Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 3 pot

CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH

Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng
nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký
sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự
tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về
tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặ
c của cả đàn thủy sản nuôi.

III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH
III.1.1. Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ
xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ
biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện
kháng thể
khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá
thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù
hợp với kháng thể.
Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa
tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro.
Hiện tượng tủ
a những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình
thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng
thể (Marrack, 1934) (hình 3.1).



34
Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau:
- Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị.

- Kháng nguyên đa hóa trị
- Kháng nguyên phải hòa tan và thành phần của môi trường như lực ion hay pH có
vai trò nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa.
- Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là nh
ững chất gây tủa tốt nhất, còn
kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan và ít kết tủa hơn.
- Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa

III.1.2. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong
mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng.

III.1.3. Mẫu phân tích
Mẫu huyết thanh hay huyết tương.

III.1.4. Các dạng khu
ếch tán miễn dịch
III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng
Phương pháp Heideiberger và Kendall
Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được
dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỷ lệ
nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho
đều cùng một lượng kháng thể không thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng
độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kế
t tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình
3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống.
Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể
bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong
huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng th
ể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được

lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên
và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp
Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những
ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép
xác định được 3 khu vực:

35
- Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên
nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể.
- Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép
hình thành mạng lưới 3 chiều.
- Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng
nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tố
i ưu cho phép tủa gần hết các phân tử
kháng thể và kháng nguyên.


Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng

Định lượng bằng đo độ đục
Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng
nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa
càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc
độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định
lượng có giá trị cao.
Kỹ thuậ
t này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau
mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và
trong việc tìm các kháng kháng thể.

36
III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel
Nguyên lý
Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau
thì gây tủa, tủa ấy không di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm.
Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)
Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách
này phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng. Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ
đối diện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể. Thời gian xuất hiện các
đường cung tủa có thể là hai ngày đến một tuần.


Hình 3.3. Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)

Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thể.
Muốn so sánh giữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thể
trong một huyết thanh thì có thể bố trí hai lô kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết
thanh. Kết quả có thể: (i) Phản ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có
epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nối liền nhau; (ii) Phản ứng không
y hệt nếu hai kháng nguyên khác nhau thì s
ẽ kết hợp riêng với hai kháng thể và hai đường
kết tủa sẽ cắt chéo nhau hoặc (iii) Phản ứng giống một phần khi hai kháng nguyên có
cùng một epitop và một epitop riêng khác nhau thì các kháng thể tương ứng sẽ cho một
đường tủa chung liền với nhau và một đường tủa phụ gắn với đường tủa trước đối với
kháng nguyên thứ hai (hình 3.3).
Ngược lại, có thể dùng kỹ thuật này để so sánh với nhau hai kháng huyết thanh gây tủa
để
xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không. Kỹ thuật này rất hay được
dùng để phát hiện các kháng thể chống nhân của một người so với một huyết thanh chuẩn.

37
Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini)
Kỹ thuật này dùng để định lượng kháng nguyên. Kháng thể đặc hiệu được hòa đều vào
trong thạch trước khi đổ dãy thạch lên trên kính hay hộp petri. Sau đó, đục các lỗ và cho
vào đó dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau. Kháng nguyên sẽ khuếch tán
và gặp kháng thể ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ
lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Việc định lượng được suy ra từ một đường bi
ểu diễn
chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên.
III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện
Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell)
Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di
chuyển của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường. Do đó vùng
kết tủa có hình tên lửa (còn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4). Chiều dài của hình tên lửa tỷ
lệ với nồng độ kháng nguyên. Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều
chất phả
n ứng hơn.

Hình 3.4. Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu

Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar và Williams)
Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng nguyên thì khuếch tán kép không đủ
để xác định mọi đường kết tủa. Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót ấy bằng cách tách
trước các kháng nguyên theo tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường rồi mới gây
tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di.
Các đường tủa xuất hiện theo hình thức nh
ững cung ở hai bên rãnh.
Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay
không so với một đối chứng. Đây là một kỹ thuật tốt để xác định một Ig đơn dòng do tạo
ra một cung tủa dày hơn, cong và gần rãnh hơn đồng thời nối liền với cung tủa của Ig

huyết thanh cùng lớp.
III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn d
ịch khuếch tán in situ
Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó
cho tác dụng của kháng thể đặc hiệu ngay trên lớp thạch để hình thành kết tủa kháng
nguyên- kháng thể. Như vậy, các thành phần của hỗn hơp phức tạp như huyết thanh được
tách ra bằn điện di trong thạch. Sau đó, các phân tử khác nhau định nghiên cứu sẽ được
tủa một cách ch
ọn lọc bằng các kháng huyết thanh đặc hiệu với các ptotein đã di chuyển

