So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất montanide ISA 50 v2 và montanide GEL PET a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


TRẦN THÚY HỒNG




SO SÁNH HIỆU QUẢ
ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG
LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA
KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ
CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ
MONTANIDE GEL PET A
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI
TS. LÊ VĂN BÉ



Nha Trang 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN THÚY HỒNG



SO SÁNH HIỆU QUẢ
ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG
LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA
KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ
CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ
MONTANIDE GEL PET A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Mã số sinh viên : 4913044026
Lớp : 49SH
Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội
TS. Lê Văn Bé
Nha Trang – 2011


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học
và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha

Trang, TS. Lê Văn Bé - Giám đốc Viện Vaccine Nha Trang đã tận tình hướng
dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ
Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để
công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
- Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Vaccine Nha Trang đã giúp
đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực
hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.







BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Số: QĐ/ĐHNT Nha Trang, ngày 12 tháng 03 năm 2011

HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
- Căn cứ Quy chế về tổ chức đào tạo, kiểm tra, thi và công nhận tốt nghiệp Đại học
và Cao đẳng hệ Chính quy ban hành theo Quyết định số 04/1999/QĐ-BGD&ĐT

ngày 11/02/1999 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục & Đào tạo;
- Căn cứ Quy định của Trường Đại học Nha Trang về công tác tốt nghiệp.
QUYẾT ĐỊNH

Điều 1: Nay giao cho sinh viên: Trần Thúy Hồng MSSV: 4913044026
Khoá: 49 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Đồ án tốt nghiệp: So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của
ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL
PET A
Nội dung thực hiện:
1) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ngựa đối với hai loại tá chất pha
kháng nguyên là Montanide ISA 50V2 và Montanide Gel Pet A.
2) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố uốn
ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao.
Nơi thực hiện: Viện Vaccine Nha Trang
Thời gian thực hiện: Từ ngày 02 /03 /2011 đến ngày 16 / 06/ 2011.
Hoàn thành và nộp Báo cáo trước ngày: 10 / 07/ 2011 cho Cán bộ hướng dẫn.
Điều 2: Ông: TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Lê Văn Bé
Có trách nhiệm hướng dẫn sinh viên thực hiện Đồ án Tốt nghiệp theo Quy chế
của Bộ và theo Quy định số 120 TB/ĐT ngày 15/3/2001 của Hiệu trưởng về việc
thực hiện công tác tốt nghiệp.
Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học có trách nhiệm theo dõi, kiểm tra việc thực
hiện công tác tốt nghiệp của SV do Khoa giao cho Bộ môn quản lý và định kỳ báo
cáo về Trưởng Khoa.
Điều 3: Sinh viên Trần Thúy Hồng phải nghiêm chỉnh chấp hành Nội quy, Quy
định của Trường và nơi thực tập, khắc phục khó khăn để hoàn thành Đồ án tốt
nghiệp được giao.
TL.HIỆU TRƯỞNG
Phó Giám đốc Viện

i
Mục lục


Trang
PHẦN I. MỞ ĐẦU 6
PHẦN II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 8
2.1. Bệnh uốn ván 8
2.1.1. Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván 8
2.1.2. Vi khuẩn uốn ván 8
2.1.3 Đặc điểm bệnh học: 11
2.1.4 Đặc điểm dịch tễ học 14
2.2.1. Miễn dịch tự nhiên 15
2.2.2. Miễn dịch chủ động 15
2.2.3. Miễn dịch thụ động 17
2.3. Huyết thanh 17
2.3.2. Thành phần hoá học của huyết thanh 18
2.3.3. Kháng thể 21
2.3.4. Huyết thanh phòng và chữa bệnh 23
2.4. Tá chất gây miễn dịch 24
2.4.1. Khái niệm tá chất 24
2.4.2. Cơ chế hoạt động của tá chất 25
2.4.3. Vai trò của tá chất 25
2.4.4. Tính an toàn của tá chất 26
2.4.5. Các loại tá chất thông dụng 26
2.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2 29
2.5.2. Những tính chất của MONTANIDE

