Etanol 75% 2-3 phút
 Etanol 50% 2-3 phút
 Rửa nước: nhúng trong nước từ 1-3 phút
 Nhuộm Hematoxyline – Mayer từ 4-6 phút
 Rửa qua nước chảy nhẹ từ 4-6 phút
 Nhuộm Eosin 2 phút
 Làm mất nước mẫu:
 Etanol 50% 2-3 phút
 Etanol 75% 2-3 phút
 Etanol 95% 2-3 phút
 Etanol 95% 2-3 phút
 Etanol 100% 2-3 phút
 Etanol 100% 2-3 phút
 Làm trong mẫu:
 Xilen I : 3-5 phút
 Xilen II: 3-5 phút
 Đậy lamel bằng Bomcanada
Đọc các tiêu bản nhuộm H &E dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại:
×40, ×100, ×400 và ×1000 để phát hiện các biến đổi trong tế bào và trong mô cá ở
1, 3, 7, 14, 21 sau khi tiêm nhũ dầu. vắc xin không kết hợp với nhũ dầu và vắc xin
có nhũ dầu.

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 17 Đại học Nha Trang

Phần IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN


4.1 Kết quả nghiên cứu
4.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá Giò khỏe
Tiến hành tiêm cá Giò vào vị trí cơ lưng, cấu tạo chủ yếu là mô cơ vân.

Hình 7: Mô cơ cá Giò bình thường.
(sợi vân ngang (vùng B) và vân dọc (vùng C), H&E; A(×40), B(×100), C(×400), D(×1000)).
Hình 7 là tiêu bản mô cơ cá Giò khỏe ở các độ phóng đại khác nhau ×40, ×100,
×400, ×1000. Mô cơ vân bao gồm rất nhiều các sợi cơ liên kết với nhau, xếp song
Da

B

C

Nhân

Sợi
cơ
Tơ cơ
A

B

C

D

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản

Khóa luận tốt nghiệp - 2011 18 Đại học Nha Trang

song thành từng bó đều đặn, cấu trúc liên kết chặt chẽ, rất ít bắt gặp các tế bào máu
trong cơ và bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin. Quan sát được cơ vân cắt ngang
và cơ vân cắt dọc vì chúng sắp xếp theo nhiều hướng khác nhau (Hình 7A).
Mỗi sợi cơ vân là một tế bào có dạng hình thoi do các tơ cơ, tương cơ và màng
sợi cơ tạo thành. Trên tiêu bản sợi cơ cân cắt ngang (Hình 7B) và sợi cơ vân cắt dọc
ở độ phóng đại lớn: sợi cơ được bao bọc bởi một màng liên kết gọi là màng ngoài
sợi cơ, sát mặt trong màng có một hay nhiều nhân hình trứng, bầu dục (Hình 7C).
Bên trong sợi cơ dọc theo chiều dài là các tơ cơ giống như sợi chỉ xếp song song
với nhau và ít bắt gặp các tế bào máu (Hình 7D).
4.1.2 Biến đổi mô học cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu
 1 ngày sau khi tiêm: Mô cơ xuất hiện những không bào (O). Tuy nhiên, cấu
trúc cơ không bị biến đổi so với mô bình thường.
 3 ngày sau khi tiêm
- Quan sát trên tiêu bản mô học
cơ cá Giò 3 ngày sau khi tiêm nhũ
dầu ở vật kính nhỏ ×40 (Hình 8)
nhận thấy xuất hiện vùng viêm
rộng ( ) nằm ngay dưới da, làm
cấu trúc cơ bị biến đổi khá nhiều
so với vùng mô bình thường bên
cạnh.

Hình 8: Mô cơ cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu
3 ngày, H&E; ×40.
Trong cơ xuất hiện khá nhiều không bào (O) có kích thước lớn nhỏ khác nhau với
hình dạng chủ yếu là hình tròn và elip. Những không bào này được xác định là
Mô
bình

thường
Da

O
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


Khóa luận tốt nghiệp - 2011 19 Đại học Nha Trang

những giọt dầu sau khi tiêm vào cơ lưng cá Giò được phân tán rải rác xen kẽ giữa
những sợi cơ (Hình 8).

Hình 9: Ổ viêm hình thành trong mô cơ 3 ngày sau khi tiêm nhũ dầu.
(H&E; ×100, Giọt dầu(O), vùng cơ bị hoại tử (khoanh tròn),vùng cơ chưa bị hoại tử ( ))
Vùng cơ rộng lớn đang bị hoại tử nghiêm trọng nằm ngay dưới lớp da cá Giò, bắt
màu thuốc nhuộm không đồng đều (Hình 9). Trung tâm ổ viêm có nhiều giọt dầu và
mô cơ đang dần bắt màu của thuốc nhuộm Hematocylin. Bên cạnh đó là những
vùng cơ bình thường chưa bị biến đổi (hình mũi tên), bắt màu hồng của thuốc
nhuộm Eosin. Vùng cơ bị hoại tử (khoanh tròn) có các sợi cơ bị phá hủy, rách nát,
nhất là quanh những giọt dầu (O) hầu như không còn nhìn thấy cấu trúc của cơ.
Liên kết trong mô lỏng lẻo, thưa dần tạo ra những khoảng rỗng lớn bắt màu thuốc
nhuộm không được rõ ràng khi quan sát ở độ phóng đại nhỏ. Điều này cho thấy hiện
tượng hoại tử diễn ra mạnh nhất tại trung tâm ổ viêm, mức độ giảm dần ra vùng
ngoại vi của ổ viêm.
O
O
O
O
Da
Cơ bị hoại tử