Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 5 pdf

CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN

V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR
Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật
PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004.
(nguồn:

V.1.1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng
- Quy trình này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện vi-rút gây hội chứng
đốm trắng (sau đây gọi tắt là bệnh vi-rút đốm trắng) bằng kỹ thuật Polymerase Chain
Reaction (sau đây gọi tắt là PCR).
- Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm
nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR. Có thể sử
dụng Quy trình này
để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng cho các loài giáp xác khác.

V.1.2. Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành
- Lightner D.V. (Ed.) (1996). Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for
Diseases of Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA.
- Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F.,
Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). White spot syndrome baculovi-rút (WSBV)
detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods. Dis. Aquat.
Org., 27, 215-225.
- Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y.,
Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). Detection of baculovi-rút
associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase
chain reaction. Dis. Aquat. Org., 25, 133-141.
- Newton C.R. and Graham A. (1994). PCR. The Alden ss Ltd, Oxford, UK.

V.1.3. Giải thích thuật ngữ
- Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối

tiếp nhau dùng để khuếch đại s
ố lượng bản sao của một trình tự DNA đích thông qua
các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính DNA, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch
mới nhờ enzym DNA polymerase.

59
- DNA polymerase là enzym tổng hợp nên mạch DNA mới từ một mạch khuôn, có thể
tham gia vào quá trình sao chép.
- Bp (Base pair) là cặp liên kết A -T hoặc C - G trên một phân tử DNA mạch kép và là
đơn vị đo chiều dài của một phân tử DNA.
- Mồi (Primer) là một trình tự DNA ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn DNA có mang
một đầu 3’-OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.
- Mồi xuôi và mồi ngược: đượ
c hiểu theo chiều của phiên mã ngược.
- Sự biến tính (Denaturation) là sự biến tính của DNA tách từ mạch kép sang dạng
mạch đơn. Tác nhân gây nên sự biến tính thường là nhiệt.
- Phiến mang tôm là phần cấu tạo gồm nhiều tơ mang hợp thành mang tôm. Các tơ
mang gồm các tế bào có chức năng chính là hô hấp.

V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất
V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ
- Bộ nghi
ền mẫu vô trùng.
- Máy trộn mẫu.
- Máy khuấy từ.
- Máy cất nước.
- Máy ly tâm (tốc độ không nhỏ hơn 13.000 vòng/phút).
- Máy luân nhiệt.
- Bộ điện di gồm nguồn và bồn điện di ngang.
- Bàn đọc kết quả với tia UV , bước sóng 302 nm.

- Bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả.
- Tủ lạnh nhiệt
độ -20
o
C hoặc thấp hơn.
- Tủ lạnh nhiệt độ 4
o
C.
- Tủ thao tác vô trùng.
- Tủ sấy dụng cụ.
- Lò vi sóng (microwave).
- Cân phân tích (độ chính xác tới 0.001 g).

60
- Micropipette các loại: 1 - 5; 5 -10; 20 -100 và 100 -1000 ml.
- Ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml và 0,5 ml.
- Ðầu típ có lọc.
V.1.4.2. Mồi, hóa chất
Mồi
Mồi đặc hiệu của vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) sử dụng trong kỹ thuật PCR 2
bước gồm có mồi xuôi (146F1, 146F2) và mồi ngược (146R1, 146R2) được thiết kế từ
trình tự DNA SalI 146. Trình tự mồi cụ thể như sau:
 146F1: 5’ ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3’ (mồi xuôi);
 146R1: 5’TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3’ (mồi ngược);
 146F2: 5’GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3’ (mồi xuôi);
 146R2: 5’ TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3’ (mồi ngược).
Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích
được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm
TBE. Ðệm TBE có thành phần như sau: 10 mM Tris -HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA.
Hóa chất

Dung dịch để tách chiết DNA: sodium dodecyl sulfat - NaOH (SDS - NaOH)
 NaOH 0,5 N (20 X): hoà tan 2 g NaOH trong 100 ml nước cất vô trùng.
 SDS 0,25 % (20 X): hòa tan 0,25 g SDS trong 100 ml nước cất vô trùng (không
được hấp vô trùng).
 4.2.2.2 Dung dịch NaOH 0,025 N - SDS 0,0125 %
 NaOH 0,5 N: 5 ml
 SDS 0,25%: 5 ml
 Nước cất vô trùng vừa đủ: 100 ml
 Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 4
o
C.
PCR master mix cho 50 ml phản ứng khuếch đại gồm:
 Taq DNA Polymerase: 1,25 units
 Tris-HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25
o
C): 75 mM
 (NH
4
)
2
SO
4
: 20 mM
 MgCl
2
: 1,5 mM

61
 Tween 20: 0,01%
 dATP, dCTP, d GTP và dTTP: 0,2 mM mỗi loại

Thang DNA fX174/HaeIII
Dung dịch đệm TBE (Tris - axit boric - EDTA)
 EDTA (ethylene diamine tetra acetic) 0,5 M: hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml
nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH = 8 bằng NaOH. Sau đó, thêm nước cất cho
đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ trong phòng.
 TBE 1 X:
 Tris: 108 g
 Axit boric: 55 g
 EDTA 0,5 M: 40 ml
 Pha chế dung dịch 10 X (đậm đặc 10 lần) bằng cách hòa tan 108 g Tris và 55 g
axit boric trong khoảng 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M rồi chỉnh
thể tích bằng nước cho đủ
1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ trong phòng. Khi sử dụng
mới pha loãng với nước cất vô trùng thành dung dịch 1 X.
Agarose 1% trong dung dịch TBE
Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6 X gồm: bromophenol blue 0,25 %
và glycerol 40 %
Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml)

V.1.5. Chuẩn bị mẫu
V.1.5.1. Số lượng mẫu
Ðối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae): Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100
mg cá thể lấy nguyên con.
Ðối với mẫu tôm bố mẹ: Lượng mẫu dùng cho mỗi phả
n ứng là 100 mg lấy ở phiến mang
tôm hoặc cuống mắt hoặc chân bơi.
Ðối với mẫu tôm thương phẩm: Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở
phiến mang tôm. Mẫu tôm thương phẩm được lấy trong 2 trường hợp:
a) Nếu ao có tôm bị bệnh, phải lấy mẫu khoảng 10 - 20 cá thể có dấu hiệu bệnh lý
rõ nhất.

b) Nếu ao tôm đang phát triển bình th
ường hoặc không thấy dấu hiệu bệnh lý, phải
lấy ngẫu nhiên khoảng 20 - 30 cá thể.