TM
ISA 50V2 30


ii
2.5.3. Tính chất tạo nhũ dịch 31
2.5.4. Các thử nghiệm về độc tính 31
2.5.5. Số liệu về công hiệu 32
2.5.6. Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA 33
2.6. Tá chất Montanide Gel Pet A 35
2.6.2. Đáp ứng miễn dịch 36
2.6.3. Montanide Gel Pet A tá chất trùng hợp mới để sản xuất vacxin
ngựa 37
2.6.4. Tính ưu việt của Montanide Gel Pet A 37
2.7. Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật 37
2.7.1. Sản xuất kháng nguyên để gây miễn dịch 38
2.7.2. Miễn dịch súc vật sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván 40
2.7.2.1. Cơ chế miễn dịch của cơ thể súc vật 40
2.7.2.2. Súc vật để gây miễn dịch 42
2.7.2.3. Tiêu chuẩn ngựa sản xuất huyết thanh 43
2.7.2.4. Chăm sóc ngựa 44
2.7.2.5. Miễn dịch 44
PHẦN III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49
3.1. Vật liệu 49
3.1.2. Nguyên vật liệu 50
3.2. Phương pháp nghiên cứu 51
3.2.1. Bố trí thí nghiệm 51
Bảng 3.1. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52
Bảng 3.2. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54
3.2.3. Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp lên bông 56

3.2.3.1. Nguyên tắc 56


iii
3.2.3.2. Tiến hành 56
3.2.4. Xử lý số liệu kết quả 57
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58
4.1 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa A sử
dụng tá chất Montanide ISA 50V2. 58
4.2 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa B sử
dụng tá chất Montanide GEL PET A 59
4.3. So sánh đáp ứng miễn dịch kỳ cao độ hai nhóm A và B 60
4.4. So sánh đáp ứng miễn dịch ở chu kỳ 2 của hai nhóm ngựa 63
4.5. So sánh đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 của hai nhóm ngựa 66
4.6. So sánh hiệu giá hai nhóm ngựa A và B qua các chu kỳ khai thác 68
4.7. Sức khỏe ngựa sau 3 chu kỳ khai thác 72
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75
5.1. Kết luận 75
5.2. Đề nghị 75
Tài liệu tham khảo 77






iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 30
Bảng 2.2.Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 31

Bảng 2.3. Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 31
Bảng 2.4. Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA 50 V2 32
Bảng 2.5 Những tính chất của Montanide Gel Pet A 36
Bảng 3.1. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52
Bảng 3.2. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54
Bảng 4.1. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 61
Bảng 4.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 2 63
Bảng 4.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 67
Bảng 4.4. Hiệu giá trung bình của ba lần khai thác huyết thanh thô 69


v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1 Trực khuẩn uốn ván 9
Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo phân tử IgG và vị trí cắt của enzym Papain và
Pepsin 22
Hình 2.3. Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA
50V2 21
Hình 2.4 Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác
nhau theo thời gian 34
Hình 3. Sơ đồ tiêm miễn dịch và khai thác dùng cho hai lô ngựa A và B52
Hình 4.1 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu
ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide ISA 50V2 (lô A).58
Hình 4.2 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu
ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide Gel Pet A (lô B).60
Hình 4.3. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch cao độ của hai lô ngựa 62
Hình 4.4. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại ở chu kỳ 2 của lô
ngựa 65
Hình 4.5. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kỳ 3 ở hai lô
ngựa 68

Hình 4.6. Diễn biến đáp ứng miễn dịch của 2 lô ISA 50 V2 (lô A) và Gel
Pet A (lô B) ở 3 chu kỳ 72
Hình 4.7.1 Ngựa lô thí nghiệm A 73
Hình 4.7.2 Ngựa lô thí nghiệm
B 60



6

MỞ ĐẦU
Ngày nay uốn ván vẫn còn là bệnh gây tử vong không ít đối với các nước
kém phát triển và các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Trên thế giới,
tỷ lệ mắc bệnh uốn ván dẫn đến tử vong còn cao. Nhờ những công trình nghiên
cứu phòng và điều trị uốn ván, nhất là chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ
em và phụ nữ mang thai được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phát động đã làm
giảm tỷ lệ tử vong bệnh uốn ván xuống 30 - 48%. Tuy nhiên các đối tượng khác
như người già và người trung niên chưa được tiêm phòng uốn ván, hay có tiêm
phòng nhưng chưa tiêm nhắc lại rất lớn, đã làm cho hiệu quả của việc miễn dịch
chủ động bằng cách tiêm phòng vacxin uốn ván còn hạn chế. Vì vậy tiêm huyết
thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn là cách điều trị dự phòng hữu hiệu.
Tiêm kháng huyết thanh là biện pháp miễn dịch thụ động được dùng để
trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván nhằm điều trị bệnh này. Ngày nay nhu
cầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do sự chủ quan trong phòng bệnh và tình
trạng tai nạn giao thông tăng lên rất nhiều nên số lượng người có nguy cơ mắc
uốn ván cũng tăng theo. Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch để sản
xuất huyết thanh có hiệu giá cao là vấn đề rất cần thiết. Bên cạnh đó vấn đề an
toàn cho sức khoẻ của ngựa sản xuất huyết thanh cũng được quan tâm.
Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang đã và đang áp dụng quy trình
miễn dịch ngựa, cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván, tiến

