Dinh dưỡng của vi sinh vật – Phần 4 doc

Dinh dưỡng của vi sinh vật – Phần 4

13.1.4. Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh
dưỡng
Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh
dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì
sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh
trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi
cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn
trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định
này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại
nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 10
43
tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của
mỗi tế bào là 10
-12
g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400
lần khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh
trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng.
Thuật ngữ “các chất dinh dưỡng hạn chế” được sử dụng với rất nhiều ý nghĩa,
và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng
đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng
biệt: hóa học và và động học. Sự hạn chế hóa học được định nghĩa là khối lượng
lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng.
“Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp
của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tìm ra rằng hàm
lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng,
miễn là tất cả các chất dinh dưỡng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình
1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong
phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng
sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (µ). Điều khiển động học về tốc

độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trình Monod
(phương trình 2) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất
dinh dưỡng đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (µ).
X = X
0
+ ( S
0
- S) x Y
X/S
(1)
µ = µ
max
x x s / (K
S
+ S) (2)
Trong đó S
0
là nồng độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh
dưỡng bị hạn chế S; X(X
0
) là nồng độ sinh khối (ban đầu); là sản lượng sinh khối
thu được đối với chất dinh dưỡng S, µ
max
là tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, và
K
S
là hằng số ái lực cơ chất Monod.
Điều này thể hiện rõ trong hình 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống
nuôi cấy kín. Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu
thụ các chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm

dần, sau đó tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn. Đó là lúc đạt đến nồng độ cuối cùng của
sinh khối. Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường một cách liên tục và
một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tốc độ bổ sung thêm vào của các
chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả µ và nồng độ sinh khối
trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998).

Hình 13.2: Động học của sự giới hạn sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy
đóng do giới hạn nồng độ của chất dinh dưỡng (cơ chất) S. S
0
là nồng độ cơ chất
ban đầu, s là nồng độ thực của cơ chất, X là nồng độ sinh khối; X
0
: nồng độ sinh
khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu được đối với cơ chất S.
Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã
được biết rõ, nhờ đó các chất dinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc
nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối,
môi trường được thiết kế phổ biến với nguồn carbon và năng lượng giới hạn, tất cả
các chất dinh dưỡng khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trình công
nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưỡng chứ không phải nguồn carbon
giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi
sinh vật. Sự hạn chế các chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng
cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzyme của vi sinh
vật. Ví dụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quá trình lên men tạo chất kháng sinh
do sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất acid citric trong
môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp của NAD là
được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự
trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn
cung cấp hợp chất giàu nitrogen.
Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên

không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất
dinh dưỡng đồng thời (Kovarova và Egli, 1998).
13.1.5. Thiết kế và phân tích môi trường sinh trưởng tối thiểu
Để sinh trưởng và tổng hợp các nguyên liệu tế bào cho bản thân mình, vi sinh
vật phải thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất của chúng) và năng
lượng cần thiết từ môi trường sống. Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí
nghiệm thì các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các
chất dinh dưỡng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sử dụng được.
Do có sự đa dạng sinh lý của thế giới vi sinh vật mà có vô số các môi trường
với thành phần dinh dưỡng khác nhau đã được đưa ra, với mục đích hoặc là làm
giàu một cách chọn lọc hoặc là để nuôi cấy một nhóm ví sinh vật đặc thù nào đó
(LaPage và cs, 1970; Balows và cs 1992; Atlas, 1997). Tất cả các môi trường này
đều chứa các thành phần với các chức năng dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt là cân
nhắc về chức năng cấu trúc hoặc sinh năng lượng. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên
cứu về chất dinh dưỡng được tiến hành định tính chứ không phải định lượng và
các chất dinh dưỡng khác nhau được thêm vào nhiều hơn hay ít hơn một cách tùy
ý. Ngoài ra, rất nhiều các môi trường nuôi cấy có chứa các thành phần không được
biết rõ ràng bởi vì sử dụng các nguyên liệu hữu cơ như ngô, khoai tây,…
Trong cùng những điều kiện như: nhiệt độ hoặc pH, tốc độ sinh trưởng riêng
lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự đa dạng của các chất dinh dưỡng
trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đối với sự sinh trưởng
của Salmonella typhimurium (thí nghiệm bởi Schaechter và cs, 1958). Họ đã sử
dụng 22 môi trường có thành phần khác nhau và nhận thấy các tốc độ sinh trưởng
khác nhau ở các môi trường trong các điều kiện dư thừa các chất dinh dưỡng. Kết
quả cho thấy chất lượng các tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều
chỉnh tốc độ sinh trưởng một cách rõ ràng nhất.
A. Thiết kế môi trường và kiểm tra các chất dinh dưỡng giới hạn
1. Thiết kế môi trường sinh trưởng
Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, quyết định đầu tiên được đưa ra là
chọn lựa nồng độ cao nhất cho phép tạo ra sinh khối (X

max
), và xác định các chất
dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig). Điển hình, môi trường sinh trưởng
cho các vi sinh vật dị dưỡng được thiết kế với nguồn năng lượng - carbon riêng
biệt sẽ giới hạn lượng sinh khối được tạo ra, nhưng ngược lại tất cả các chất dinh
dưỡng khác (được thêm vào dưới dạng các hợp chất đơn) được cung cấp dư thừa.
Dựa vào giá trị X
max
, có thể tính toán được nồng độ tối thiểu của các nguyên tố
khác nhau cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Để đảm bảo sự dư thừa của tất cả
chất dinh dưỡng không giới hạn trong môi trường thì nồng độ của chúng được
nhân với nhân tố dư (F
E
). Bằng cách này, nồng độ của chất dinh dưỡng đòi hỏi
trong môi trường tăng trưởng (E
req
) gấp x lần theo lý thuyết đối với nguồn carbon.
E
req =
X
max
/ Y
X/E
x F
E
(3)
Y
X/E