62
V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu để phân tích
Mẫu phải được lấy khi tôm còn sống và được bảo quản ngay trong cồn 95 %. Thể tích
cồn sử dụng để bảo quản phải không nhỏ hơn 3 lần so với thể tích mẫu cần phân tích. Sau
khi cố định, mẫu được lưu giữ ở nhiệt độ khoảng 25 - 30
o
C trong 1 tuần lễ. Khi cần bảo
quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới.

V.1.6. Phương pháp tiến hành
V.1.6.1. Xử lý mẫu
 Mẫu được nghiền trong bộ nghiền mẫu vô trùng với 900 ml dung dịch tách chiết
DNA. Dung dịch sau khi nghiền được dồn vào eppendorf 1,5 ml để làm biến tính
bằng cách đun sôi cách thủy trong khoảng 5 -10 phút rồi làm lạnh nhanh bằng cách
cho vào nước đá.
 Tiến hành ly tâm dịch nghiền trong 5 phút bằng máy ly tâm vớ
i tốc độ 13.000
vòng/phút. Sau đó, thu phần dịch nổi để thực hiện phản ứng PCR. Nếu mẫu chưa
được phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20
o
C trong vòng 1 tuần lễ.
V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR
Phản ứng gồm hai lần khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen của WSSV dựa trên cặp mồi đặc
hiệu. Dùng cặp mồi 146F1, 146R1 để khuếch đại lần 1 cho sản phẩm có độ dài 1441 bp
và cặp mồi 146F2, 146R2 để khuếch đại lần 2 cho sản phẩm khuếch đại có độ dài 941 bp.
Bước khuếch đại lần 1

Thành phần 50 ml phản ứng PCR bước 1 như sau:
 Ðối với mẫu thử: hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi
thêm vào 1 ml mồi 146F1 và 146R1 có nồng độ 25 mM và 2 ml dịch chiết DNA
từ mẫu cần phân tích.
 Mẫu đối chứng dương: thay dịch chiết DNA từ mẫu cần phân tích bằng dịch chiết
DNA từ mẫu bệnh đốm trắng đã biết.
 Mẫu đối chứng âm: thay dịch chiết DNA từ
mẫu cần phân tích bằng nước cất vô trùng.
Bước khuếch đại lần 2
 Hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi thêm vào 1 ml mỗi
mồi 146F2 và 146R2 có nồng độ 25 mM và 2 ml sản phẩm khuếch đại lần 1.
 Phản ứng khuếch đại PCR cả 2 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt và cài đặt
với cùng một chế độ phản ứng.
Chế độ phản ứng khuếch đại: ở nhiệt độ 94
o
C trong 4 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ
94
o
C trong 1 phút; ở nhiệt độ 55
o
C trong 1 phút; ở nhiệt độ 72
o
C trong 2 phút (39 chu
kỳ); ở nhiệt độ 72
o
C trong 2 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ 4
o
C cho đến khi phân tích.

63

Sản phẩm khuếch đại bước 2 được điện di ngay trên thạch agarose 1% có chứa
ethidium bromide.
V.1.6.3. Tiến hành điện di
Chuẩn bị gel agarose 1%
Gel agarose được pha trong dung dịch đệm TBE 1 X. Sau khi đun chảy hoàn toàn thạch,
để nguội tới nhiệt độ khoảng 60
o
C rồi thêm vào 5 ml dung dịch ethidium bromide và 100
ml agarose. Gel agarose được để vào khuôn có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải
có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi đã chuẩn bị phải được ngâm chìm trong dung
dịch đệm TBE 1 X.
Khay điện di:
Khay điện di chứa dung dịch đệm TBE 1 X.
Ðiện di
Trộn 10 ml sản phẩm khuếch đại với 2 ml dung dịch nạp mẫu rồi cho vào các giếng
thạch. Ðiện di trong thời gian 30 phút ở điện thế 100 V và cường độ 50 mA.

V.1.7. Ðọc kết quả
 Kết quả được đọc trên bàn đọc với tia UV (bước sóng 302 nm). Sản phẩm khuếch đại
đặc hiệu của WSSV ở bước 1 là 1441 bp và bước 2 là 941 bp.
 Căn cứ vào thang DNA chuẩn, mẫu được xác
định là dương hay âm tính với WSSV
dựa trên sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của bước khuếch đại lần 1 và 2.

Hình 7.1. Sản phẩm khuếch đại bước 1 và 2 phân tách trên gel agarose 1% trong đệm
TBE 1X. Giếng M là thang DNA chuẩn; Giếng 1-2 là sản phẩm khuếch đại bước 1;
Giếng 4 là mẫu đối chứng dương; Giếng 5, 6 và 7 là những mẫu dương tính với WSSV;
Giếng 8 là mẫu đối chứng âm.

64

V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn
Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các quy định sau đây:
 Thuốc nhuộm ethidium bromide là một chất độc có thể gây ung thư cho người và
động vật. Do đó, khi sử dụng hóa chất này phải mang găng tay và kính bảo hộ. Dung
dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.
 Chỉ được bật đèn cực tím UV để quan sát kết qu
ả sau khi đã đóng kính bảo vệ.
 Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc
chuẩn bị mẫu.
 Phòng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý
sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.

