ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG ĐỊNH DANH CÁC E. COLIGÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI pptx

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG ĐỊNH DANH CÁC E. COLI
GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI

TÓM TẮT
Mục tiêu: Tìm hiểu tỉ lệ nhiễm 5 loại E. coli gây tiêu chảy bao gồm EPEC,
EHEC, ETEC, EIEC và EAEC ở trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang. Chúng tôi ứng dụng quy
trình Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để định danh 5 loại E. coli
gây tiêu chảy. Khảo sát trên 213 trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy đến khám và điều
trị tại Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Saintpaul và Bệnh viện Thanh nhàn
của thành phố Hà nội (nhóm bệnh) và 100 trẻ khỏe mạnh (nhóm chứng). Từ tháng
9 năm 2000 đến tháng 9 năm 2001.
Kết quả: Trong nhóm bệnh tỉ lệ phân lập của các E. coli gây tiêu chảy là
24,9% trong đó EAEC chiếm tỉ lệ cao nhất là 15,9%, tiếp theo lần lượt là EPEC
(3,8%), EHEC (2,8), EIEC (1,9%) và ETEC (0,5%). Trong nhóm lành có 6 trẻ
phân lập được EAEC (6,0%), 1 trẻ nhiễm ETEC (1%) và 2 trẻ nhiễm EPEC (2%).
Các triệu chứng lâm sàng trên bệnh nhi không đặc trưng cho từng loại E. coli.
ABSTRACT
Objective: The study determines the incidence of E. coli diarrhea in
children includes: EAEC, EPEC, EHEC, EIEC and ETEC in the children under 5
years old with acute diarrhea.
Methods: Cross-sectional study. A multiplex PCR protocol using type –
specific primers was applied to determine the incidence of E. coli diarrheal
species in children include: EAEC, EPEC, EHEC, EIEC and ETEC. The study
examined 213 children under 5 years old with acute diarrhea (patient group) were
admitted to Central children hospital, Saint Paul hospital, Thanh Nhan hospital
and 100 healthy children (healthy group) from 01. 09. 2000 to 01.09. 2001.
Results: Among 213 children of the patient group: 53 cases (24,9%) had E.
coli diarrhea with 34 cases (15,9%) had EAEC, 8 cases (3,8%) had EPEC, 4 cases
(1,9%) had EIEC, 1 case (0,5%) had ETEC and among 100 children of the healthy
group: 9 case (9,0%) had E. coli diarrhea with 6 cases (6,0%) had EAEC, 2 cases

(2,0%) had EPEC, 1 case (1,0%) had ETEC. No significant difference of clinical
symptom were found among children who had 5 species E. coli diarrhea.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tiêu chảy do vi khuẩn là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tử
vong cho trẻ em lứa tuổi dưới 5 tuổi. Đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn là
các E. coli gây tiêu chảy, chiếm tỉ lệ khoảng 20 – 30%
(4)
. Dựa vào khả năng gây
tiêu chảy các E. coli được chia thành 5 loại gồm EPEC (Enteropathogenic), ETEC
(Enterotoxigenic), EIEC (Enteroinvasive), EHEC (Enterohaemorrhagic) và EAEC
(Enteroaggregative). Việc định danh các E. coli chủ yếu dựa vào định túp huyết
thanh, tuy nhiên dựa vào kháng nguyên O, H và K các E. coli được phân thành
700 týp huyết thanh nên việc định danh các E. coli gây tiêu chảy khá phức tạp
(6)
.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp Multiplex PCR để
chẩn đoán các E. coli gây tiêu chảy, đây là một phương pháp nhanh và đặc hiệu
nhờ sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho từng loại E. coli
(2,5)
.
Bệnh cảnh lâm sàng mà căn nguyên do 5 loại E. coli thường là:
- EAEC gây nên một sự xâm lấn dai dẳng tại lớp niêm mạc ruột non làm biến
đổi về hình thái tại đây, hậu quả gây nên một tiêu chảy cấp hay kéo dài và dẫn đến tình
trạng kém hấp thu các chất dinh dưỡng ở trẻ.
- EIEC gây nên các tổn thương khu trú có thể là các tổn thương dạng loét
tại niêm mạc đại tràng gây nên hội chứng lỵ ở bệnh nhi.
- ETEC gây bệnh do tác động của hai độc tố ruột của vi khuẩn gây nên một với
tiêu chảy cấp dạng tả với phân nhiều nước, kèm nôn mửa
- EHEC có hai loại gồm các EHEC điển hình (O157: H7) và không điển
hình (EHEC non O157). Các EHEC O157: H7 thường gây tiêu chảy kèm theo

viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu urê huyết cao.
- EPEC tác động vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hóa các vi
nhung mao làm rối loạn quá trình hấp thu nước và điện giải tại đây và gây tiêu
chảy trên trẻ
(3,7)
.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Kỹ thuật này được thực hiện trên 213 mẫu phân của các trẻ bị tiêu chảy
đến khám và điều trị tại 3 bệnh viện là Viện Nhi trung ương, Bệnh viên Saint –
Paul và Thanh nhàn của Thành phố Hà nội. Nhóm chứng được thực hiện trên 100
mẫu phân của trẻ em tại một nhà trẻ của Tp Hà nội. Các mẫu bệnh phảm trên được
tiến hành nuôi cấy trên môi trường Mac Conkey Sorbitol (SMAC), chọn khuẩn lạc
E. coli tách chiết ADN của vi khuẩn ở nhiệt độ 100
0
C/ 20 phút. Các ADN được
tách chiết được trộn chung với các cặp mồi đặc trưng cho 5 loại E. coli để thực
hiện PCR đa mồi (PCR vòng ngoài). Trong bảng sau trình bày các cặp mồi, đoạn
gien đích, kích thước đoạn đặc hiệu của mỗi loại E. coli
Đo
ạn
gen đích
Mồi Vi khuẩn C
ỡ
s
ản phẩm
(bp)
elt B LT l-
r
ETEC 322

est A

ST12
l-r
ETEC 147

Vt 1
VT 1
l-r
EHEC 130

Vt 2 VT2
l-r
EHEC 298

Eae
A
Eae
u-l
EHEC/EPEC

376

Ial
SHIG
1-2
EIEC 320

BfpA

BfpA
u-1
EPEC 367

pCVD

EA
1-2
EAEC 630

Chạy trên máy luân nhiệt theo chương trình: 96
0
C/ 4phút; 30 chu kỳ:
(94
0
C/20 giây, 55
0
C/20 giây và 72
0
C/10giây); 72
0
C/7 phút. Các sản phẩm được
nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và điện di đọc kết quả nếu dương tính
chọn 5 đến 10 khuẩn lạc đại diện ria cấy ra 5 đến 10 vùng khác nhau trên môi
trường SMAC, tách chiết ADN và thực hiện PCR đơn mồi hay đặc hiệu (PCR
vòng trong) với một cặp mồi duy nhất.
KẾT QUẢ
Tổng số 313 mẫu khảo sát với 213 trẻ bị tiêu chảy và 100 trẻ trong nhóm
chứng kết quả được trình bày tại bảng 1
Bảng 1: Sự phân bố của các E. coli gây tiêu chảy

Nhóm b
ệnh
(n=213)
Nhóm
chứng (n = 100)
Các
loại E. coli
S
ố
dương
tính
% S
ố
dương
tính
%

Giá
trị p
ETEC

1 0,5 1 1,0 >
0,05
EPEC

8 3,8 2 2,0 >
0,05
EHEC

6 2,8 0 0 >

0,05
EIEC

4 1,9 0 0 >
0,05
EAEC

34

15,9 6 6,0 <
0,05
Tổng
cộng
53

24,9 9 9,0 <
0,05
Nhận xét:
Trong nhóm bệnh tỉ lệ phân lập của E. coli gây tiêu chảy là 24,9% và trong
nhóm chứng là 9,0 % sự khác biệt giữa hai tỉ lệ này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Trong nhóm bệnh cả 5 loại E. coli đều được phân lập với EAEC chiếm tỉ lệ cao
nhất là 15,9 % tiếp theo là EPEC 3,8 %.
Trong nhom chứng phân lập được 3 loại E. coli là EAEC (6,0), EPEC (2,0)
và ETEC (1,0), tuy nhiên chỉ có tỉ lệ phân lập của EAEC là khác biệt có ý nghĩa
thống kê giữa nhóm bệnh và nhóm chứng (p<0,05).
Bảng 2: Sự phân bố của các E. coli theo tuổi
Từ 0 –
24
tháng (n=183)
Từ 25 –

