CHẨN ĐOÁN BỆNH DO TRICHINELLA SPIRALIS Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM BẰNG KỸ THUẬT ELISA pdf

CHẨN ĐOÁN BỆNH DO TRICHINELLA SPIRALIS
Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM BẰNG KỸ THUẬT ELISA

TÓM TẮT: Mục tiêu: Nghiên cứu đáp ứng kháng thể đối với nhiễm
Trichinella spiralis ở chuột thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu: Huyết thanh của 26 chuột thí nghiệm được
thu thập vào ngày thứ 23 và ngày thứ 57 sau khi gây nhiễm Trichinella
spiralis và được xét nghiệm để tìm kháng thể Trichinella spiralis bằng kỹ
thuật ELISA, sử dụng cộng hợp kháng chuột IgG. Kháng nguyên thô được
điều chế từ ấu trùng giai đọan 1 của Trichinella spiralis gây nhiễm ở chuột
phòng thí nghiệm. Huyết thanh của 23 chuột bình thường được sử dụng để
làm đối chứng và được xét nghiệm cùng phương pháp.
Kết quả và kết luận: Kết quả cho thấy tỷ lệ phần trăm dương tính đối
với huyết thanh ở ngày thứ 23e là 57,7%, thấp hơn huyết thanh ở ngày thứ
57 e- là 84,6%. Độ nhạy, độ đặc hiệu, giátrị tiên đóan dương, giá trị tiên
đóan âm và tỷ lệ nhiễm của IgG – ELISA lần lượt là 84,6 %, 100%, 100%,
85,18% và 53,06%, khi sử dụng ngưỡng dương tính là 0,031 (X ± 2SD). Trị
số ELISA đo bằng mật độ quang đối với huyết thanh thu thập ở ngày23e- và
ngày 57 e- ở chuột gây nhiễm cao hơn có ý nghĩa thống kê so với ở nhóm
chứng với p<0,005(dùng t – test).
ABSTRACT
ELISA OF TRICHINOSIS IN LABORATORY MICE
Tran Thi Hong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 – Supplement of
No 1 - 2007: 459 – 464
Objective: Study antibody responses against T. spiralis infection in
laboratoty mice.
Methods: The Trichinosis sera were collected from 26 Trichinella
spiralis infected laboratory mice on 23 and 57 days after infection and tested
for IgG antibody by ELISA using anti- mouse IgG horseradish peroxidase
conjugate. Crude somatic antigen was prepared from infected first stage
larva(L1) of Trichinella spiralis alrealdy maitained in the laboratory mice.

Twenty – three normal control sera were also collected from noninfected
mice and tested by the same method. The results revealed that percent
positivity of 23 days sera (57.5%) was lower than 57 days sera (84.6%).
Results and conclusion: The sensitivity, specificity, positive, negative
predictive value and prevalence rate of IgG – ELISA were 84.6%, 100%,
100%, 85.18% and 53.06%, respectively, when the cut – off value equal to
0.031 (X ± 2SD) was used. The ELISA value (or optical density) of
trichinosis sera (both on 23 and 57 days sera) were significantly higher than
those of the normal control sera at p – value <0.005 (by using t- test)

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh do Trichinella spiralis ở người thường do ăn các món chế biến
từ thịt heo sống hay nấu không kỹ. Bệnh nhân có các triệu chứng như tiêu
chảy, sốt, phù mí mắt và đau cơ do sự di chuyển của KST ở ruột và ở cơ. Ấu
trùng giai đọan đóng kén trong cơ khi ăn vào sẽ xuất nang trong ruột non và
phát triển thành giun đực và cái trưởng thành, giun cái đẻ ra ấu trùng sơ sinh,
ấu trùng này sẽ đi theo đường máu , theo đường đại tuần hòan và đóng kén
trong các mô cơ(1).
Bệnh do Trichinella spiralis được báo cáo đầu tiên bởi Hansen(3) năm
1924, là một người châu Âu đến sống ở vùng hoang dại ở miền bắc Thái
Lan. Năm 1962, có một ổ dịch Trichinella spiralis bùng phát lần đầu tiên ở
Mae Sariang, miền Bắc Thái Lan, có 56 người mắc và có 11 người tử vong,
và người ta đã tìm thấy Trichinella spiralis trong các bắp cơ của những
người này và 5 trong 36 con heo của những người dân trong một bộ lạc của
một làng cách xa nhà của những người này cũng đã tìm thấy có ấu trùng
Trichinella spiralis. Ở Thái Lan, từ năm 1962 đến năm 1988 có 70 dịch
Trichinella spiralis bùng phát, đến nay bệnh do Trichinella spiralis vẫn còn
là vấn đề ảnh hưởng đến sức khỏe công cộng của nhiều nước như Thái Lan,
Việt Nam
Bệnh do Trichinella spiralis được chẩn đóan trực tiếp bằng sinh thiết