(the individual average elemental growth yield) là sản lượng tăng trưởng

trung bình dựa trên từng nguyên tố.
Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường khi giới hạn nguồn carbon, cho phép
tạo sản lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh (bảng 13.13). Cần chú ý rằng, trong môi
trường này các thành phần được lựa chọn sao cho có thể thay đổi nồng độ của mỗi
nguyên tố (ví dụ có thể thay thể MgCl
2
và NaHSO
4
bằng MgSO
4
). Hơn nữa, môi
trường này chỉ có tính chất đệm yếu (weakly buffered), do đó cần thiết phải khống
chế pH trong suốt quá trình sinh trưởng.
Cách thức này được sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy các vi sinh
vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp và trung bình. Phức tạp hơn là thiết kế của
môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, trong đó rất nhiều thành phần của môi
trường dễ dàng kết tủa tại thế oxy hóa khử cần thiết, hoặc mật độ tế bào cao trong
đó có chứa các chất hòa tan hoặc vấn đề độc tính của một số môi trường.


Bảng 13.13: Thiết kế môi trường tối thiểu bị giới hạn bời nguồn C cho phép sản
lưởng sinh khối khô đạt 10g/l
a,b

Thành ph
ần
môi trường
Nguồn Năng su
ất
sinh trưởng

(g sinh kh
ối
khô/g nguyên
tố)
Các nhân t
ố
d
ự thừa với
nguồn
carbon
tương ứng
Khối lư
ợng
các nguyên t
ố
(g/l)
Khối lượn
g các
thành ph
ần cấu
tạo (g/l)
Glucose
C, năng
lượng
1 1 10 25.0
NH
4
Cl N 8 3 3.75 14.33
NaH
2

PO
4
P 33 5 1.52 5.88
KCl K 100 5 0.5 0.95
NaH
2
SO4 Na 100 5 0.5 1.87
MgCl
2
Mg 200 5 0.25 0.98
CaCl
2
Ca 100 10 1.0 2.77
FeCl
2
Fe 200 10 0.5 1.13
MnCl
2
Mn 10
4
20 0.02 0.046
ZnCl
2
Zn 10
4
20 0.02 0.042
CuCl
2
Cu 10
5

20 0.002 0.0042
CoCl
2
Co 10
5
20 0.002 0.0044
a. Dựa vào sản lượng tăng trưởng của các nguyên tố trong sinh khối khô.
b. Theo Pirt (1975), Egli và Fiechter (1981). Sản lượng tăng trưởng của C và
các nguyên tố vết Zn, Cu, Mo, Mn
Nhân tố Y
X/E
được phân tích từ sinh khối khô khi nuôi cấy trong điều kiện
không giới hạn tăng trưởng của hệ thống đóng. Đối với carbon, oxy, và hydro,
Y
X/E
không thể được tính toán chính xác trực tiếp từ các thành phần cơ bản của tế
bào do những thành phần này không chỉ tạo nên sinh khối, mà còn có các chức
năng trao đổi chất khác.Ngoài ra, trong bảng không nói đến một số lượng lớn các
chất nhận điện tử cần thiết phải được đảm bảo cho quá trình sinh trưởng.
Tính chất hóa học của các thành phần trong môi trường sinh trưởng phải được
tính đến khi chọn F
E
. Ví dụ, phần lớn các nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa trong
môi trường sinh trưởng ở pH trung tính hoặc kiềm và do đó giảm bớt khả năng hấp
thụ sinh học (khó khăn để xác định). Do đó, chúng được thêm vào nhiều gấp 10
tới 20 lần (Bridson và Brecker, 1970).
Trong công nghệ sinh học, quá trình nuôi cấy theo mẻ (batch) và nuôi cấy
theo mẻ có bổ sung (fed-batch) được nghiên cứu từ lâu vì rất có lợi khi thiết kế các
môi trường chứa tất cả nguyên tố với lượng chính xác lượng cần thiết, sao cho tất
cả các nguyên tố phải được tiêu thụ hết tại cuối kì tăng trưởng. Tuy nhiên, rất khó

khăn có thể đạt được điều này do tính đa dạng của các nguyên tố và sự phụ thuộc
của chúng vào điều kiện nuôi cấy.Tất nhiên, trong công nghệ sinh học, việc tối ưu
hóa môi trường là rất quan trọng để tính toán sự tiêu thụ chất dinh dưỡng và để
hạn chế tối đa sự hao phí nguyên liệu, hóa chất.
Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng của các chất cho và nhận điện tử
Các chất cho điện tử

H
2
Y
X/H2 =
12g/mol
S
2
O
3
Y
X/S2O3 =
4g/mol
Fe
2+
Y
X/Fe2+ =
0.35g/mol
NH
4
+
- NO
3
-

Y
X/NH4 =
1.3-2.6/mol
NO
2
_
- NO
3
Y
X/NO2 =
0.9-1.8g/mol
Chất nhận điện tử
O
2
Y
X/O2 =
10
a
-42
b
g/mol
NO
3
-
- N
2
Y
X/NO3 =
27g/mol
c

NO
2
-
- N
2
Y
X/NO2 =
17g/mol
c

N
2
O
-
- N
2
Y
X/N2O =
9g/mol
c

a. Đối với các cơ chất khử là methane hoặc n-alkanes.
b. Đối với các chất oxy hóa là glucose.
c. Đối với Paracoccus denitrificans với nguồn carbon là glutamate