tới nâng cao sản lượng và chất lượng kháng huyết thanh miễn dịch, đồng thời
giảm giá thành sản phẩm. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “So sánh hiệu quả
đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với
tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A’’.


7

Nội dung của đồ án
3) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ngựa đối với hai loại tá chất pha
kháng nguyên là Montanide ISA 50V2 và Montanide Gel Pet A.
4) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố
uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn có
các
hạn
chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn
bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm
hoàn
thiện. Em xin chân thành cảm
ơn!



8

PHẦN I. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. BỆNH UỐN VÁN
2.1.1. Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván
Bệnh uốn ván được mô tả từ rất cổ xưa vào thời Hyppocrates. Đến năm

1854, Simpson khám phá rằng triệu chứng bệnh uốn ván rất giống những trường
hợp ngộ độc Strychnine.
Năm 1884, Carle và Rattonet gây được bệnh uốn ván thực nghiệm bằng
cách tiêm dịch nghiền ở vết thương tấy mủ của người mắc bệnh uốn ván cho súc
vật thí nghiệm. Họ đã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn và mô tả được bệnh
uốn ván điển hình ở thỏ.
Năm 1885, Nicolaier đã tìm thấy một loại trực khuẩn dài ở tại vết thương
tấy mủ nhưng ông không nuôi cấy được thành chủng thuần khiết. Ông cho rằng
triệu chứng sinh bệnh học bệnh uốn ván là do một chất độc giống như Strychnine
của trực khuẩn này tiết ra.
Năm 1886, Rosebach tìm thấy nha bào của vi khuẩn uốn ván.
Năm 1889, Kitasato đã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương
tấy mủ, ông đã thuần khiết được trực khuẩn trong môi trường nuôi cấy và nhận
thấy canh khuẩn thuần khiết này chứa một loại độc tố hòa tan, độc tố này gây
nên triệu chứng bệnh uốn ván.
1.1.2. Vi khuẩn uốn ván
Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn loại
Gram dương, có kích thước rộng 0,3 - 0,5

m, dài 2,0 - 2,5

m di động, mọc
tốt trong môi trường yếm khí, có khả năng hình thành nha bào. Nha bào hình
trứng hoặc hình cầu phân bố lệch tâm hoặc ở cực tế bào, thông thường vùng có


9

nha bào trương ra có dạng bào tử nang tế bào trở nên có hình thoi, hình vợt, hình
dùi trống.

Hình 1.1. Trực khuẩn uốn ván
Nha bào uốn ván hiện diện trong đất có nhiều phân, đôi khi có trong bụi và
có sức chịu đựng rất tốt, tồn tại nhiều năm trong đất bùn, môi trường không có
ánh sáng và không khí, chịu đựng được nhiệt độ sôi từ 1 - 3 giờ, có thể tồn tại 10
giờ trong dung dịch phenol 5% và 24 giờ trong phenol 3%. Nhiệt độ 100
0
C và
các chất diệt khuẩn không diệt được nha bào, phải đun sôi kéo dài hay hấp ướt
121
0
C trong 30 phút thì mới có thể diệt được nha bào uốn ván. Trực khuẩn uốn
ván lên men đường glucose, sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong môi trường
có huyết thanh và không có glucose.
* Khả năng gây bệnh:
Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực
khuẩn Clostridium tetani. Trực khuẩn này thường tồn tại trong đất , cát, bụi bẩn
thậm chí ngay cả trong ruột già của người và động vật. Phạm vi phân bố rộng
mặt khác lại là vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất
lâu dài và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên
tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván khá cao.


