Bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP (Phần phụ)

LỜI CẢM ƠN
Tất cả những gì con có được ngày hôm nay và sẽ có được trong tương lai
đều bắt nguồn từ công lao sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ - những người chỉ
vì con mà đã phải chịu bao vất vả, gian nan. Con xin thành kính ghi khắc trong
lòng con trọn đời công ơn cha mẹ để trên đường đời con luôn sống tốt và có ý
nghĩa hơn như những gì mà cha mẹ đã dạy dỗ. Anh hai cũng gửi lời cảm ơn đến
hai em gái đã lo lắng và giúp đỡ anh trong suốt quá trình làm đề tài tốt nghiệp.
Em xin chân thành gửi lòng biết ơn đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
 Ban Giám Đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, Trường
Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
 Ban Chủ nhiệm và các Thầy – Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
cô Trần Thị Dung – Chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh học và cô Trần Thị
Kim Linh – Chủ nhiệm lớp Công Nghệ Sinh Học 27.
Đã chăm lo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học
tập tại Trường và trong suốt thời gian hoàn thành đề tài.
Em xin trân trọng biết ơn đến:
 Thầy TS. Bùi Minh Trí – giáo viên hướng dẫn đề tài.

Các anh chị: chị Liên, chị Huệ, chị Hưng, anh Thế, chị Phương, chị
Hà, anh Toàn ở TT Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh – Trường ĐH Nông Lâm
Tp.HCM.
Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá
luận tốt nghiệp.
iii
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến những người nông dân tại tỉnh Bà Rịa –
Vũng Tàu đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện điều tra và thu thập
mẫu lá điều.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn cùng lớp với tôi đã
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường và thời gian làm đề tài tốt

nghiệp. Chúc các bạn đạt được những điều mà mình ước mơ.
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
Nguyễn Quỳnh Anh
iv
TÓM TẮT
NGUYỄN QUỲNH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005,
“BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ
ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ
THUẬT RAPD VÀ AFLP”.
Giảng viên hướng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ.
Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu và
tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh, trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là cây điều hiện đang được trồng tại tỉnh Bà Rịa
– Vũng Tàu. Cây điều là một loại cây công nghiệp quan trọng của Việt Nam. Để có thể
đề ra một chiến lược phát triển cây điều lâu dài đem lại lợi ích kinh tế cao, phải có
những chương trình bảo tồn, phổ biến những giống điều tốt, thích nghi trên diện rộng và
lai tạo những giống điều có chất lượng ưu việt so với các giống hiện có. Muốn vậy
trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có.
Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RAPD và AFLP để bước đầu đánh giá mức độ đa
dạng di truyền của quần thể điều đang được canh tác trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng
Tàu.
Các kết quả đạt được:
 Thu thập được 80 mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật (về
năng suất, đặc điểm thực vật học,…) trên địa bàn toàn tỉnh.
 Thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá, kết quả thu được 50 mẫu DNA có chất
lượng đạt yêu cầu để thực hiện kỹ thuật RAPD.
 Thực hiện phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 với 50 mẫu DNA, kết
quả có 41 mẫu thực hiện thành công. Nhận diện được 11 band, trong đó có 3 band đồng
hình và 8 band đa hình. Những band đồng hình có độ dài khoảng 550 base pairs, 900

base pairs và 1050 base pairs có thể là những band đặc trưng của cây điều khi thực hiện
phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11. Những band đa hình có độ dài khoảng 600
v
base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 1.200 base pairs, 1.400 base pairs, 1.600 base
pairs, 1.900 base pairs và 2.300 base pairs, trong đó band 600 base pairs và 700 base
pairs khá đặc biệt, có thể được nghiên cứu thêm và sử dụng như là chỉ thị phân tử của
những tính trạng đáng quan tâm. Qua kỹ thuật RAPD đánh giá tính đa dạng di truyền
của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình.
 Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên DNA lá điều, chúng tôi
chọn được 4 tổ hợp primer phù hợp:
- MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG
(Green) cho 36 band, trong đó có 1 band đồng hình và 35 band đa
hình. Chúng tôi nhận thấy có 7 band có thể là chỉ thị phân tử.
- MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG
(Green) cho 14 band, trong đó có 1 band đồng hình và 13 band đa
hình. Có 2 band có thể là chỉ thị phân tử.
vi
MỤC LỤC
Nội dung Trang
Trang tựa .....................................................................................................................ii
Lời cảm ơn ..................................................................................................................iii
Tóm tắt .....................................................................................................................v
Mục lục vii
Danh sách các từ viết tắt............................................................................................xiii
Danh sách các bảng ................................................................................................... xv
Danh sách các hình....................................................................................................xvii
Chương 1: GIỚI THIỆU......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu............................................................................................ 2
1.2.1. Mục tiêu................................................................................................... 2

1.2.2. Yêu cầu.................................................................................................... 2
1.3. Hạn chế của đề tài............................................................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 4
2.1. Giới thiệu chung về cây điều............................................................................... 4
2.1.1. Nguồn gốc cây điều................................................................................. 4
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây điều........................................................ 4
2.1.2.1. Thân và cành cây.............................................................................. 4
2.1.2.2. Hệ rễ................................................................................................ 4
2.1.2.3. Lá..................................................................................................... 5
2.1.2.4. Hoa và quả điều................................................................................ 5
vii
2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều.............................................................. 6
2.1.3.1. Khí hậu............................................................................................. 6
2.1.3.2. Đất đai.............................................................................................. 7
2.1.3.3. Mật độ trồng..................................................................................... 7
2.1.4. Giống điều và các phương pháp nhân giống........................................... 7
2.1.4.1. Đặc điểm thực vật học của các giống điều...................................... 7
2.1.4.2. Phương pháp nhân giống cây điều................................................... 8
2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới....................................................................... 8
2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam....................................................................... 10
2.1.7. Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu....................... 14
2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền
và phát hiện chỉ thị phân tử........................................................................................ 15
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử................ 15
2.2.1.1. Chỉ thị hình thái................................................................................ 16
2.2.1.2. Chỉ thị allozyme............................................................................... 16
2.2.1.3. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA.......................................................... 16
2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)............ 17
2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)............. 17
2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites)................................................ 17

2.2.5. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)................... 18
2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA....................... 18
2.2.6.1. Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD................................................. 19
2.2.6.2. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD................................................ 22
viii
2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD................................................. 22
2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD......................................................... 22
2.2.7. Kỹ thuật AFLP........................................................................................ 23
2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP................................................................ 23
2.2.7.2. Các bước của kỹ thuật AFLP........................................................... 24
2.2.7.3. Những ưu điểm của kỹ thuật AFLP................................................. 27
2.2.7.4. Những hạn chế của kỹ thuật AFLP.................................................. 27
2.2.7.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD......................................................... 27
2.2.8. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng
di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử...................................................... 28
2.2.9. Kỹ thuật PCR........................................................................................... 28
2.2.9.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR............................................................ 28
2.2.9.2. Quy trình chuẩn của phản ứng PCR................................................. 30
2.2.9.3. Tối ưu hoá phản ứng PCR................................................................ 31
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 33
3.1 Vật liệu................................................................................................................. 33
3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................... 33
3.1.1.1. Nguyên liệu...................................................................................... 33
3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................... 33
3.1.2. Hóa chất cần thiết.................................................................................... 33
3.1.2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều................... 33
3.1.2.2. Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD...................................... 35
3.1.2.3. Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP................................................... 35
ix