V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV
Nguồn: Farming IntelliGene Technology Corporation ()
V.2.1. Giới thiệu
Kit IQ2000 (Farming Intelligene, Đài Loan) phát hiện và định loại YHV/GAV trên tôm
he là một hệ thống thương mại sinh học phân tử cho việc phát hiện hai loại virut này.
IQ2000 YHV/GAV có thể phát hiện và phân biệt prototype của hai loại vi-rút này và cho
kết quả mức độ nhiễm dựa theo các mẫu đối chứng. Đặc điểm sinh học tự nhiên của
GAV và YHV và trình tự RNA của chúng được sử dụng để thiết kế bộ kit dựa vào kết
qu
ả nghiên cứu của CSIRO, Úc và BIOTEC, Thái Lan.
Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây ở các nước Đông Nam Á cho thấy có nhiều virut khác
có quan hệ với YHV/GAV. Do chưa có thông tin đầy đủ về các virut mới này nên Kit
IQ2000 YHV/GAV có thể không phát hiện được những virut có liên quan với virút
YHY/GAV, hay có thể phản ứng chéo với những virut này. Sự tác động và ảnh hưởng
của những virut này đối với ngành công nghiệp nuôi tôm và mối quan hệ giữa chúng với
YHV/GAV phát hiện đầu tiên hiện nay v
ẫn còn đang được nghiên cứu.

V.2.2. Thành phần
RT - PCR Pre-Mix reagent 4 ống, 420 µl/ống,
Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của
YHV/GAV
Nested Pre-Mix reagent 4 ống, 840 µl/ống,
Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của
YHV/GAV

65
Đối chứng dương YHV 1 ống, 100 µl/ống,10
4
copies/µl
Đối chứng dương GAV 1 ống, 100 µl/ống,10
4
copies/µl
Yeast tRNA 1 ống, 500 µl/ống, 40µl/µl
Iqzyme DNA polymerase 1 ống, 2U/µl, 360 µl/µl
RT enzyme mix 1 ống, 120 µl/ống
6X loading Dye (dung dịch nạp mẫu) 1 ống, 1500 µl/ống
DNA moclecular weight marker (thang DNA) 1 ống, 100 µl/ống
848 bp, 630 bp & 333 bp
DEPC ddH
2
0 1 chai, 100ml/chai
RNA Extraction Solution (Dung dịch ly trích RNA) 1 chai, 100ml/chai, giữ ở 4 °C
V.2.3. Thiết bị và hóa chất
1. Máy chu kỳ nhiệt
2. Máy ly tâm
3. Bộ điện di (nguồn và bồn điện di)
4. Bàn đọc UV và máy chụp hình gel

5. Máy lắc
6. Máy ủ
7. Pipet tự động
8. Hệ thống chụp ảnh
9. Cân
10. Chloroform
11. 95% ethanol
12. Ethidium bromide
13. Dung dịch điện di là TAE hoặ
c TBE
14. Agarose
15. Nước cất
16. Iso-propanol (2-propanol)

66
V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy
Giới hạn phát hiện và tính nhạy của kit IQ2000 YHV/GAV tùy thuộc vào nguốn mẫu
chẩn đoán. Dựa vào đặc điểm phân bố của virut trên tôm, mang là cơ quan tốt nhất để thu
mẫu đối với tôm ấu niên và tôm trưởng thành. Các nguồn mẫu thường dùng để chẩn đoán
được trình bày ở bảng sau:
Bảng 5.1: Các nguồn mẫu dùng để chẩn đoánn WSSV
Mẫu Số lượ
ng kiểm tra Giới hạn phát hiện Đương lượng của
tính nhạy cảm
Plasmid DNA
YHV/GAV
2 bản sao 2 bản sao/ phản ứng
2 bản sao/µl mẫu
plasmid
In vitro transcribed

RNA
20 bản sao 20 bản sao/phản ứng
20 bản sao/µl In vitro
transcribed RNA
Tôm bột (< PL12) 10 con 20 bản sao/phản ứng 500 bản sao/con
PL12 - PL 20 5 con 20 bản sao/phản ứng 1000 bản sao/con
Mang (tôm <PL20
đến 5g/con)
Nguyên mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu
Mang (tôm 5g/con
đến tôm bố mẹ)
2-3 phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu
Mang (tôm bố mẹ) Nữa phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu

Theo bảng trên thì kết quả chẩn đoán âm tính có nghĩa là mẫu phân tích không nhiễm
YHV/GAV hoặc mẫu bị nhiễm ở mức thấp hơn khả năng phát hiện của phương pháp.
Các kết quả trình bày ở bảng trên được thực hiện theo thao tác và hoá chất như hướng
dẫn trong tài liệu này.

V.2.5. Chuẩn bị mẫu và ly trích RNA
V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA
a. Cho mẫu vào ống típ 1.5ml có chứa 500 µl dung dịch li trích RNA.
b. Nghiền mẫu trong tip bằng que nghiền, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
c. Thêm 100 µl CHCl
3
sau đó lắc kỹ trong 20 giây. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3
phút, sau đó li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút

67
d. Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang một típ 0.5 ml mới có chứa 200 µl 2-

propanol (isopropanol).
e. Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol.
f. Rửa phần viên bằng 0.5 ml ethanol 75%, sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5
phút ở 7500 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và
làm khô phần viên.
g. Hoà tan phần viên với nước cất.
V.2.5.2. Hoà tan RNA
Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lượng RNA khác nhau, cần điều chỉnh
nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lượng dung dịch nước cất khác nhau:
Nguồn mẫu Liều lượng
Tôm bột 500 µl
Mang 200 µl

V.2.6. Qui trình khuếch đại
V.2.6.1. Chuẩn bị hoá chất phản ứng
a. Phản ứng RT-PCR 1: 8 µl/phản ứng
Chuẩn bị các chất cần thiết sau:
- RT - PCR Pre-Mix reagent 7.0 µl
- Iqzyme DNA Polymerase 2 Ul/µl 0.5 µl
- Reverse Transcription (RT)Enzyme Mix 0.5 µl
b. Phản ứng nested PCR : 15 µl/phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:
- Nested Pre-Mix reagent 14 µl
- Iqzyme DNA Polymerase 2UI/µl 1 µl
V.2.6.2. Điều kiện phản ứng
a.
Phản ứng RT-PCR 42 °C trong 30 giây
94 °C trong 2 phút