10

Trực khuẩn uốn ván có khả năng gây bệnh cho người và một số động vật
nhỏ như : chuột lang, chuột nhắt, thỏ , ngoài ra bò, cừu, chó, mèo cũng có thể
bị bệnh uốn ván. Ở người trực khuẩn uốn ván vào cơ thể qua vết thương nhỏ hay
lớn, ở trẻ sơ sinh do vết cắt rốn ( dụng cụ cắt rốn có mang nha bào uốn ván tiệt
trùng không kỹ ).

Trực khuẩn uốn ván đã được tìm ra từ hơn một thế kỷ nay nhưng bệnh uốn
ván vẫn còn là vấn đề cần được quan tâm vì tỷ lệ tử vong cao, nhất là trẻ sơ sinh.
Theo thông báo dịch quí II năm 1993, trẻ sơ sinh bị bệnh uốn ván là 36,4% còn
các lứa tuổi khác 15,1%. Nhờ chương trình tiêm chủng mở rộng và chương trình
loại trừ UVSS được triển khai từ năm 1992 nên hiện nay tỷ lệ mắc uốn ván đã
giảm rõ rệt.
Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh và độc tố này xâm
nhập vào các phần khác trên cơ thể. Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực
khuẩn bị phá hủy bởi acide dạ dày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa.
* Tính chất sinh hóa của độc tố uốn ván:
Tác nhân dẫn đến tử vong chính là độc tố uốn ván. Độc tố uốn ván có tính
độc rất mạnh, liều gây chết ở người 2,5ng/kg cân nặng.
Độc tố uốn ván là một protein chiếm tới 5 - 10% trọng lượng tế bào, nó
không có ích cho vi khuẩn, không phá hủy bất cứ cấu trúc tổ chức nào để giúp
vi khuẩn xâm nhập vào mô của động vật.
Độc tố uốn ván về mặt hoá học gồm ba thành phần: một phần có tác dụng
gây tan máu, có tính độc với tim, dễ bị ôxy hoá gọi là tetanolysin; một phần gọi
là tetanospasmin gây co giật các cơ, là triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván;


11

phần còn lại là neurotoxin không gây co thắt, không có vai trò trong cơ chế gây
bệnh uốn ván.
Tetanospasmin là chất do plasmid chi phối, trong cơ thể nó kết hợp với các
gang lion (hạch) thần kinh tiền tủy sống, gây tăng cường tiết acetylcholin ở bên
trong bộ phận tế bào gây co thắt (dạng tăng cường). Độc tố này có tính độc cao 1
mg chất này gây chết 10 triệu chuột nhắt.
Độc tố này tan trong nước, bắt đầu kết tủa trong dung dịch và mất hoạt tính
khi pH 6 nhưng nó bền ở pH 5 khi có mặt glycerin, cơ chế việc sản sinh độc tố

của trực khuẩn uốn ván đến nay còn nhiều điều chưa rõ. Độc tố có độc lực rất
mạnh, có ái tính cao với tế bào thần kinh bị phá huỷ ở nhiệt độ lên 70
0
C. Bản
chất của độc tố uốn ván là một protein chứa 15,7% nitơ; 0,062% phospho; 1,04%
sulfur, không có cacbonhydrat và lipid, điểm đẳng điện là 5 - 5,2 PI.
Độc tố uốn ván được tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván, là chuỗi
polypeptide đơn có trọng lượng phân tử 150.000 dalton. Trong các điều kiện
nuôi cấy thí nghiệm, độc tố tách từ nước nổi của canh khuẩn gồm hai chuỗi
polypeptide : một chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử 53.000 dalton và một chuỗi
nặng có trọng lượng phân tử 107.000 dalton nối với nhau bởi cầu nối disulfur ( -
S-S- ). Người ta thấy rằng độc tố uốn ván và độc tố ngộ độc thịt (butulinum)
thường có khả năng gây bệnh nhiều nhất trong các loại độc tố do vi khuẩn tiết ra.
1.1.3. Đặc điểm bệnh học
Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc do vi khuẩn Clostridium
tetani gây nên, trực khuẩn phát triển tại vết thương và tiết ra độc tố làm tổn
thương các nơron thần kinh trung ương gây nên co cứng cơ vân. Triệu chứng


12

điển hình của bệnh uốn ván là những cơn co cơ và kèm theo đau, khởi đầu ở cơ
vân, đến cơ cổ tiếp theo là khối cơ lưng.
Phần lớn các trường hợp chỉ vì giẫm phải một cái đinh rỉ, mắc chân vào một
sợi dây kẽm gai, bị một cái dằm đâm vào dưới móng tay, bị xước tay, vết đốt của
côn trùng, vết răng của chó, mèo đều có thể là nơi xâm nhập của vi khuẩn uốn
ván.
Bệnh cảnh lâm sàng của uốn ván thường xếp làm 4 loại chính :
- Uốn ván toàn thân.
- Uốn ván cục bộ.

