LY TRÍCH VÀ ĐỊNH DANH MALASSEZIA SPP. docx

LY TRÍCH VÀ ĐỊNH DANH MALASSEZIA SPP.

TÓM TẮT
Mục tiêu: Ly trích và định danh Malassezia spp. ở vẩy da của một số người
Việt Nam bệnh lang ben, gàu hoặc da người bình thường theo phân loại mới.
Phương pháp: vẩy da từ bệnh lang ben, gàu và da bình thường của một số
người tình nguyện được thu thập bằng tăm bông vô trùng, sau đó cấy vào môi
trường SDA-S và môi trường m-Dixon trong vòng 24 giờ. Ủ ở 32
o
C từ 48 giờ đến
1 tuần. Chọn những khóm nấm có các đặc điểm của nấm men là có đường kính
khoảng 1 mm, màu kem, trơn bóng để định danh bằng hình ảnh vi nấm học và
phản ứng sinh hóa.
Kết quả: Malassezia furfur chiếm tỉ lệ vượt trội, kế đến là M. sympodialis.
M. globosa và M. restricta chiếm tỉ lệ rất thấp. Đặc biệt có 6 chủng Malassezia
spp. có tính chất lý hóa không phù hợp với các loài trong khóa định danh của
Guillot và cs. nên có thể là những loài mới.
Kết luận: Các kết quả trên chưa phản ánh được tính chất dịch tễ học của
Malassezia spp. nhưng cũng cho thấy phần nào sự phân bố của chi nấm
Malassezia trên da người Việt Nam và các chủng nấm đã ly trích sẽ được sử dụng
để nghiên cứu về mức độ đáp ứng của chúng với các chất kháng nấm.
ABSTRACT
Objectives: isolating, using morphological features and physiological test
to differentiate all isolations.of Malassezia species from some of Vietnamese scabs
who had pityriasis versicolor, dandruff or in normal skin according to new
classification.
Methods: scabs were collected from pytiriasis, dandruff and normal skin of
volunteers by anseptic tampons, then culture in the SDA-S and m- Dixon media in
24 hours, keep in 32
0
C from 48 hours to 1 week. Choosing the clusters which had

yeast characteristics such as it had diameter about 1mm, cream color, smooth to
name based on morphological features and biochimical reactons.
Results: M. furfur was the most prevalent species, following by M.
sympodislis, M. globosa and M. restricta. There were six isolated strains belong to
the Malassezia genus but were clearly distinct from the seven Malassezia species.
These strains should be considered as novel species that have to name by other
methods.
Conclusions: The results are not enough to represent for the distribution of
Malassezia species in Vietnamese but these isolations can be used in studying their
sensibility to antifungal agents
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước đây, Malassezia furfur (Pityrosporum orbiculare) được xem là vi nấm
gây bệnh lang ben và các rối loạn ở da khác như gàu, viêm da tiết bã Từ năm 1996,
nhóm nấm Malassezia được chia thành 7 loài, trong đó 6 loài sống lệ thuộc lipid là M.
furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. sloofiae, M. sympodialis và một loài
sống không lệ thuộc lipid là M. pachydermatis, thường sống ở thú nhưng có khả
nănggây nhiễm khuẩn huyết ở người đặt ống thông và truyền dịch giàu lipid. Hiện nay
vai trò gây bệnh cuả các loài Malassezia spp có thể thay đổi, một số tác giả nhận thấy
M. sympodialis và M. globosa là các loài chiếm ưu thế trên da bệnh lang ben
(3,5)
. Sự
phân bố khác nhau này có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị do đáp ứng với thuốc
kháng nấm ở in vitro khác nhau tùy loài Malassezia.
Việt Nam thuộc nước nhiệt đới nên bệnh lang ben rất thường gặp nhất là ở
người dân lao động. Nấm men gây bệnh lang ben ở cơ địa người Việt Nam chưa được
hiểu rõ nên có thể gặp một số khó khăn trong nghiên cứu thuốc kháng nấm dùng điều
trị như không biết chính xác loài gây bệnh, không có được sự thống nhất hoặc khó so
sánh các kết quả thu được từ những nghiên cứu trên các bệnh liên quan đến nhóm nấm
này. Ly trích và định danh Malassezia spp. ở vẩy da của một số người Việt Nam bệnh
lang ben, gàu hoặc da người bình thường theo phân loại mới, chúng tôi hy vọng giải