cơ, và gián tiếp bằng kỹ thuật miễn dịch(1,4, 6).
Kỹ thuật nhạy nhất của huyết thanh miễn dịch là ELISA, sử dụng kỹ
thuật này được đánh giá bởi nhiều nhà nghiên cứu. Huyết thanh của bệnh
nhân được thu thập ở ngày 23e- và ngày 57 e-sau khi ăn thịt heo sống bị
nhiễm Trichinella spiralis được phát hiện kháng thể IgG, kết quả dương tính
100% ở ngày 57 e-, trong khi ở ngày 23 e- chỉ dương tính 5,5%. Trong
nghiên cứu này, chuột phòng thí nghiệm được gây nhiễm Trichinella
spiralis, được sử dụng làm nguồn cung cấp huyết thanh và kháng nguyên thô
được điều chế từ ấu trùng giai đoạn 1 của Trichinella spiralis ở chuột gây
nhiễm.
Mục tiêu
Tổng quát
Nghiên cứu đáp ứng kháng thể đối với nhiễm Trichinella spiralis ở
chuột thí nghiệm.
Chuyên biệt
- So sánh đáp ứng hiệu giákháng thể huyết thanh chuột ở ngày23e- và
ngày57 e- với huyết thanh chuột bình thường.
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên
đoán âm và tỷ lệ nhiễm chung đối với IgG – ELISA, sử dụng kháng nguyên
thô Trichinella spiralis
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Gây nhiễm ấu trùng Trichinella spiralis ở chuột: Chuột gây nhiễm ở
phòng thí nghiệm được làm tiêu mô cơ bằng 1% pepsin – 1% HCl, sau đó
thu thập ấu trùng gây nhiễm. Mỗi chuột được gây nhiễm 350 ấu trùng. Có 26
chuột được gây nhiễm trong thí nghiệm này.
- Mẫu huyết thanh chuột được thu thập chia 2 nhóm:
Nhóm 1: thu thập huyết thanh ở ngày thứ 23 e- (Ia) và ngày thứ 57 e-
(Ib) của 26 chuột được gây nhiễm
Nhóm 2: thu thập huyết thanh ở 23 chuột khỏe mạnh làm nhóm

chứng.
Tất cả các mẫu huyết thanh được giữ ở -200 C
- Chuẩn bị kháng nguyên
Kháng nguyên được điều chế từ ấu trùng nằm trong nang ở các thớ cơ
của chuột bị nhiễm, sau khi thu thập ấu trùng được nghiền, tán bằng siêu âm,
thẩm phân và ly tâm (2000g ở 4 0C trong 30 phút), sau đó đông khô, đo hàm
lượng protein bằng phương pháp Lowry(5).
Phương pháp
Kỹ thuật được thực hiện như sau:
- Gắn kháng nguyên vào plaque nhựa Greiner, mỗi giếng 100µl với
nồng độ 5µg/ml.
- Ủ 370C trong 1 giờ, sau đó để 40C, trong 18 giờ.
- Rửa 3 lần (10 phút/ mỗi lần) với dung dịch PBS 0,01M, pH 7,4 chứa
0,05% Tween 20 (PBS-T), sau đó cho vào 200µl BSA 0,05% pha trong
0,01M PBS pH 7,4), ủ 370C trong 1 giờ, sau đó rửa 3 lần với PBS – T như
trên. Thêm vào mỗi giếng 100 µl huyết thanh chuột đã được pha loãng 1:200
trong 0,2% BSA và 0,2% gelatin trong 0,01 M PBS pH 7,4. Ủ 370C trong 1
giờ; rửa plaque 3 lần như trên. Cho vào mỗi giếng100 µl cộng hợp thỏ kháng
chuột Immunoglobulin G (Sigma ImmunoChemicals A-3673). Ủ 370C trong
1 giờ, sau khi rửa 5 lần như trên, cho vào mỗi giếng 100 µl cơ chất citrate
paraphenylenediamine dihydrochloride peroxide, phản ứng xảy ra ở 260C
trong vòng 30 phút trong phòng tối. Cho vào mỗi giếng 50 µl dung dịch 1N
NaOH để ngừng phản ứng, đo mật độ quang ở độ dài sóng 492nm bằng máy
đọc ELISA (Titertek Mulkistans Plus Mk II).
Xử lý số liệu bằng chương trình EPI – INFO và SPSS
- Thống kê mô tả được tính bằng:
+ Tính trung bình cộng và độ lệch chuẩn của mật độ quang 23 mẫu
huyết thanh chuột bình thường ở nhóm chứng và 26 chuột gây nhiễm
Trichinella spiralis.
+ Tìm điểm cắt của trị số IgG- ELISA để xác định tỷ lệ dương tính và

