XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE (Mục lục)

MỤC LỤC

CHƯƠNG
TRANG
Lời cảm tạ..................................................................................................................iii
Tóm tắt........................................................................................................................iv
Mục lục.......................................................................................................................v
Danh sách các chữ viết tắt..........................................................................................viii
Danh sách các hình.....................................................................................................ix
Danh sách các bảng.....................................................................................................x
1. MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề ......................................................................................................2
1.2.Mục đích yêu cầu............................................................................................ 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................................3
2.1. Giới thiệu tổng quan về cây cacao ................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc cây cacao.............................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái.................................................................................3
2.1.3.Yêu cầu sinh thái....................................................................................5
2.1.4. Các giống cacao ....................................................................................5
2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài.................6
2.2. Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật .......................................................6
2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR............................................................................8
2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR ...............................................................8
2.3.2. Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .......................................10
2.3.2.1. DNA mẫu................................................................................10
2.3.2.2. Taq polymerase ......................................................................10
2.3.2.3. Primer .....................................................................................11
2.3.2.4. Nhiệt độ bắt cặp.......................................................................13
2.3.2.5. Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu ................................................14
v
2.3.2.6. Các thành phần khác................................................................14

2.3.2.7. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR ............................................. 15
2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR ............................... 15
2.3.3. Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết....... 16
2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR ....................................................... 17
2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA...................................... 19
2.5. Giới thiệu về Microsatellite ........................................................................... 20
2.5.1. Khái niệm về Microsatellite .................................................................. 20
2.5.2. Các loại Microsatellite .......................................................................... 20
2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite .......................................................... 21
2.5.4. Vai trò của Microsatellite ..................................................................... 22
2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite ........................................... 24
vi
2.5.5.1.Phương pháp lai...............................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................

...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................
...........................................................................................................................24
vii

2.5.5.2.Phương pháp PCR............................................................................24
2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR........................... 25
2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài................. 27
2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite .......................................................... 28
2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ các phương pháp
khác ................................................................................................................. 29
2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite ................................... 30
2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan......................................................... 31
2.6.1. Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao bằng
Microsatellite marker....................................................................................... 31
2.6.2. Nghiên cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng
Microsatellite marker...................................................................................... 32
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 35
3.1. Vật liệu....................................................................................................... 35
3.1.1. Các giống cacao thí nghiệm .................................................................. 35
3.1.2. Hóa chất thí nghiệm............................................................................... 37
3.1.2.1. Primer ..................................................................................... 37
3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA.................................... 38
3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR.................................. 38
3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự.............................. 38
3.1.3. Thiết bị thí nghiệm..................................................................................39
3.2. Phương pháp ................................................................................................ 39
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 39
3.2.2. Bố trí thí nghiệm.................................................................................... 39
3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA........................................................................... 41
3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA................................................ 42
3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di.............................. 42
3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ kế.........................................42
3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite ......................................................... 42
3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer............................................. 42

3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer.............................. 43
3.2.6.Điện di sản phẩm PCR.......................................................................... 45
viii
3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA................ 45
3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus................................... 46
3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm
Genetix
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................................. 50
4.1.Sản phẩm DNA li trích.................................................................................... 50
4.2.Sản phẩm PCR................................................................................................ 51
4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao........................................ 52
4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa........................................................ 55
4.5. So sánh dữ liệu microsatellite .................................................................................. 58
4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR................................................................... 59
4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền....................................................... 61
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................... 63
6. PHỤ LỤC.............................................................................................................. 65
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 83
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 µg: microgram
 µl: microlite
 µM: micromol/lite
 Al: Allele
 bp: base pair
 CT: Cần Thơ
 CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide
 DNA: Deoxyribonucleic acid
 dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
ix