Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quy trì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER
MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO
SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA
(Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT
ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN
TOBACCO MOSAIC VIRUS
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR






Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2001-2005
Sinh viên thực hiện : LÂM NGỌC HẠNH


Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







BÁO CÁO TÓM TẮT



ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS
(CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS
VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA
(Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT
ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÂM NGỌC HẠNH





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005


iii
LỜI CẢM TẠ


Tôi xin chân thành cảm tạ:
Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và
làm luận văn.
Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô trong bộ
môn.
PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Đinh Duy Kháng, TS. Bùi Minh Trí, TS. Lê Đình
Đôn, anh Nguyễn Đức Toàn đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích.
Anh Nguyễn Văn Sơn cùng các anh chị trong Chi Cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm

Đồng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.
Chú Nguyễn Văn Sang và các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đơn
Dƣơng, anh Nguyễn Tấn Ngọc cùng các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đức
Trọng đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn tôi.
Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông
Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn.
Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó,
góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua.


iv
TÓM TẮT

Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình
trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato
Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ
thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic
Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng
và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng
3/2005 đến tháng 8/2005.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính.
1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra
sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng
và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên
cứu.
2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng
phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là
những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus
để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu
đang nghiên cứu hay không.

3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng
quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng
thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn.
Kết quả thu đƣợc:
- Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm
nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà
chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt.
- Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV
gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào
thời điểm nghiên cứu.
- Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng
chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào.


v
SUMMARY


This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9
th
,
2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus
and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to
diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3
th
,
2005 to 8
th
, 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of
biotechnology and chemistry of Nong Lam University.

The objects of this research are as follows:
- Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and
generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong
districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts
can be evaluated.
- Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic
Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal
antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus
symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic
Virus and Tomato Spotted Wilt Virus.
- Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We
try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus
and confirm DAS-ELISA results.
The results of this research are as follows:
- Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong
districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by
viruses.
- DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen
creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3
th
, 2005 while Tobacco Mosaic
Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these
areas.
- Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but
the product has not been confirmed yet.


vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Lời cảm tạ . ................................................................................................................. i
Tóm tắt ...... ................................................................................................................ ii
Tóm tắt bằng tiếng Anh ............................................................................................ iii
Mục lục ..... ............................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii
Danh sách các bảng, biểu đồ .................................................................................... ix
Danh sách các hình ............................................................................................... x
PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1
1.2. Mục đích yêu cầu ..................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ......................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1. Cà chua ..................................................................................................... 3
2.1.1. Sơ lƣợc về cà chua ......................................................................... 3
2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới ................................ 3
2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt .............................................. 4
2.2. Bệnh hại trên cà chua ............................................................................... 4
2.2.1. Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) ........................... 6
2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra ..................................... 6
2.2.1.2 Phân loại của TSWV .......................................................... 7
2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế .................. 7
2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV ........................................................ 8
2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV ....................................................................... 8
2.2.1.6 Tính chất của TSWV .......................................................... 9
2.2.1.7 Vector truyền ...................................................................... 9


vii

2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV ............................ 10
2.2.1.9 Triệu chứng bệnh ................................................................ 11
2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV ............................................... 11
Cây kháng ...................................................................... 11
Quản lý TSWV ............................................................... 12
2.2.2. Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) ................................... 14
2.2.2.1 Lịch sử của bệnh ................................................................. 14
2.2.2.2 Phân loại của TMV ............................................................. 14
2.2.2.3 Sự phân bố của TMV .......................................................... 14
2.2.2.4 Ký chủ của TMV ................................................................ 14
2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV ................................................ 14
2.2.2.6 Tính chất của TMV ............................................................. 16
2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh ........................................................ 17
2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV ....................................... 17
2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV ................................................. 17
2.2.2.10 Phòng trừ .......................................................................... 19
2.2.3. Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) ................................. 19
2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV .................................................. 19
2.2.3.2 Phân loại CMV ................................................................... 20
2.2.3.3 Phạm vi phân bố ........................................................................... 21
2.2.3.4 Ký chủ ................................................................................. 21
2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV ................................................ 21
2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV ................................................. 23
2.2.3.7 Sự truyền bệnh .................................................................... 24
2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh ............................................. 24
2.2.3.9 Triệu chứng .................................................................................. 25
2.2.3.10 Phòng trừ ........................................................................... 25
2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật ............................ 26
2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị ............................ 26

viii
2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu ..................................... 26
2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học ................................ 26
2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh ..................... 27
2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. ............................................... 28
2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA ............................................ 28
2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. ........................................... 28
Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA
(Double antibody sandwich-ELISA) ................................ 28
Indirect Sanwich ELISA ................................................ 28
2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) ....................................... 28
2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor .......... 28
2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. ................... 29
2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphirm) .................................................................. 29
2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA ................... 29
2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác ............................... 29
2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng probe đánh dấu ............................... 29
2.3.5.5 Array ................................................................................... 29
2.4. Phƣơng pháp DAS-ELISA và phƣơng pháp RT-PCR ............................. 30
2.4.1. Phƣơng pháp DAS-ELISA ............................................................. 30
2.4.2. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................... 30
2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV,
TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây ...................................... 32
2.5.1. Ở nƣớc ngoài .................................................................................. 32
2.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 33
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 34
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................... 34
3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài .............................................................. 34

3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 34.