68
Sau đó
94 °C trong 20 giây
62 °C trong 20 giây
72 °C trong 30 giây
Lặp lại chu kỳ trên 15 lần
72 °C trong 30 giây
20 °C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng
b.
PCR bước 2 94 °C trong 20 giây
62 °C trong 20 giây
72 °C trong 30 giây
Lặp lại chu kỳ trên 30 lần
72 °C trong 30 giây
20 °C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng
V.2.6.3. Phương thức chuẩn bị phản ứng
- Pipet 8 µl RT-PCR cho vào típ phản ứng 0.2ml đã được đánh dấu.
- Thêm 2 µl mẫu RNA cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng
trộn đều.
- Thực hiện phản ứ
ng RT-PCR.
- Sau khi phản ứng kết thúc thêm 15 µl hỗn hợp thứ hai vào ống chứa sản phẩm
phản ứng RT-PCR.
- Thực hiện phản ứng PCR thứ 2
- Sau khi phản ứng PCR bước 2 hoàn thành, thêm 5 µl 6X dung dịch nạp mẫu
vào mỗi ống và trộn đều.
- Sau khi trộn, mẫu đã sẵng sàng để điện di
Ghi chú : nên sử dụng 10 bản sao/µl mẫu đối chứ
ng cho mỗi lần khuếch đại để kiểm soát
độ nhạy của phản ứng. Nên dùng Yeast tRNA (kèm theo kit) để pha loãng mẫu đối chứng

dương. Cần phải giữ mẫu đối chứng dương ở - 20 °C khoảng 1 tuần trước khi sử dụng.

69

V.2.7. Điện di
V.2.7.1. Chuẩn bị bản thạch (gel)
a. Trước tiên, chọn dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE hay TBE. Sau đó pha
loãng dung dịch ở nồng độ 1X để chuẩn bị gel và làm dung dịch đệm để chạy
điện di. Lưu ý dung dịch dùng chạy điện di và chuẩn bị gel phải giống nhau.
b. Nên sử dụng 2 % agar (2 g/100 ml). Hoặc điều chỉnh theo tỉ lệ cho thích hợp.
Nên s
ử dụng chai có miệng rộng hay bình tam giác.
c. Đun nóng dung dịch agar cho tới khi agar tan hoàn toàn. Có thể sử dụng đèn cồn,
bếp ga, nồi đun hoặc lò vi ba. Tránh để gel sôi quá tràn ra ngoài.
d. Để nguội gel khoảng 50 °C và đổ agar từ từ vào khay đựng gel. Thể tích gel tùy
thuôc vào kích cỡ của khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy
của lược gel khoảng 0.3 - 0,5 cm và bề dày của gel không quá 0.8 cm.
e. Cẩn thận di chuyển lược gel và các khoá ở
hai bên khi gel đã đặc lại. Gel sẽ được
đem đi điện di. Không nên để gel ở nhiệt độ phòng lâu hơn 4 giờ.
V.2.7.2. Điện di
a. Cho gel vào bồn điện di. Phân tử DNA sẽ di chuyển sang cực dương vì DNA
mang điện tích âm.
b. Thêm dung dịch điện di vào hộp cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel.
c. Thêm 5-10 µl dung dịch nạp mẫu vào trong từng giếng một. Dung dịch nạp
m
ẫu sẽ chìm xuống đáy giếng vì nó nặng hơn dung dịch đệm, cẩn thận để
tránh làm nhiễm mẫu.
d. Phải dùng thang DNA cho từng gel, mỗi gel dùng 5 µl cho hai giếng hai đầu.
Mục đích của việc sử dụng thang DNA là nhằm để xác định trọng lượng phân

tử của sản phẩm PCR.
e. Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn
điện và nhấn nút ON. Nên kiểm tra lại dòng điện và sử dụng 100-150V
(không nên dùng quá 150V) để chạy gel.
f. Dung dịch nạp mẫu có chứa hai loại phẩm màu. Bromphenol blue có màu
xanh đậm, xylene cyanol có màu xanh nhạt. Nên ngừng điện di khi màu xanh
đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Sau đó di chuyển khay điện di ra khỏi
bồn điện di để chuẩn bị nhuộm ethidium bromide (EtBr).
g. Nếu chạy nhiều gel trong cùng 1 ngày, có thể tái sử dụng dung dịch đi
ện di.
Nếu không, để tránh hiện tượng lây nhiễm không nên tái sử dụng dung dịch
điện di và nên rữa hộp điện di bằng nước sạch nhiều lần ngay khi kết thúc quá
trình điện di.

70
V.2.7.3. Thuốc nhuộm gel và đọc kết quả
a. EtBr thường được chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10 mg/ml. Hoá chất này nên
trữ trong chai nâu vì chúng dễ bị hỏng. Chú ý EtBr là tác nhân gây ung thư,
nên mặc trang phục bảo vệ và đeo găng tay khi sử dụng hóa chất này.
b. Pha loãng 10 mg/ml nguyên liệu gốc 20,000 lần (ví dụ: cho 5 µl dung dịch
EtBr 10 mg/ml vào 100 ml nước cất)
c. Đổ dung dịch EtBr trên khay nhựa với gel đã điện di. Thuốc nhuộm ph
ải bao
phủ gel.
d. Nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, đặt gel vào một khai nhựa
khác có nước cất trong 10 phút để rữa phần thuốc nhuộm thừa.
e. Đặt gel trên bàn UV để đọc kết quả.

V.2.8. Đọc kết quả
1. Mẫu dương tính và mẫu đối chứng dương hiện ra những vạch trên gel

Hình 7.2. Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000
- Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng
- Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng
- Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng
- Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng
- Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng
- Cột 6: Mẫu chuẩ
n nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng
- Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng
- Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ
- Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng
- Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ

71
- Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV
- Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp
2. Những mẫu YHV/GAV âm tính hiện vạch 680 bp là RNA thông tin của tôm.
3. Phương thức chẩn đoán
a. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 277 bp và vạch 777 bp thì mẫu
nhiễm YHV nặng.
b. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nh
ẹ.
c. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì mẫu
nhiễm GAV nặng.
d. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ.
e. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 680 bp thì mẫu âm tính YHV/GAV.
4. Mỗi xét nghiệm PCR cần có mẫu đối chứng âm và dương. Nếu mẫu đối chứng d
ương
có 10

3
bản sao mà kết quả không hiện lên vạch 277 bp hoặc 406 thì có nghiã là phản
ứng PCR đó sai hoặc RT sai hoặc cả hai cùng sai. Nếu mẫu đối chứng âm cho kết quả
vạch 277 bp Hoặc 406 bp thì mẫu đó bị tạp nhiễm.