- Uốn ván thể đầu.
- Uốn ván rốn.
* Uốn ván toàn thân:
Là thể bệnh uốn ván thường gặp nhất. Bệnh khởi phát với mệt mỏi, nhức
đầu, mỏi quai hàm và nhai khó, nói khó, nuốt vướng, uống nước sặc. Dần dần,
hàm cứng không há lớn được. Giai đoạn toàn phát uốn ván thể điển hình bao
gồm các dấu hiệu :
+ Co cứng cơ :
Tùy theo nhóm cơ co cứng chiếm ưu thế mà bệnh nhân có một trong các tư
thế đặc biệt như sau :
Cong ưỡn người ra sau.
Thẳng cứng cả người như tấm ván.
Cong người sang một bên.
Gập người ra phía trước.


13

+ Co giật và co thắt
Co cứng toàn thân tự nhiên hoặc do kích động bởi va chạm, ánh sáng chói,
tiếng ồn. Nguy hiểm nhất là cơn co thắt hầu họng gây khó nuốt, sặc đàm và co
thắt thanh quản đưa đến tím tái và ngưng thở.
+ Rối loạn cơ năng
Khó nuốt, khó nói, khó thở do co thắt hầu họng, tăng tiết đàm nhớt, tắc
nghẽn đường hô hấp.
+ Tổng trạng
Tỉnh táo.
Không sốt cao lúc mới phát bệnh và 48 giờ đầu.
Nếu hệ thần kinh thực vật bị tổn thương sẽ có các biểu hiện : mạch nhanh >
120-140 lần /phút, sốt cao, huyết áp dao động, vã mồ hôi nhiều, thở nhanh, tăng

tiết catecholamin trong nước tiểu.
Giai đoạn chót : huyết áp tụt.
* Uốn ván cục bộ
Co cứng cơ khu trú ở vị trí tương ứng với nơi xâm nhập của vi trùng uốn
ván. Bệnh thường nhẹ và kéo dài, diễn tiến tự khỏi.
Bệnh hay gặp ở người đã có miễn dịch một phần với tetanospasmin (ví dụ
đã được tiêm phòng SAT khi bị thương nhưng không xử trí vết thương đúng và
không tiêm ngừa VAT). Co cứng cơ có thể lan sang chi đối diện hoặc có thể diễn
tiến sang uốn ván toàn thân khi luợng độc tố đạt đến mức đủ đến hệ thần kinh
trung ương.
* Uốn ván thể đầu


14

Là dạng đặc biệt của uốn ván cục bô. Vết thương khu trú ở vùng đầu, mặt,
cổ, thời gian nung bệnh thường ngắn hơn.
Có hai loại biểu hiện :
+ Thể không liệt
Khởi đầu với triệu chứng co thắt hầu họng làm bệnh nhân khó nuốt, uống
nước bị sặc.
+ Thể liệt
Thường gặp hơn thể không liệt.
Liệt mặt ngoại biên : thường gặp nhất, liệt cùng bên với vết thương, liệt cả
hai bên nếu vết thương ở ngay giưõa sống mũi.
Liệt dây thần kinh III, IV, VI : hiếm gặp hơn.
* Uốn ván rốn
Thời gian nung bệnh : 3 - 5 ngày. Biểu hiện : trẻ bỏ bú, nhắm mắt, khóc
không ra tiếng rồi không khóc, bụng co cứng, bàn tay nắm chặt, chân co cứng.
Trẻ thường sốt cao, co giật nhiều, co thắt tím tái. Bệnh tiến triển tốt khi bé mở

mắt, ngủ được, khóc to dần, hết co giật. Tỷ lệ tử vong còn rất cao : từ 70 đến
80%, do suy hô hấp, bội nhiễm, suy dinh dưỡng.
1.1.4. Đặc điểm dịch tễ học
Vi khuẩn uốn ván có mặt ở mọi nơi và gây bệnh tản phát ở các nước trên
thế giới. Ở những vùng nông nghiệp và những nơi phải tiếp xúc với chất thải của
súc vật và không được tiêm phòng đầy đủ, bệnh uốn ván thường gặp nhiều hơn.
Ở hầu hết các nước công nghiệp, bệnh hiếm gặp mang tính tản phát.