quyết một số vấn đề liên quan đến nhóm nấm này như phương pháp ly trích và định
danh, bước đầu khảo sát sự phân bố của Malassezia spp. trên da người Việt Nam, và
các chủng nấm ly trích sẽ được sử dụng trong khảo sát tác dụng của các chất kháng
nấm.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguồn ly trích vi nấm
Vẩy da bệnh lang ben, gàu và da bình thường của một số người tình nguyện
sống ở các địa phương như Bến Tre, TP. HCM, học viên trung học thuộc khoa xét
nghiệm và kỹ thuật y học, y học cổ truyền, kỹ thuật hình ảnh ĐH YD TP. HCM
(2004-2006).
Ly trích vi nấm Malassezia spp.
Lấy mẫu da: vẩy da từ các đối tượng bị bệnh lang ben, gầu, và da bình
thường được lấy vô trùng bằng tăm bông.
Vẩy da sau khi lấy mẫu được cấy ngay vào môi trường SDA-S và môi trường
m-Dixon trong vòng 24 giờ. Ủ ở 32
o
C từ 48 giờ đến 1 tuần. Chọn những khóm nấm có
các đặc điểm của nấm men là có đường kính khoảng 1 mm, màu kem, trơn bóng để xác
định đặc điểm của chi.
Xác định chi Malassezia
Vi nấm ly trích nếu thuộc chi Malassezia sẽ có những đặc điểm sau:
- Thuộc nấm men ở môi trường dùng ly trích.
- Không phát triển trên môi trường SDA trừ M. pachydermatis.
- Quan sát ở kính hiển vi quang học: tế bào men, nẩy chồi trên một cổ rộng
và nẩy chồi ở một cực. Tế bào nấm men hình cầu hay bầu dục, kích thước nhỏ
khoảng 2,0- 6,0 µm x 1,5-4,5 µm.
Xác định loài Malassezia dựa vào phản ứng sinh hóa
Các phản ứng sinh hoá dùng định danh Malassezia spp. gồm: nhiệt độ ảnh
hưởng đến sự phát triển, khả năng đồng hoá Tween khảo sát bằng phương pháp
khuếch tán, phản ứng catalase và sự thuỷ phân esculin. Ngoài ra để phân biệt M.

furfur và các loài Malassezia cần acid béo khác có thể ứng dụng khả năng sử dụng
Cremophor El làm nguồn chất béo cần thiết
(2)
.Từ các phản ứng sinh hóa trên có
thể định danh Malassezia spp. theo khoá phân loại sau:
Bảng 1. Khoá định danh Malassezia spp.
(4)

V
i nấm
S
DA
C
at.
U
.ase 0
oC

T
w.20
T
w.40 w. 60 w. 80
C
re. EL

sc.
M
. furfur
-
+

+
+ +
+
/w
M
.
globosa

-
+
+
-

-

-
M
. obtusa

-
+
+
-

-

-
M
.
pachyde

rmatis
+
+
/-
+
+ +
+
/- /-
M
.
-
-
+
-

-

-
V
i nấm
S
DA
C
at.
U
.ase 0
oC

T
w.20

T
w.40 w. 60 w. 80
C
re. EL

sc.
restricta

M
.
slooffiae

-
+
+
+ +
-
M
.
sympodi
alis
-
+
+
-

+
-
Ghi chú: Cat.: catalase ; U.ase: urease: Tw: Tween; Cre.El: Cremophor EL;
Esc: Esculin; w: phản ứng xảy ra yếu hoặc chậm.

KẾT QUẢ
Kết quả ly trích Malassezia spp. từ vẩy da
Đã ly trích được 75 chủng nấm từ 37 mẫu da lang ben, 17 mẫu da gàu và 21
mẫu da bình thường với các đặc điểm thuộc chi Malassezia như sau:
- Không phát triển ở môi trường SDA.
- Cho khóm nấm màu kem với đường kính khoảng 1mm khi phát triển trên
môi trường SDA bổ sung dầu oliu hoặc môi trường m- Dixon.
- Quan sát ở kính hiển vi: tế bào nấm hình cầu hoặc bầu dục, nẩy chồi 1
cực, kích thước nhỏ khoảng 2,0- 6,0 µm x 1,5-4,5 µm (hình 2).
Kết quả định danh các chủng Malassezia ly trích dựa vào phản ứng
sinh hóa (bảng 2)
Từ kết quả định danh cho thấy:
- M. furfur chiếm tỉ lệ cao trên cả 3 nhóm vẩy da: 57,33% (43/75).
- M. sympodialis chiếm tỉ lệ thấp hơn 26,66% (20/75)
- M. globosa và M. restricta chiếm tỉ lệ rất thấp (4/75 và 2/75).
- Đặc biệt có 6 chủng M2, M3, M5, M12, M13, M24 mang đặc điểm của
chi Malassezia, nhưng khác với đặc điểm của các loài đã được Gueho và cs. mô tả
- Chưa phát hiện được M. obtusa và M. slooffiae.
BÀN LUẬN
Tất cả các chủng nấm ly trích được trên toàn bộ 75 mẫu thuộc cả 3 nhóm
vẩy da người tình nguyện đều không phát triển ở môi trường SDA. ở các môi
trường có bổ sung chất béo cần thiết cho khóm nấm dạng nấm men, ở kính hiển vi
quang học cho tế bào nấm men nẩy chồi ở 1 cực trên một cổ rộng, đây là các đặc
điểm chung của chi Malassezia.
Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa và tên khoa học các chủng Malassezia spp. ly
trích từ vẩy da
Ch
ủng
Vẩy
da

SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M. A
Chứng

- + + + + +
M1 LB - + + + + +
M2 BT - + w

w + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o

C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M3 BT - + w

w + +
M4 LB - + + + + +
M5 LB - + + - + +
M6 LB - + + + + +
M7 LB - + + + + +
M8 LB - + + + + +
M9 LB - + w

- + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C

40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M10 LB - + + + + +
M11 LB - + w

- + +
M12 LB - + w

- + +
M13 LB - + - + + +
M14 LB - + + + + +
M15 LB - + + + + +
M16 LB - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40

o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M17 LB - + + + + +
M18 LB - + - - - -
M19 G - + + - + +
M20 G - + + + + +
M21 G - + + + + +
M22 G - + + - + +
M23 G - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.

40
Tw.
60 80
M24 G - + + - + +
M25 G - + + + + +
M26 G - + + - + +
M27 G - + + - + +
M28 G - + + + + +
M29 G - + + + + +
M30 G - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M31 G - + + + + +
M32 G - + - - - -

M33 LB - + + + + +
M34 BT - + + + + +
M35 BT - + + + + +
M36 BT - + + + + +
M37 BT - + + + + +
M38 G - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M39 G - + + + + +
M40 G - + + + + +
M41 LB - + + + + +
M42 BT - + + + + +
M43 BT - + + + + +
M44 BT - + + - + +

M45 LB - + + - + +
M46 LB - + + - + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M47 LB - + + - + +
M48 LB - + + + + +
M49 LB - + + + + +
M50 LB - + + - + +
M51 LB - + + + + +
M52 LB - + + - + +
M53 LB - + + - + +
Ch
ủng
Vẩy

da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M54 LB - + + - + +
M55 LB - + + + + +
M56 LB - + + - + +
M57 LB - + + - + +
M58 LB - + + - + +
M59 LB - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C

40
o
C
Tw.
20
Tw.
40
Tw.
60 80
M60 LB - + - - - -
M61 LB - + - - - -
M62 LB - + + - + +
M63 LB - + + + + +
M64 BT - + + + + +
M65 BT - + + + + +
M66 BT - + + + + +
M67 BT - + + + + +
Ch
ủng
Vẩy
da
SDA

32
o
C
40
o
C
Tw.

20
Tw.
40
Tw.
60 80
M68 BT - + + + + +
M69 BT - + + + + +
M70 BT - + + + + +
M71 BT - + + + + +
M72 BT - + + - + +
M73 BT - + + - + +
M74 BT - + - - - -
M75 BT - + - - - -
Ghi chú: LB: lang ben; G: gàu; BT: bình thường. SDA: môi trường
Sabouraud, Tw.20: Tween 20, Tw.40: Tween 40, Tw.60: Tween 60, Tw.80:
Tween 80. Cre.EL: Cremophor EL, Cat: catalase, Esc: esculin

Hình 1. Phân bố các loài Malassezia ở các nhóm da


Hình 2. Hình dạng khóm nấm Malassezia trên môi trường m-Dixon. A: M.
globosa ủ ở 32
o
C/72 giờ. B: M. furfur ở 32
o
C/48 giờ
Tất cả các chủng nấm ly trích phát triển tốt ở 32
o
C. M. furfur và M.
sympodialis phát triển được ở 37

o
C đến 40
o
C nhưng chậm hơn ở 32
o
C. M.
restricta và M. globosa không phát triển được ở nhiệt độ từ 37
o
C trở lên, khi ủ ở
32
o
C các chủng nấm này cũng phát triển chậm hơn M. furfur, phải từ 72 giờ trở
lên đường kính khóm nấm mới đạt đường kính khoảng 1 mm.
Hình dạng và kích thước của tế bào men ở kính hiển vi quang học của các
chủng tuy có sự khác biệt nhỏ như M. globosa tế bào men hình cầu, trong khi các
loài còn lại có tế bào men từ bầu dục đến hình trụ. M. sympodialis thỉnh thoảng
gặp dạng 2 tế bào chồi phát triển trên 1 tế bào mẹ, tuy nhiên các đặc điểm này rất
khó nhận ra, vì vậy đây không phải là đặc điểm quan trọng trong phân loại.