72
V.2.9. Khắc phục sự cố kỹ thuật
Bảng 5.2: Các sự cố kỹ thuật thường gặp, nguyên nhân và cách khắc phục
Sự cố hay triệu chứng Nguyên nhân Cách khắc phục
Vạch hiện lên không rõ
hoặc không hiện sau
điện di
1. Dung dịch EtBr mất phẩm
chất
2. Chưa bật đèn UV
3. Nền agar quá cứng
4. Nền agar qua dày
1. Thay dung dịch BtEr khác hoặc
nhuộm lâu hơn
2. Kiểm tra máy UV
3. Ngâm gel trong nước sạch 4 °C
khoảng 30 phút
4. Điều chỉnh gel nếu gel dày hơn 0.8
cm và chạy điện di lại
Đối chứng dương hiện
các vạch bình thường
nhưng thang DNA
không hiện vạch nào
Thang DNA mất phẩm chất

hoặc quá nhẹ
Thay thang DNA hoặc tăng thêm lượng
thang DNA nạp vào
Thang DNA hiện vạch
bình thường nhưng đối
chứng dương không
hiện vạch nào
1. RT sai hoặc PCR sai hoặc
cả hai
2. Chưa cho Iqzyme vào
3. Đối chứng dương bị hỏng
1. Kiểm tra phần chuẩn bị thuốc thử và
lập trình PCR
2. Cho thêm Iqzyme vào
3. Thay đối chứng dương mới
Đối chứng dương 10
3

hiện vạch nhưng đối
chứng dương nhiễm
nhẹ không hiện vạch
1. Đối chứng dương mất
phẩm chất
2. Đối chứng dương 10
4
mất
phẩm chất
3. Iqzyme hoạt động kém
1. Thay đối chứng dương mới
2. Thay đối chứng dương 10

4

3. Xem lại hạn sử dụng và các điều kiện
của Iqzyme hoặc thay Iqzyme mới
Đối chứng âm hiện
vạch giống đối chứng
dương
1. Pipet bị nhiễm
2. Hóa chất bị nhiễm
3. Phòng thí nghiệm bị
nhiễm
1. Rửa pipet, dùng típ mới. Nên dùng
riêng các lọai pipet cho PCR
2. Chạy phản ứng lại với hoá chất mới
3. Tham khảo ý kiến của Farming
IntelliGene đề tiệt trùng PTN
Đối chứng dương tính
(+) và âm tính (-) hiện
vạch bình thường
nhưng mẫu đã biết là
nhiễm YHV/GAV
không hiện vạch nào
1. Ly trích RNA sai
2. RNA ly trích có chất
lượng kém hay nồng độ
RNA quá cao
3. Phản ứng PCR bị ức chế
1. Kiểm tra lại phương pháp li trích
RNA
2. Kiểm tra tỉ lệ OD 260/280 thường từ

1.6 đến 1.8
3. Dùng đối chứng dương 10
3
cho phản
ứng PCR. Nếu kết quả cho ra vạch
bình thường thì phản ứng PCR không

73
bị ức chế. Nếu đối chứng dương 10
3

không hiện vạch thì phản ứng PCR
bị ức chế cần ly trích RNA lại.

V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP
V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn
(nguồn: Diagnostic Bacteriology, AAHRI, 1996)
Các mẫu bệnh phẩm thủy sản được khử trùng bằng cồn 70
o
và giải phẫu bằng bộ tiểu
phẫu vô trùng. Vi khuẩn được phân lập từ gan, thận hay tụy và cấy lên môi trường
Tryptic Soy Agar (TSA, Difco) và sau đó là môi trường chọn lọc, chẳng hạn như
Aeromonas agar (Oxoid) có chứa ampicilin (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), hay môi
trường TCBS. Đĩa agar được ủ 24 giờ ở 28 °C. Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn để
xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và kiểu ribosom cùng với chủ
ng chuẩn. Các
chủng vi khuẩn được trữ ở -80 °C trong môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa
15% glycerol và 1-1.5 % NaCl tuỳ theo mẫu là thuỷ sản nước ngọt hay nước lợ.

V.3.2 Phương pháp RFLP

(nguồn: Pedersen, K. & J.L. Larsen. (1993). rRNA gene restriction patterns of Vibrio
anguillarum serogroup O1. Diseases of Aquatic Organisms 16: 121-126).
V.3.2.1. Ly trích DNA
Vi khuẩn được nuôi 16 giờ trong 10 ml veal infusion broth có chứa 1 % NaCl. Sau đó 1.5
ml dung dịch vi khuẩn được ly tâm 2 phút ở 13,000 vòng/phút, rút bỏ phần môi trường,
trộn đều với 500 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) trước khi cho
20 µl dung dịch 10 % SDS vào và ủ 30 phút ở 56 °C để làm vỡ tế bào vi khuẩn. Sau khi ủ
xong, dung dịch được trộn đều với 250 µl ammonium acetate, pH 4.5, để 15 phút ở -20
°C trước khi hoà vào 700 µl phenol:chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ 25:24:1). Sau đó
dung d
ịch được ly tâm 15 phút ở tốc độ 13,000 vòng/phút, phần trong phía trên sau khi ly
tâm được chuyển sang ống eppendop mới trộn với 800 µl chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ
24:1) và ly tâm 15 phút ở vận tốc 13,000 vòng/phút. Phần trong phía trên lại được chuyển
sang ống eppendop mới lần nữa để kết tủa DNA bằng 350 µl isopropanol. Hỗn hợp được
để 30 phút ở -20 °C, ly tâm 15 phút với tốc độ 13,000 vòng/phút, hút bỏ phần dung dịch,
rửa DNA bằng dung dịch 70 % ethanol, làm khô ở nhiệt
độ phòng và hoà tan trong 10 µl
dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA). Hàm lượng DNA được đo bằng
quang phổ kế ở bước sóng 260 nm.
V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn
DNA ly trích từ vi khuẩn được cắt bằng enzym giới hạn SmaI. Phản ứng được thực hiện
gồm các thành phần: DNA ly trích từ vi khuẩn, 5 µl 10X restriction enzyme buffer, 3 µl
enzyme giới hạn (tuỳ theo giống vi khuẩn phân tích, chằng hạn như SmaI cho Aeromonas
hay MluI cho Virio), thêm nước tinh khiế
t cho đạt dung tích 20 µl. Hỗn hợp được trộn