59
tháng (n =30)
Các
loại E. coli
S
ố
dương
tính
% S
ố
dương
tính
%

Giá
trị p
ETEC

1 0,5 0 0 >0,05

EHEC

6 3,3 0 0 >0,05

EPEC

8 4,4 0 0 >0,05

EIEC

2 1,1 2 6,7 >0,05

EAEC

32

17,5 2 6,7 >0,05

Nhận xét: Trong nhóm trẻ từ 0 đến 24 tháng tuổi phân lập được cả 5 loại E.
coli với EAEC chiếm tỉ lệ cao nhất là 17,5 %, tiếp đến là EPEC (4,4%) và EHEC
(3,3%). Trong nhóm trẻ từ 25 đến 60 tháng tuổi chỉ phân lập được 2 loại E. coli là
EIEC và EAEC vớI tỉ lệ 6,7%, tuy nhiên các khác biệt về tỉ lệ giữa hai nhóm
không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3: Sự liên quan giữa các E. coli gây tiêu chảy với kết quả soi phân trực
tiếp trong cùng một bệnh phẩm.
Bạch cầu Hồng cầu Kén amibe Lo
ại
E. coli

Dươ
ng tính
%

Dươ
ng tính
%

Dươ
ng tính
%

EAE
C (n=34)
11 32,
4
1 2,9

5 14,
7
EPE
C (n=4)
3 37,
5
1 12,
5
1 12,
5
EIE
C (n=7)
3 75,
0
3 75,
0
1 25,
0
Nhận xét: 75% các trường hợp nhiễm EIEC có sự hiển diện của bạch cầu
và hồng cầu trong phân. Các trường hợp nhiễm EAEC có 14,7% có nhiễm kèm
với kén amibe và 32,4% có sự hiện diện của bạch cầu trong phân.
Bảng 4: Sự liên quan giữa các loại E. coli với một số triệu chứng lâm sàng
S

ốt
 37
0

M
ất
nước độ B

Nôn

Kèm
v
ới bệnh
viêm
đư
ờng hô
hấp cấp
Loại
E. coli

Số
ca (%)
Số
ca (%)
Số
ca (%)
Số
ca (%)
EAEC
(n=27)

14
(51,8)
4
(14,8)
14
(51,8)
15
(55,5)
EPEC
(n=7)
4
(57,1)
4
(57,1)
2
(28,5)
3
(42,8)
EHEC
(n=6)
2
(66,6)
2
(66,6)
2
(66,6)
1
(16,6)
Nhận xét: Các triệu chứng lâm sàng trên đều không đặc hiệu cho từng loại
E. coli gây tiêu chảy, tuy nhiêm một điều đáng lưu ý là có trên 50% bệnh nhi bị

nhiễm EAEC có kèm với bệnh viêm đường hô hấp trên.
Bảng 5: Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng E. coli
Nh
ạy
cảm
Trung
gian
Đề
kháng
Kháng sinh
% % %
Chloramphenicol

26,8 0 73,2
Co- trimoxazole

12,2 0 87,7
Nalidixic acid 92,7 0 7,3
Amikacin 97,6 0 2,4
Cefotaxime 82,9 0 17,1
Ciprofloxacin 100 0 0
Nhận xét: Trong bảng 5 cho thấy hai kháng sinh đã bị các chủng E. coli đề
kháng ở mức trên 70% là Chloramphenicol và Co-trimoxazole, tuy nhiên đối với bốn
kháng sinh còn lại vi khuẩn vẫn còn nhạy cảm ở mức trên 80%.
KẾT LUẬN
Từ 213 mẫu bệnh phẩm phân của 213 trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy,
chúng tôi đã phân lập được 53 chủng E. coli gây tiêu chảy chiếm tỉ lệ là 24,9%
trong đó EAEC đóng vai trò quan trọng nhất chiếm tỉ lệ là 15,9%, tiếp theo là
EPEC (3,7%); EHEC (2,8%); EIEC (1,9%) và ETEC là 0,5%.
Đặc biệt các chủng EHEC đã được phân lập là các chủng EHEC non –

O157 nên bệnh cảnh lâm sàng trên bệnh nhi chỉ là các tiêu chảy đơn thuần.
Trong nhóm tiêu chảy gây nên do EAEC có 35,4% trường hợp có tiêu chảy
kéo dài trên hai tuần và trên 50% bệnh nhi bị nhiễm EAEC có kèm với bệnh viêm
đường hô hấp trên. Các trường hợp tiêu chảy do EIEC thường được biểu hiện bằng
một hội chứng lỵ, tuy nhiên các triệu chứng lâm sàng trên bệnh nhi không đặc
trưng cho từng loại E. coli. Các E. coli gây tiêu chảy đã đề kháng với
Chloramphenicol và Co-trimoxazole ở mức trên 70%.