15

Bệnh uốn ván là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tử vong ở
nhiều nước đang phát triển thuộc Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ, đặc biệt ở
những vùng nông thôn và vùng nhiệt đới.
Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh uốn ván. Nhóm người có nguy cơ
cao mắc bệnh: Nông dân, nhân viên chăn nuôi gia súc, nghiện chích ma túy.
Bệnh có thể gặp bất kỳ thời gian nào trong năm, không mang tính chất mùa
rõ rệt.
1.2. Miễn dịch chống lại bệnh uốn ván
1.2.1. Miễn dịch tự nhiên
Kể từ lúc tìm ra nguyên nhân gây bệnh uốn ván, một số tác giả quan tâm
nghiên cứu miễn dịch tự nhiên có hay không đối với bệnh uốn ván. Song đến đầu
năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới đã đúc kết và chính thức nhận định loại miễn
dịch này hầu như không có và nếu hạn hữu có thì cũng không đủ lượng kháng
thể phòng bệnh uốn ván. Do đó việc gây miễn dịch chủ động bằng phương pháp
tiêm vacxin uốn ván giữ một vai trò quan trọng trong việc phòng bệnh uốn ván.
1.2.2. Miễn dịch chủ động
Việc cơ thể sản sinh kháng thể đặc hiệu hoặc tế bào Tc sau khi bị cảm
nhiễm hoặc sau khi được tiếp nhận một cách nhân tạo vi sinh vật mầm bệnh
(sống hoặc vô hoạt) hoặc là kháng nguyên của chúng (kể cả các loại độc tố) và

giải độc tố (toxoid),… được gọi là miễn dịch chủ động. Miễn dịch chủ động có
được sau khi bị cảm nhiễm gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên, các trường hợp
tạo miễn dịch do con người đưa kháng nguyên hay mầm bệnh vào cơ thể (tiêm
vacxin) gọi là miễn dịch chủ động nhân tạo. Tế bào ký chủ có được miễn dịch
chủ động sau khi tiếp cận với kháng nguyên và mất khá nhiều thời gian (thường


16

khoảng 1 tuần) để tổng hợp kháng thể. Miễn dịch chủ động tăng từ từ cần mấy
ngày nhưng nhiều khi có thể kéo dài nhiều năm.
Đưa vacxin uốn ván vào cơ thể kích thích tạo kháng thể kháng bệnh là
phương pháp phòng bệnh uốn ván có hiệu lực nhất. Vacxin uốn ván kích thích
cơ thể con người tạo ra kháng thể trung hòa độc tố uốn ván, nhờ đó bảo vệ được
cơ thể, chống lại bệnh. Khả năng bảo vệ này tùy thuộc vào lượng độc tố uốn ván,
hàm lượng của kháng thể uốn ván.
Để gây miễn dịch chủ động có kết quả tốt, ngày nay người ta nghiên cứu
sản xuất những vacxin đơn giá như TT (vacxin phòng bệnh uốn ván) dùng cho
người lớn; vacxin phối hợp hai thành phần như DT (vacxin bạch hầu - uốn ván
hấp phụ) dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi; Td (vacxin bạch hầu - uốn ván giảm liều
hấp phụ) dùng cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên; vacxin phối hợp 3 thành phần giải
độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, xác vi khuẩn ho gà gọi là DTP dùng cho trẻ
em dưới 6 tuổi. Các giải độc tố thường được dùng kết hợp với tá chất để làm
tăng hiệu quả đáp ứng của cơ thể.
Có thể phòng bệnh uốn ván suốt đời bằng cách tiêm vacxin như sau:
- Tiêm vacxin DTP cho trẻ em dưới 6 tuổi.
- Tiêm vacxin Td cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên.
- Tiêm vacxin TT cho phụ nữ mang thai và lứa tuổi sinh đẻ (15 - 44 tuổi).
Tiêm đủ 5 liều trong vòng 31 tháng, tiêm càng sớm càng tốt khi có thai.
- Tiêm vacxin TT cho những người có nguy cơ mắc cao (người làm vườn,

người làm việc ở các nông trại, công nhân xây dựng công trình…). Tiêm miễn
dịch 3 liều trong vòng 6 tháng, cứ sau 5 - 10 năm tiêm nhắc lại một liều (Viện
vacxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang, 2004).