74
đều, ly tâm nhanh và ủ 3 giờ ở 37 °C. Sau đó hỗn hợp được trộn với 10 µl dung dịch nạp
mẫu (2 mM EDTA pH 8.0; 0.1 % bromophenol blue; 30 % glycerol) và chạy điện di 18
giờ ở 25V trên gel (0.8 % agarose) bằng dung dịch đệm TAE (40 mM Tris, 40 mM

sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0).
V.3.2.3. Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển
Gel sau khi chạy điện di được ngâm 10 phút ở nhiệt độ phòng trong dung dịch khử puria
0.25 M HCl, rửa bằng nước cất và được xử lý 30 phút trong dung dịch 0.5 M NaOH và 1.5
M NaCl để làm biến tính DNA. Sau
đó, DNA trên gel được chuyển qua màng nylon bằng
máy thấm chuyển chân không và được để 30 phút ở 80 °C để cố định DNA trên màng.
V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng
DNA trên màng nylon được thấm với 20 ml dung dịch tiền lai và giữ 1 giờ ở 56 °C, rồi
lai qua đêm ở 56 °C trong dung dịch lai chứa mẫu dò có trình tự bổ sung với RNA
ribosom 16S và 23S của vi khuẩn. Mẫu dò được đánh dấu bằng digoxigenin. Sau khi lai,
màng được rửa nhiều lần với dung dịch rửa.
V.3.2.5. Phát hi
ện các vạch DNA
Màng nylon được ngâm 30 phút trong 5 % dung dịch cản, rồi được ủ 30 phút trong 40 ml
dung dịch ủ có chứa 8 µl phosphatase labelled anti-digoxigenin. Sau cùng các vạch DNA
được phát hiện bằng dung dịch có chứa chất nền phát màu (90 µl nitrobluetetrazolium
chloride-NBT và 66 µl 5- bromo-4-chloro-2-indolylphosphat toluidinium salt-BCIP
trong 20 ml dung dịch nhuộm).

V.3.3. Xử lý thống kê
(nguồn: Kerry Bartie, Đặng Thị Hoàng Oanh, Geert Huys, Cathryn Dickson, Margo
Cnockaert, Jean Swings, Nguyễn Thanh Phương, Alan Teale. (2007). Ứng dụng rep-pcr
và pfge để định type vi khuẩn kháng chloramphenicol phân lập từ các trại nuôi thủy sản ở
đồng bằng sông cửu long. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4 (1): 1-10)
Màng chứa các vạch DNA được xử lý bằng phần mềm GelCompar (Applied Maths, Bỉ). Tỉ
số đồng dạng các vạch DNA của các chủng vi khuẩn được điểm số bằng hệ s
ố tương quan
Pearson. Mức độ đồng dạng kiểu DNA của từng cặp chủng vi khuẩn được tính bằng phương
pháp phân tích cụm với UPGMA và biểu thị bằng sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn.

75
V.3.4. Đọc kết quả
Sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn phân tích (ví dụ hai mươi chủng vi khuẩn nghiên
cứu ở hình 7.3) và chủng chuẩn dựa theo các vạch DNA và mức độ đồng dạng của chúng.

Pearson correlation [0.0%-100.0%]

10
0

80

60
4
0
20

Ribotyp ing

.

.
.

.

.
.

.

.

.
.

.

.

.
.

.
.

.

.

.

.

.

.

.

.

VN MHO 3 (1)

VN MHO 10 (1)
VN Thien 2 K 2c (1)
VN Tam 2 L (1)

VN VIII 1 Sp a (2)
VN V 3 L (2)

VN MHO 17 (3)

VN VI 1 K (4)

VN VI 6 L (4)
VN VI 2 L (4)

VN VI 2 L (5)

VN M 11 (6)

VN VI (7)
VN VII (7)

A
TCC 7966
CIP 7433

A
TCC 15468

VN VII 4 Sp (8)

VN Vui 3 L (8)

VN K 19 (9)

VN V K 1 (10)

VN H V (11)

VN Thien HK (12)
A
. hydrophila
A
. ssobria
A
. caviae
molecular weight marker

Hình 7.3. Sơ đồ quan hệ các chủng vi khuẩn nghiên cứu với chủng chuẩn dựa trên kiểu
ribosom xác định bằng hệ số tương quan Pearson tính bằng UPGMA sử dụng phần mềm
GelCompair. Thang DNA (Molecular mass marker): Hind III-digested l DNA. (Nguồn:
Đặng Thị Hoàng Oanh. 2006. Đặc điểm sinh hoá và kiểu RNA ribosom của vi khuẩn
Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thuỷ sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp Chí
Khoa học số 5. Đại học Cần Thơ).

76
PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH
(nguồn: Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình
bệnh học thủy sản; FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical
paper 402/2; Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic
Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp; Noga, E. J. (1999). Fish Disease:
Diagnosis and Treatment; OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals).