âm tính ở 26 chuột gây nhiễm.
+ Tính độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đóan dương và giá trị tiên
đoán âm của IgG – ELISA bằng phép tính Galen (1) và tỷ lệ nhiễm chung.
- Thống kê phân tích: Dùng Student t – test để xem có sự khác biệt
giữa 2 nhóm về trị số mật độ quang của test ELISA hay không?
KẾT QUẢ
Trị số IgG ELISA của 2 nhóm chuột đáp ứng đối với kháng nguyên từ
AT giai đọan 1 của Trichinella spiralis
Hình 1: Trị số mật độ quang từ huyết thanh của chuột nhiễm 350 AT
Trichinella spiralis, thu thập ở ngày 23e-(Ia) và 57 e-(Ib) sau nhiễm và nhóm
chứng(II)
Bảng 1a: trị số mật độ quang của huyết thanh chuột gây nhiễm 350 ấu
trùng Trichinella spiralis (nhóm Ia và Ib) và nhóm chứng(nhóm II)
Chuột số

Trị số mật độ quang của nhóm chuột
Nhiễm Trichinella spiralis


Ia

Ib

Chứng(II)
1
2
3
4
5
6

7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

0.136
0.118
0.130
0.130
0.103
0.012
0.096
0.010
0.064

0.034
0.036
0.019
0.031
0.022
0.018
0.183
0.014
0.019
0.011
0.086
0.047
0.007
0.047
0.019
0.037
0.025

0.210
0.020
0.230
0.194
0.155
0.013
0.204
0.285
0.108
0.240
0.208
0.169

0.013
0.045
0.024
0.08
0.045
0.320
0.147
0.132
0.320
0.210
0.275
0.327
0.278
0.290

0.010
0.002
0.0015
0.0065
0.005
0.027
0.028
0.0025
0.018
0.0115
0.008
0.003
0.004
0.014
0.0075

0.0065
0.021
0.005
0.003
0.0075
0.022
0.004
0.0115
Trung bình (X) 0.052 0.174 0.011
Độ lệch chuẩn 0.047 0.104 0.01
Trị số của IgG ELISA của 2 nhóm chuột đối với kháng nguyên từ AT
giai đọan 1 của Trichinella spiralis được trình bày trong bảng 1a. Trị số
trung bình cộng (X) của nhóm I (Ia và Ib) và nhóm II là 0.052, 0.174 và
0.011. Trung bình cộng của nhóm I (Ia và Ib) cao hơn có ý nghĩa thống kê so
với nhóm chứng (nhóm II) ở p<0.005 (bảng 1b).
Bảng 1b: Sự khác biệt giữa trung bình cộng trị số mật độ quang của
nhóm I(Ia và Ib) và nhóm II (nhóm chứng).
Nhóm chuột

n

Trung bình cộng

Độ lệch chuẩn

Sự khác biệt
Ia
II

26

23

0.052
0.011

0.047
0.01

t=4.2
df=47
p<0.005
Ib
II

26
23

0.174
0.011

0.104
0.01

t=8.15
df=47
p<0.005
Ib
Ia

26

26

0.174
0.052

0.104
0.01

t=5,54
df=50
p<0,005
df=degree of freedom (độ tự do)
Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đóan dương, giá trị tiên đóa âm và tỷ
lệ nhiễm chung
Độ nhạy
Huyết thanh thu thập ở ngày 57 e-được dùng để tính độ nhạy, trị số
điểm cắt ở ngưỡng dương tính là X + 2SD ở nhóm chứng là 0.031. Ở
ngưỡng này, có 22 trong tổng số 26 ca dương tính, chiếm tỷ lệ 86,4% (22 ca
dương tính thật, 4 ca dương tính giả), không có ca nào ở nhóm II dương tính
(tất cả 23 ca đều âm tính thật). Độ nhạy của test là 84,6%(bảng 2).
Độ đặc hiệu
Huyết thanh ở nhóm chuột không gây nhiễm được dùng để tính độ
đặc hiệu. Không có ca dương tính giả trong nhóm II. Độ đặc hiệu
100%(bảng 3).
- Độ nhạy, độ đặc hiệu của test đối với kháng nguyên được điều chế
từ AT giai đọan 1 của Trichinella spiralis với trị số điểm cắt X + 2SD được
trình bày ở hình 1. Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đóan dương, giá trị tiên
đoán âm và tỷ lệ nhiễm chung là 84,6%, 100%, 100%, 85,18 và 53,06%
(bảng 3).
Bảng 2: Số dương tính và âm tính của trị số IgG ELISA ở huyết thanh

chuột nhóm I (Ia và Ib: gây nhiễm Trichinella spiralis ) và nhóm II (nhóm
chứng).
Điểm cắt trị số mật độ quang