38
ngay trên bề mặt của thạch. Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của
thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng. Những phân tử không bị kết tủa thì sẽ
được rửa cho đến hết. Từ đó, dễ dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thể và
sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di. Kỹ
thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điệ
n di để chuẩn đoán những bất thường đơn
dòng của Ig. Nó có lợi hơn là kháng nguyên không có thời gian để khuếch tán trước khi
bị kết tủa bởi kháng thể. Tính thuần nhất của một thành phần đơn dòng nào đó nếu có ở
một lượng rất thấp thì cũng được bảo tồn trong kỹ thuật này. Sau cùng việc giải thích
những hình ảnh thu được cũng dễ dàng hơn trong kỹ thuật mi
ễn dịch điện di.

III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.1.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật đơn giản
III.1.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hòa tan thì mới có thể khuếch tán được. Mặt
khác phương pháp này có tính nhạy không cao.

III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH
III.2.1. Nguyên lý
Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng l
ưới giữa kháng nguyên và
kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết
đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng
thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết
mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng nguyên hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên
không bị hạn chế
.
Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình. Đó là kháng nguyên có
kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên hữu hình có epitop bề
mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng
mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng
ngưng kết nhạy hơn phản
ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng
kháng thể trong huyết thanh.
Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng
trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái.


39
III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có
mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu
cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho
các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân t
ạo lên bề mặt của nó,
trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol.
III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:

Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên tiếp xúc với kháng
thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn
trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết.
III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:
Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ ph
ản ứng,
sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điều kiện như
ngưng kết trực tiếp.
III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:
Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết
hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy ra mà vẫn có hiện tượng ngưng kết. Coombs
đã cho thêm kháng thể anti-globulin tạo một cầu nối giữa globulin miễ
n dịch đã có sẵn trên
hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách
tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì
sẽ gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp là một test huyết thanh cho phép tìm xem trong
một huyết thanh có hay không có kháng thể chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết.
Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhóm. Sau đó, rửa s
ạch thì trên
hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti-
glubolin và nếu có ngưng kết thì có nghĩa là trong ấy có kháng thể định tìm (hình 3.5).

Hình 3.5. Phương pháp test coombs trực tiếp vá gián tiếp

40
III.2.3. Ứng dụng
Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên
dạng hạt. Có 3 dạng thường gặp:
- Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự
tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu.

- Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh
được tạo ra để chống lại sự
nhiễm khuẩn.
- Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể
chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó .

III.2.4. Mẫu phân tích
Mẫu huyết tương hay huyết thanh

III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.2.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật khá đơn giản
III.2.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở
dạng hạt. Mặt khác phương pháp
này có tính nhạy không cao.

III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
III.3.1. Nguyên lý
Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật
dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu
sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát
quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng th
ể đánh
dấu hoặc kháng thể huỳnh quang.


41
III.3.2. Phương pháp
III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Kỹ thuật chỉ có hai thành phần: Kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp của phản ứng.
Một trong hai thành phần được gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Đầu tiên
người ta cố định vi khuẩn trên lam kính sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng
thể gắn với tế bào vi khuẩn. Rửa loại bỏ kháng thể
thừa rồi quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang. Chỉ có các vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới được quan
sát (hình 3.6).


Hình 3.6. Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp
Kỹ thuật này ngoài hai thành phần chính là kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu tạo ra
hai lớp của phản ứng còn có một thành phần nữa được gắn với thuốc nhuộm huỳnh
quang, tạo lớp thứ ba là kháng- kháng thể (hình 3.7).


42
III.3.3. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên của một mầm
bệnh chuyên biệt trong mô hay tế bào bị nhiễm bệnh. Phương pháp khá tương tự như kỹ
thuật IHC, cho phép việc phát hiện kháng nguyên qua sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể
có đánh dấu huỳnh quang.
III.3.4. Mẫu phân tích
Mẫu phân tích có thể là mẫu mô, mẫu tế bào, huyết thanh. Các m
ẫu này có thể được lưu
trữ bằng cách đông lạnh, làm khô hay cố định trong dung dịch cố định thích hợp.