17

1.2.3. Miễn dịch thụ động
Năm 1890, Berhing và Kitazato đã đặt nền móng cho kiểu miễn dịch thụ
động. Về sau Roux đã đưa ra một quan điểm là có thể dùng huyết thanh miễn
dịch để điều trị cho tất cả bệnh nhiễm trùng. Kiểu miễn dịch thụ động được sử
dụng trong những trường hợp phải tạo miễn dịch nhanh chóng khi có nguy cơ
mắc bệnh cao hoặc nghi ngờ bị bệnh.
Nguyên tắc của miễn dịch thụ động là đưa vào cơ thể bệnh nhân một lượng
kháng thể đặc hiệu được sản xuất từ súc vật hay người đã được gây miễn dịch
với kháng nguyên đặc hiệu. Kháng thể này sẽ trung hoà các độc tố hay virus
trong máu của bệnh nhân. Một vấn đề quan trọng trong miễn dịch thụ động là
thời gian miễn dịch rất ngắn, kháng thể đặc hiệu sẽ bị thải ra ngoài. Vì vậy trong
việc điều trị dự phòng bệnh uốn ván hay bệnh dại bao giờ người ta cũng có sự
phối hợp giữa miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. Ngoài ra khi sử dụng
huyết thanh miễn dịch để phòng ngừa hay điều trị thường gây ra phản ứng dị
ứng, bệnh huyết thanh. Để loại bỏ những phản ứng trên, người ta phải tinh chế
huyết thanh miễn dịch để loại bỏ các phần tử không cần thiết đối với huyết thanh
khác loài hay điều chế huyết thanh miễn dịch cùng loài (huyết thanh từ người)
hoặc kháng thể đơn dòng.
1.3. HUYẾT THANH
Sử dụng huyết thanh là phương pháp tạo miễn dịch thụ động rất có hiệu
quả. Có thể điều chế kháng huyết thanh chống độc tố và vi khuẩn từ máu ngựa
được gây miễn dịch với kháng nguyên hoặc từ máu người đã tiêm vacxin và có
kháng thể cao. Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ-globulin lấy

từ máu nhau thai. γ-Globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các


18

phản ứng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị rất hữu
hiệu.
1.3.1. Tính chất lý hóa chung của huyết thanh
Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ. Máu toàn phần gồm hai phần:
- Tế bào máu bao gồm các tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu.
- Huyết tương gồm huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu hòa tan trong
đó (protein tạo sợi tơ huyết fibrinogen khi đông máu).
Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị
đông lại. Phần còn lại tách ra khỏi cục máu là chất dịch màu vàng rơm gọi là
huyết thanh. Máu có độ nhớt cao hơn nước:

nước
= 1, :

máu
= 5; :

huyết tương
=
1,7 - 2 ,2. Độ nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh
lý.
Độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ H
+
, OH
–

và có ý
nghĩa rất quan trọng. Khi pH của huyết thanh không phải là hằng số thì pH của
máu cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong cơ thể không xảy ra. Bởi vậy pH
của huyết thanh luôn ở khoảng giá trị 7,2 - 7,5.
1.3.2. Thành phần hoá học của huyết thanh
Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 - 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu
vàng nhạt. Trong huyết thanh nước chiếm 90 - 91%, chất khô chiếm 9 - 10%
gồm protein, đường, lipit, muối khoáng.
Trong huyết thanh thành phần khí có O
2
và CO
2
. Cứ 100 ml máu động
mạch chứa khoảng 18 - 20 ml O
2
và CO
2
ở dạng hoà tan kết hợp với hemoglobin
của hồng cầu. Khoảng 45 - 50 ml CO
2
có trong huyết tương và hồng cầu.
Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation như Na
+
, K
+
, Ca
2+
,
Mg
2+

, và các anion Cl
–
, HCO
3
–
, SO
4
2–
, PO
4
3–
… Ngoài ra huyết thanh còn chứa