Số dương tính và âm tính của chuột nhóm
I

II
Ia(n=26)

% dương tính

Ib(n=26)

% dương tính

n=23
+ -

+ -

+ -
0.031(X+2SD)

15 11

57,7

22 4

84,6

0 23
Bảng 3: Phần trăm độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đóan dương, giá
trị tiên đóan âm và tỷ lệ nhiễm chung của trị số IgG – ELISA nhóm gây
nhiễm, trích từ huyết thanh chuột ở ngày 57 e-(nhóm Ib), với trị số điểm cắt
ở X+2SD
Nhóm Ib
Độ nhạy

84,6
Độ đặc hiệu

100
Giá trị tiên đóan dương

100
Giá trị tiên đóan âm

85,18
Tỷ lệ nhiễm chung

53,06
BÀN LUẬN
Ở bảng 2 và bảng 3 cho thấy phần trăm dương tính hay độ nhạy của
huyết thanh thu thập ở ngày 23e-(Ia) và 57 e-(Ib) sau nhiễm là 57,7% và
84,6%. Tuy nhiên, độ đặc hiệu và giá trị tiên đóan dương của huyết thanh
thu thập ở ngày 23e-(Ia) và 57 e-(Ib) sau nhiễm là 100%, trong khi giá trị
tiên đóan âm vàtỷ lệ nhiễm chung của huyết thanh thu thập ở ngày 23e-(Ia)
và 57 e-(Ib) sau nhiễm là67,4%; 85,18% và 53,6%.

Từ bảng 2 và bảng 3 có thể giải thích rằng phần trăm dương tính ở
ngày 23e- sau nhiễm rất thấp, trong khi phần trăm dương tính cao hơn ở
ngày 57 e- là 84, 6%, điều này chứng tỏ hiệu giá kháng thể ở ngày 23e- sau
nhiễm vẫn còn thấp, đó là thời gian không thích hợp cho chẩn đóan miễn
dịch bệnh do Trichinella spiralis, trong khi ở ngày 57 e- thì tốt hơn (phần
trăm dương tính cao hơn). Vấn đề đặt ra là sẽ xảy ra các phản ứng âm tính
giả nếu như việc phát hiện kháng thể luân lưu IgG quá sớm trong chẩn đoán
miễn dịch. Những phản ứng này có thể gây ra bởi những yếu tố như không
có hay có ở ngưỡng quá thấp kháng thể IgG liên hệ với số lượng ấu trùng bị
nhiễm hay sự đáp ứng của cơ thể ký chủ. Nguyên nhân nữa có thể là khoảng
cách giữa thời kỳ ký sinh trùng ký sinh ở mô cơ và sự đáp ứng kháng thể của
ký chủ.
Các nghiên cứu trước đây về bệnh do Trichinella spiralis ở người,
dùng kháng nguyên thô và kháng nguyên ngoại tiết – phân tiết bằng kỹ thuật
ELISA, cho thấy huyết thanh ở ngày 23e- luôn cho kết quả dương tính thấp
hơn ở ngày 57 e- (100%). Độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên
đoán âm sẽ tốt nhất nếu như trong thử nghiệm này chúng ta sử dụng thêm
huyết thanh của nhóm 3, là nhóm có các bệnh do KST khác. Tuy nhiên, trị
số của điểm cắt thấp (0.031) đến nổi huyết thanh nên được thu thập ở các
ngày xa hơn, thí dụ ở các ngày 120e-, 200e- sau khi nhiễm để hy vọng có
phần trăm dương tính cao hơn.
Nghiên cứu này thử dùng thú phòng thí nghiệm cho mô hình chẩn
đoán miễn dịch bệnh do Trichinella spiralis ở người, bằng cách dùng huyết
thanh chuột thay vì huyết thanh người, mà huyết thanh người đôi khi không
thể thu thập được một cách dễ dàng hay trong trường hợp kháng nguyên hay
KST được tìm thấy trong mô cơ của bệnh nhân.
Tuy nhiên, hiện nay không thể kết luận rằng mô hình ở thú có thể
dùng để chẩn đóan miễn dịch. Sự thu thập huyết thanh ở những ngày xa hơn
nên được nghiên cứu thêm
KẾT LUẬN

- Trị số điểm cắt của ELISA chẩn đoán bệnh do Trichinella spiralis ở
chuột thí nghiệm là 0.031.
- Chúng ta dùng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể đối với huyết
thanh chuột gây nhiễm thực nghiệm Trichinella spiralis ở ngày 57 e- tốt hơn
huyết thanh thu thập ở ngày 23e- sau khi nhiễm.