III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.3.5.1. Ưu điểm:
Có tính nhạy cao và thao tác nhanh để phát hiện và định dạng mầm bệnh trong mẫu kính

phết, mô hay tế bào.
III.3.5.2. Nhược điểm:
Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang hoặc kháng huyết thanh. Việc đọc k
ết quả
đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc chẩn đoán để phân biệt những
trường hợp dương tính giả và âm tính giả. Phản ứng chéo của kháng thể với kháng
nguyên khá có thể xảy cho nên kháng thể sử dụng phải có tính chuyên biệt cao.

43


Hình 3.7. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM
III.4.1. Nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA-Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) là
kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng
độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật phóng xạ thì kỹ thuật này rất rẻ tiền và an
toàn hơn mà vẫn chính xác như nhau.
Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA giống như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nh
ưng thay
vì kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một
enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất này
thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng
nguyên với kháng thể, thông qua cường độ màu người ta biết được nồng độ của kháng
nguyên cần phát hiện.
Kỹ thuậ
t ELISA được chia làm hai dạng là ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. Các
enzym thường dùng trong kỹ thuật ELISA là β-galactoxidaza, glucooxidaza, peroxidazza

44
và phophadaza kiềm. ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như vi-rút, vi
khuẩn, nấm, kí sinh trùng.

III.4.2. Ứng dụng
ELISA được sử dụng để đánh giá sự tiếp xúc của mẫu bệnh phẩm với những tác nhân gây
bệnh khác nhau như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng. Kháng nguyên được làm tinh sạch và
hàm lượng kháng thể sử dụng cũng như hàm lượng kháng nguyên có thể xác định được.

III.4.3. Mẫu phân tích
Huyết thanh hay huyết tương

III.4.4. Phương pháp
Hàm l
ượng kháng thể sử dụng để kết hợp với kháng nguyên của mầm bệnh được xác định
bằng biểu đồ hàm lượng kháng thể chuẩn. Kết quả được đọc bằng hàm lượng kháng thể.
III.4.4.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng nguyên.
- Nhỏ huyết thanh có kháng thể (ví dụ antitoxin) vào giếng ở bảng nhựa để cho
kháng thể bám vào thành giếng.
- Nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm (ví dụ toxin). Nếu là kháng nguyên
đặc hiệu với kháng thể thì sẽ gắn với kháng thể.
- Thêm cộng hợp gắn enzym vào giếng để cho kháng thể của cộng gắn với kháng
nguyên mà trước đó đã gắn với kháng thể đầu tiên, tạo nên một “bánh mì kẹp chả”
là kháng thể- kháng nguyên- kháng thể gắn enzym (hình 3.8a).
- Bổ sung cơ chất của enzym. Enzym sẽ thủy phân c
ơ chất này làm thay đổi màu
của dung dịch. Tốc độ thủy phân của enzym sẽ tỉ lệ thuận với lượng kháng thể đã
gắn enzim, cũng có nghĩa là tỉ lệ thuận với kháng nguyên cần xét nghiệm. Sự thay
đổi màu dung dịch có thể nhìn thấy được bằng mắt thường hoặc đo được bằng

quang phổ kế.

45


Hình 3.8. Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng
nguyên; S: cơ chất)
III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng thể.
- Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng.
- Nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong
huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ gắn với nó.
- Thêm cộng hợp kháng- kháng thể đã gắn enzym. Kháng thể này được tạo thành để
kh
ống chế kháng thể người.
- Thêm cơ chất của enzym. Tốc độ thủy phân cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu
của dung dịch và tỉ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu. Sự thay
đổi màu có thể quan sát bằng mắt thường hay quang phổ kế (hình 3.8b).


46
III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.4.5.1. Ưu điểm:
Phương pháp ELISA là phương pháp khá nhạy và dễ thực hiện. Có thể xét nghiệm cùng
một lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian thực hiện ngắn nên được xem như là phương
pháp vàng trong sàng lọc/phát hiện bệnh.
III.4.5.2. Nhược điểm:
Cần phải có kháng thể đơn dòng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên của mầm bệnh
cầ
n xét nghiệm.

III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III
1. Kuby, J. (1997). Antigen-Antibody Interactions. In: Immunology. 3rd edition.
2. Vũ Triệu An và Jean, C.H. (2001). Miễn dịch học.
3. Nguyễn Lân Dũng. (2000). Vi sinh vật học.
4. Nguyễn Ngọc Lành. (1997). Miễn dịch học.
5. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2002). Biology of Microorganisms.
10th edition.
6. Đỗ Ngọc Liên. (1999). Miễn dịch học cơ sở.


47