1. Phụ lục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở cá
1. Thu thập các thông tin liên quan đến quá trình bộc phát bệnh từ người nuôi (địa
điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, cá nuôi bao nhiêu tuổi, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi
nhận thông tin về quản lý ao nuôi v.v.)
2. Thu mẫu cá (mức 1)
a. Thu mẫu cá sống
 Số lượng mẫu thu: từ 6-10 con (nếu cá lớn: thu 2con khỏe, 4 con bệnh).
 Mẫu cá bệnh nên còn số
ng (cá bệnh sắp chết).
 Vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng túi nilon (chứa không quá 1/3 nước) có
bơm oxy.
 Xử lý mẫu (mỗi con cá được xem là một mẫu)
Trước khi giải phẫu, cá phải được giết chết bằng cách hủy nảo hoặc gây mê
bằng dung dịch MS222. Đặt cá trên khay sạch, sau khi đã đo chiều dài và cân
trọng lượng. Quan sát cá bằng mắt thường ghi nhận tất cả các biểu hiện bên
ngoài như: vết thương, những điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của
bệnh.
a. Kiểm tra ngoại ký sinh trùng
b. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng
Phải áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình giải phẫu cá và phân

lập vi khuẩn để tránh trường hợp tạp nhiễm.
Dùng dung dịch 70 % ethanol sát trùng mặt ngoài của cá, lau sạch chất
nhầy trên da cá. Dùng kéo tiệt trùng để mổ cá.
Chú ý: khi mổ cá, tránh làm vỡ các cơ
quan nội tạng. Cần nhấc mũi kéo lên
tránh làm thủng ruột, vì đây là nguồn tạp nhiễm làm ảnh hưởng đến kết quả
phân lập.
Kiểm tra toàn bộ các cơ quan nội tạng. Ghi nhận đầy đủ các trạng thái
không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như quan sát màu sắc, hình

77
dạng và các dấu hiệu khác thường trên gan, thận và tỳ tạng (xem chi tiết ở
mục 2.1.1.3).
 Phải quan sát vị trí của các cơ quan nội tạng, tình trạng chất dịch trong
xoang cơ thể (có hay không, nhiều hay ít, màu gì, độ đục). Lấy chất dịch
làm tiêu bản nhuộm Gram.
 Phân lập vi khuẩn trên gan, thận và tỳ tạng (lá lách) và cấy lên đĩa TSA
hoặc NA. Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30 °C. Sau 18-24 gi
ờ, quan
sát và ghi nhận đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc.
b. Thu mẫu cá chết và mẫu mô
Trong nhiều trường hợp,không thể thu và chuyển mẫu sống đến phòng thí nghiệm
để chẩn đoán thì có thể vận chuyển mẫu chết hoặc mẫu mô. Phương pháp thu và
vận chuyển mẫu phải được phòng thí nghiệm nhận mẫu phân tích tư vấn cho phù
hợp với phương pháp sẽ được sử dụng t
ại phòng thí nghiệm đó.
 trường hợp cá nhỏ thì có thể giữ riêng từng cá trong túi nilon, làm dấu và
giữ trong nước đá chuyển về phòng thí nghiệm.
 trường hợp cá lớn thì phải lấy bỏ phần nội quan (thao tác phải tiệt trùng) và
giữ trong hộp nhựa hay túi nhựa vô trùng và giữ trong nước đá chuyển về

phong thí nghiệm.
 đối với mẫu xét nghiệm vi-rút thì phải giữ cá trong túi nilon tiệt trùng với 5
lầ
n thể tích dung dịch Hanks’ basal salt có bổ sung gentamycin (1,000
mg/ml) hay penicillin (800 IU/ml) + dihydrostreptamycin (800 mg/ml).
Những chất chống nấm như Mycostatin hay Fungizone cũng có thể được bổ
sung vào khoảng 400 IU/ml.
Ghi chú: mẫu còn nguyên vẹn hay mẫu sống là tốt nhất vì mẫu sau khi đã giải
phẫu sẽ tự phân hủy rất nhanh làm cho những kỹ thuật phân tích vô trùng trở nên
rất bất lợi. Mẫu được giữ lạnh bằng nước đá để chuyển về phòng thí nghiệm phải
đạt khoảng 4 ºC là tốt nhất nhưng không được đông lạnh. Mẫu phải được giữ riêng
từng cá thể để tránh tình trạng nhiễm chéo lẩn nhau.
c. Cố định mẫu mô
Trước khi cố định phải làm chết cá bằng cách hủy nảo hoặc gây mê (trừ trường
hợp phải quan sát ngoại ký sinh). Nếu cá còn nhỏ thì có thể ngâm cá vào trong
dung dịch cố định tối thiểu theo tỉ lệ 10:1 (dung dịch cố định: cá).
Đối với cá lớn
(>6 cm), cần phải mổ dọc theo phần bụng, tách bỏ phần nội quan và bóng hơi. Sau
đó cắt các nội quan với kích thước phù hợp (<1.0 cm
3
) để mô có thể ngấm tối đa
dung dịch cố định theo tỉ lệ 10:1 (dung dịch cố định: cá). Tốt nhất là cố định các
nội quan hay những mô bị tổn thương/lở loét. Hầu hết các loại mô các cần thời
gian cố định 24-48 giờ.


78
Dung dịch cố định thích hợp phân tích mô bệnh học cá là Phosphate Buffered
Formalin.
Công thức như sau:

37-40% formaldehyde 100 ml
Nước cất 900 ml
NaH
2
PO
4
.H
2
0 4.0 g
Na
2
HPO
4
6.5 g

2. Phụ lục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở tôm
1. Ghi lại các thông tin về ao thu mẫu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, tôm nuôi
bao nhiêu tuổi, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về quản lý ao nuôi v.v.).
2. Thu mẫu tôm
- Thu mẫu tôm có dấu hiệu bị bệnh, phải thu tôm lờ đờ nhưng còn sống không thu
tôm chết. Mỗi ao thu từ 15-20 con. Chuyển tôm về phòng thí nghiệm trong thùng
mướ
p hay xô nhựa có sục khí. Về đến phòng thí nghiệm chỉ xử lý những mẫu còn
sống (tối thiểu là 10 tôm/ao).
- Mỗi ao thu 2-3 tôm khỏe
- Xử lý mẫu (mỗi con tôm được xem là một mẫu)
a. Phân lập vi khuẩn
i. Dùng ống chích 1ml (kim tiêm tiệt trùng) lấy huyết tương từ ở gốc
chân bò thứ năm hoặc lấy trực tiếp từ tim.

ii. Nhỏ 1 giọt huyết tương vào đĩ
a TSA + 1.5 % NaCl.
iii. Sau đó dùng que cấy cấy theo 4 bước cấy tiêu chuẩn.
iv. Để đĩa TSA ở 28 ºC từ 16-24 giờ.
v. Nếu có vi khuẩn phát triển trên đường cấy thì chọn 01 khuẩn lạc theo
thứ tự ưu tiên 4, 3, 2, 1. Sau đó cấy truyền sang đĩa TSA khác để khẳng
định tính ròng.
vi. Chọn 01 khuẩn lạc ở đĩa cấy ròng nuôi tăng sinh trong môi trường NB
+ 1.5% 28 ºC 18 giờ.