M. furfur
ATCC 44344
M. furfur M7 Malassezia
sp.
M24


M. globosa M. sympodialis M9
M60
Hình 3: Hình thể tế bào Malassezia spp. ở kính hiển vi quang học (x 100)
Các đặc điểm còn lại như sinh men catalase, khả năng đồng hóa các loại

Tween và Cremophore EL rất rõ rệt, giúp việc định danh dễ dàng. Riêng phản ứng
thủy phân esculin giúp phân biệt M. furfur và M. sympodialis xảy ra nhanh và rõ
rệt khi các chủng nấm được ly trích mới, chưa qua quá trình cấy chuyển nhiều lần.
Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy M. furfur và M. sympodialis là 2 loài phổ
biến hiện diện trên da người bình thường cũng như ở da người bệnh lang ben và
gàu ở một số người Việt Nam tình nguyện. M. globosa và M. restricta chiếm tỉ lệ
thấp trong các đối tượng nghiên cứu. Trong 75 mẫu thu thập được, không tìm thấy
sự hiện diện của M. obtusa, M. slooffiae. 8% còn lại rơi vào các loài Malassezia lạ,
các chủng này tuy có đặc tính sinh hoá của chi Malassezia nhưng không trùng hợp
đặc điểm với các loài có trong khóa phân loại. Ðây có thể là những loài mới nhưng
với những phương tiện và kỹ thuật hiện có, chúng tôi chưa thể định danh chúng
đến mức loài.
Nghiên cứu về sự phân bố các loài Malassezia theo phân lọai chính thức
năm 1996 chưa được thực hiện nhiều. Các kết quả khảo sát về sự phân bố
Malassezia spp. ở da người trong những năm gần đây có sự thay đổi theo quốc
gia. Thí dụ Bita Tarazooie và cộng sự, đã ly trích và định danh các vi nấm từ da
một số người sống ở Iran bị bệnh lang ben và da người bình thường, vào năm
2003, theo phương pháp sinh hóa, kết quả định danh cho thấy M. globosa chiếm tỉ
lệ cao nhất
(2)
. Trong khi Kindo AJ và cộng sự, xác định được M. sympodialis
chiếm đa số trên da người bình thường ở miền nam Ấn Độ, kết quả này giống với
các nghiên cứu khác ở Canada, Nga và Thụy Điển trên người bị viêm da dị ứng và
cả trên người bình thường
(5)
. So với các công bố trên, kết quả định danh nhận
được từ 3 nhóm vẩy da của một số người Việt Nam tình nguyện có khác biệt: M.
furfur chiếm tỉ lệ cao nhất kế đến là M. sympodialis. Tuy nhiên so với da bình
thường, tỉ lệ M. sympodialis ở da bệnh lang ben cao hơn rõ rệt.
Bảng 3. So sánh sự phân bố các loài Malassezia ở một số nước trên thế giới

Tỉ lệ Malassezia spp. ở da người (%)
Việt Nam Iran (1)
Ấn Độ (
Reference source not
found.)
Lang
ben
(n =
37)
Gàu
(n
=
17)
Bình
thường
(n =
21)
Lang
ben
(n=75)

Bình
thường
(n =
22)
Lang
ben

(n =
60)

M. furfur
48,64%
(18/37)
64,7%
(11/17)
66,66%
(14/21)
25,3
66,66

23,3
M.
sympodialis
35,13%
(13/37)
23,52%
(4/17)
14,28%
(3/21)
9,3
14,28

25
M. globosa

5,4 0 9,52 53,3 9,52
41,7
M. restrista

2,7 5,88 0 0 0

3,3
M. obtusa 0 0 0 8,1 8,1 0

M.
slooffiae
0 0 0 4 4
6,7
Malassezia.
spp
8,1 5,88 9,52 0 0 0


n: cỡ mẫu
KẾT LUẬN
Qua phân lập và định danh 75 chủng nấm ly trích từ vẩy da bệnh lang ben,
gàu và da bình thường của người Việt Nam tình nguyện, bước đầu chúng tôi nhận
thấy M. furfur là loài trội nhất, kế đến là M. sympodialis. M. globosa và M.
restricta chiếm tỉ lệ thấp. Chưa phát hiện được M. obtusa, M. slooffiae và M.
pachydermatis. 6 chủng chưa định danh được do đặc tính sinh hoá khác với những
loài thuộc khoá phân loại mới, vì vậy có thể đây là những loài mới mà chúng tôi
chưa đủ điều kiện để định danh.
Do cỡ mẫu nghiên cứu còn giới hạn, các kết quả thu được chưa phản ánh
được về mặt dịch tể học, nhưng đây là những thông tin mới về sự phân bố của các
loài Malassezia spp. ở người Việt Nam mà cho đến nay vẫn chưa được các nhà
lâm sàng và vi nấm học ở nước ta quan tâm nghiên cứu.