19

các yếu tố như I, Cu, Fe, Zn…, chúng tồn tại ở dạng ion hoặc kết hợp với
protein. Các thành phần hữu cơ trong máu rất phức tạp, gồm:
* Protein
Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật. Có nhiều
loại protein huyết thanh, khoảng 100 - 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo và
nhiệm vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các men… Số lượng và tính chất
của các protein thay đổi tuỳ theo loài. Nghiên cứu bằng phương pháp lưỡng chiết
quang, nhiễu xạ tia X, kính hiển vi điện tử thì mọi protein (trừ fibrinogen) đều có
dạng hình cầu như albumin, globulin…
Bằng phương pháp điện di trên giấy người ta phân tích được protein huyết
thanh gồm 5 thành phần: phần chạy nhanh nhất là albumin,

1
-globulin,


2
-
globulin, chậm nhất là

-globulin.
Nếu điện di miễn dịch trên gel tinh bột hoặc gel polyacrilamit có thể tách
được 18 - 21 thành phần protein khác nhau. Protein huyết thanh có ở dạng tự do
hoặc phức hợp với lipit (lipoprotein), gluxit (glucoprotein), kim loại
(metaloprotein), axit nucleic (nucleoprotein).
- Albumin:
Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị
kết tủa bởi dung dịch muối bão hoà. Trong các protein của huyết thanh albumin
chiếm một lượng lớn tới 56,6%, vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy
trì áp suất thẩm thấu của huyết tương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể,
tham gia vận chuyển các chất không tan trong máu như billirubin tự do, axit béo,
một số thuốc…
- Globulin:
Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần.
Globulin hoà tan trong dung dịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết


20

hoặc trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt. Có nhiều
loại globulin:
+

1
-,


2
-globulin: chiếm khoảng 13% tổng số protein huyết thanh.

1
-
globulin tham gia cấu tạo glucoprotein, lipoprotein,

2
-globulin

có
ceruloplasmin (protein vận chuyển đồng).
+

-globulin: chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein chứa
sắt).
+

-globulin: chiếm khoảng 18,6% protein huyết thanh, bao gồm những
kháng thể.
Những protein miễn dịch là giá đỡ của kháng thể, giữ vai trò quan trọng
trong việc chống lại sự nhiễm trùng của cơ thể. Globulin tăng trong các trường
hợp nhiễm trùng, các quá trình viêm cấp.
* Các enzym: Có rất nhiều enzym trong huyết thanh như amylase,
phosphatase, transaminase…
* Những chất có nitơ phi protein:
Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số là những sản
phẩm thoái hoá cuối cùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, acid uric,
billirubin… Ngoài ra huyết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian

của protein như polypeptid và các acid amin tự do.
* Glucose:
Glucose máu dao động trong khoảng cố định. Chỉ số này tăng giảm trong
các trường hợp bệnh lý.
* Lipid:
Lipid trong huyết thanh bao gồm triglycerid, phospholipid, steroid,
cholesterol.


21

1.3.3. Kháng thể
Kháng thể hay là globulin miễn dịch là các protein có trong huyết thanh
hoặc dịch sinh học của cơ thể (nước tiểu, sữa…) có khả năng liên kết đặc hiệu
với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng.
Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần

-globulin của
huyết thanh, dịch bạch huyết và các dịch khác của cơ thể. Về cấu trúc và hoá tính
đó là những

-globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với
các

-globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học. Chỉ có thể phát hiện
kháng thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu là kháng nguyên tương ứng. Kháng thể
được phát hiện từ những năm đầu của lịch sử miễn dịch. Sự kết hợp đặc biệt giữa
kháng nguyên và kháng thể, với khả năng sản xuất được kháng thể đặc hiệu đã
làm cho kháng thể được dùng rộng rãi vào mục đích chẩn đoán và điều trị.
Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig). Có nhiều lớp

globulin miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc
giống nhau.
- Phân tử Ig có hai chuỗi polypeptit nặng (H) và hai chuỗi polypeptit nhẹ
(L).
- Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong
mỗi phân tử Ig.
- Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc type kappa (κ) hoặc lamda (λ)
còn chuỗi H của các lớp Ig thì khác nhau. Các lớp Ig ở người bao gồm IgG, IgA,
IgD, IgE và IgM.
IgG: Là lớp kháng thể có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, có thể đạt
12 mg/ml (chủ yếu trong máu). Phân tử lượng nhỏ cỡ 150.000 dalton. Chính vì
nhỏ nên nó có mặt trong huyết thanh và cả dịch kẽ tế bào. Khi IgG bị thuỷ phân
sẽ tạo thành 3 mảnh có khối lượng tương đối giống nhau khoảng 50.000 dalton.