79
vii. Cho 0.9ml dung dịch vi khuẩn và 0.9 ml dung dịch glycerol 50% vào
ống eppendorf dung tích 2ml. Lắc đều và giữ ở - 80 ºC.
b. Ly trích DNA và RNA
Sau khi đã lấy mẫu huyết tương, cắt ngang đầu tôm rồi cắt dọc phần đầu ra
làm đôi. Phân nửa được sử dụng để ly trích RNA và DNA. Ly trích RNA
bằng phương pháp Trizol (sử dụng máy li tâm thường) và trữ RNA ở - 80 ºC
ngay sau khi ly trích xong. Ly trích DNA bằng phương pháp CTAB hoặc lysis
buffer. DNA sau khi ly trích giữ ở - 20 ºC.
Có thể giữ mẫu tôm ở - 80 ºC nếu ch
ưa có thời gian ly trích RNA và DNA.
c. Lấy mẫu quan sát ký sinh trùng
d. Chuẩn bị mẫu mô bệnh học
Phân nửa đầu còn lại và các bộ phận khác được cố định trong dung dịch
Davidson’s AFA (theo tỉ lệ 1 phần cơ : 10 phần dd Davidson) và đúc khuôn
parafin theo phương pháp thông thường. Thời gian cố định trong dd Davidson
không được quá 48 giờ.
e. Ghi mã số mẫu theo ký hiệu thống nhất ví dụ như: PT-BL-P-p-N (PT: phân
trắng; BL: Bạc Liêu; P: đợt thu mẫu; p = ao; N: Số mẫ
u)

3. Phụ lục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở nhuyễn thể
1. Ghi lại các thông tin về mẫu thu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, nuôi bao
lâu, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về môi trường nuôi v.v.)
2. Thu mẫu nhuyễn thể còn sống
Nên giữ mẫu nhuyễn thể trong giấy tẩm nước để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu
sau khi thu phải được chuyể
n đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để hạn chế tối
đa sự mất oxy trong mô nhuyễn thể và giảm số lượng nhuyễn thể chết trong quá trình
vận chuyển nhất là trường hợp nhuyễn thể thu bị bệnh và sắp chết. Công việc xử lý
mẫu tại phòng thí nghiệm cũng phải được chuẩn bị sẵn để xử lý mẫu ngay khi chuyển
về đến phòng thí nghiệm.
3.
Cố định mẫu nhuyễn thể
Trường hợp không thể thu mẫu sống hay do khó vận chuyển về phòng thí nghiệm thì
có cố định mẫu trong dung dịch cố định. Mẫu cố định chỉ có thể dùng cho xét nghiệm
mô bệnh học chứ không thể phân lập vi khuẩn hay nấm.
Dung dịch cố định dùng cho nhuyễn thể có thành phần như sau:
i) Dung dịch 1G4F (1% Glutaraldehyde : 4% Formaldehyde)
* Dung dịch gốc 1G4F – có thể giữ ở 4 ºC trong vòng 3 tháng:

80
- 120 ml 37-40% dung dịch đệm formalin **
- 20 ml 50% glutaraldehyde
- 360 ml nước máy
** Dung dịch đệm formalin:
- 1 lít 37-40% formaldehyde
- 15 g disodium phosphate (Na
2
HPO

4
)
- 0.06 g sodium hydroxide (NaOH)
- 0.03 g phenol red (chỉ thị pH)
Dung dịch sử dụng phải được sử dụng ngay sau khi pha:
- 500 ml nước biển qua lọc vô trùng
- 500 ml dung dịch gốc 1G4F*
Độ dày của mô cố định khoảng 2-3 mm.
Mẫu có thể được giữ lâu trong dung dịch cố định ở nhiệt độ phòng. Mẫu dày hay
nguyên cơ thể của nhuyễn thể có thể giữ trong 10% dung dịch đệm formalin có thành
phần như sau:
ii) 10% dung dị
ch đệm formalin trong nước biển qua lọc vô trùng
10 ml 37-40% dung dịch đệm formalin **
90 ml nước biển qua lọc vô trùng
Nếu mẫu lớn hơn 10 mm có thể cắt mẫu thành mảnh nhỏ rồi cố định.
iii) Dung dịch cố định mô Davidson’s cũng có thể được sử dụnh với mẫu lớn hơn 10
mm. Trước khi đúc parafin, phải chuyển mô sang dung dịch 50% ethanol tối thiểu là
2 giờ, sau đó là dung dịch 70% ethanol, hoặc cho trực tiếp vào dung dịch 70%
isopropanol. Dung dịch cố định thích hợp nhất được chuẩn bị như sau:
Dung dịch gốc:
- 400 ml glycerin
- 800 ml formalin(37-40% formaldhyde)
- 1200 ml 95% ethanol (hay 99% iso propanol)
- 1200 ml nước biển qua lọc vô trùng
Dung dịch sử dụng: pha 9 phần dung dịch gốc với 1 phần glacial acetic acid

81
Hình thái cấu tạo cơ thể tôm

Cấu tạo giải phẫu của cá xương

(nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2).


82
PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM
(nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2;
Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002).
Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi).




Hình 1. Tôm giống khỏe




Hình 2. Tôm giống yếu



Hình 3. Tôm khỏe




Hình 4. Tôm còi do nhiễm MBV

83