ix
3.2. Vật liệu ..................................................................................................... 34
3.2.1. Dụng cụ .......................................................................................... 34
3.2.2. Hóa chất ........................................................................................ 34
3.3. Phƣơng pháp ............................................................................................. 35
3.3.1. Điều tra và lấy mẫu ....................................................................... 35
3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................ 35
3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA ............................................. 35
3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR ................................................... 36
Ly trích RNA ................................................................. 36
Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA ............ 37
Phản ứng PCR ................................................................ 38
3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR ..................................................... 44
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 46
4.1. Phản ứng ELISA ....................................................................................... 46
4.1.1. Kết quả ELISA ............................................................................... 46
4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với
các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV .................................................. 47
4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra ................ 48
4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra ............... 49
4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra .............. 51
4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm .............................. 52
4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát đƣợc ............................. 53
4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR ................................................................ 57
Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 ............................................... 57
Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 ..................................... 62
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 70

5.1. Kết luận .................................................................................................... 70
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 71
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 73
1 2



x
PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA ............................... 76
PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. ............................. 77
PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR ..................................... 78
PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA ............................ 79
PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra ............................................................................. 80
PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tƣơng đồng với TMV dòng ở Trung Quốc
dùng để thiết kế primer. ......................................................................... 81






xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMV: Cucumber Mosaic Virus
TMV: Tobacco Mosaic Virus
TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus
CTV: Citrus Tristeza Virus
TLCV: Tomato Leaf Curl Virus (bệnh xoăn ngọn cà chua)
TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (bệnh xoăn vàng ngọn),

TRSV: Tomato Black Ring Virus (bệnh đốm hình nhẫn)
TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus (bệnh lùn bụi cà chua)
PV Y: Potato Virus Y
PV X: Potato Virus X
DMSO: dimethyl sufoxide
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay.
DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay
RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
N: Nucleoprotein
cDNA: complementary DNA
ssRNA : single strand RNA
MP: Movement Protein (Protein di chuyển)
CP: Coat Protein (Protein vỏ)
ORF: open reading frame
m
7
Gppp: 7- methyl guanosine triphosphate
HR: Hypersensitive Response (phản ứng siêu nhạy cảm)
SAR: system acquired resistance (tính kháng có hệ thống)
PR protein: pathogenesis- related protein
VPg : protein liên kết với genome
satRNA: satellite RNAs (RNA vệ tinh)
DEP : delution end point
LIV : longevity invitro
TIR : thermal inactivation range.


xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

BẢNG, BIỂU ĐỒ
TRANG
Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV, TMV và CMV trên
tổng số mẫu. ........................................................................... 47
Bảng 4.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV
so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV. .......................... 48
Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) bệnh virus theo tuổi cây trong tổng số mẫu
điều tra. ................................................................................. 49
Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh TMV, CMV và TSWV giữa
Đơn Dƣơng và Đức Trọng. .................................................... 50
Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc
trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ........................ 53
Bảng 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 53
Biểu đồ 4.1 Biểu diễn tỷ lệ dƣơng tính và âm tính CMV, TMV, TSWV. 47
Biểu đồ 4.2 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm giữa các mẫu nhiễm hỗn hợp
TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV. ........ 48
Biểu đồ 4.3 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm virus theo tuổi cây .. 49
Biểu đồ 4.4 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà
đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ................ 51
Biểu đồ 4.5 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc
trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ......................... 53
Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 54



xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ .............................................................. 10

Hình 2.2 Amblyserus cucumeris ................................................................. 13
Hình 2.3 Amblyseius degenerans ................................................................ 13
Hình 2.4 Hypoaspis aculeifer ...................................................................... 13
Hình 2.5 Orius insidiosus ............................................................................ 13
Hình 2.6 A, B: virion của TMV; C,D: tinh thể TMV. ............................... 16
Hình 2.7 Triệu chứng điển hình của TMV ở cà chua ................................. 18
Hình 2.8 Cấu tạo của CMV ......................................................................... 22
Hình 2.9 Triệu chứng điển hình của CMV ở cà chua ................................. 25
Hình 4.1 Ruộng cà chua bị nhiễm bệnh virus ở ở Đức Trọng .................... 52
Hình 4.2 Ruộng cà chua khỏe ở Đơn Dƣơng ............................................. 52
Hình 4.3 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ................................. 55
Hình 4.4 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ........................ 55
Hình 4.5 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV .......................................... 55
Hình 4.6.1 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55
Hình 4.6.2 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55
Hình 4.7 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55
Hình 4.8 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56
Hình 4.9 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56
Hình 4.10 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56
Hình 4.11 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ........................................... 56
Hình 4.12 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56
Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 ........................................... 58
Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3 ........................................... 59
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 4 ........................................... 59
Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 5 ........................................... 60
Hình 4.17 Kết quả PCR lần 1 và 2 trên 4 mẫu ............................................. 62


xiv
Hình 4.18 Kết quả PCR lần 3 ........................................................................ 64

Hình 4.19 Kết quả PCR lần 8, 9, 10, 11, 12 trên 2 mẫu 2 và 3 ..................... 66
Hình 4. 20a Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67
Hình 4.20b Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67
Hình 4.21 Mức độ tƣơng đồng của trình tự các dòng TMV trên
thế giới ....................................................................................... 69


1
PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc trồng rộng rãi trên thế giới từ thế kỷ thứ 19
cho đến nay ( Đây là cây
trồng thích hợp với hoạt động trồng trọt bán thời gian và qui mô nhỏ. Cà chua có giá trị
thƣơng mại khá cao. Mỗi năm, nƣớc Mỹ thu về hàng tỷ đô la từ thị trƣờng xuất khẩu cà
chua. Cà chua là loại rau cao cấp rất đƣợc ƣa chuộng vì nó có giá trị dinh dƣỡng cao. Các
nhà khoa học Nga còn cho biết: quả cà chua có thể dùng làm vắc - xin phòng chống bệnh
viêm gan siêu vi A, B, bệnh AIDS và bệnh viêm não. Nhu cầu cà chua luôn luôn lớn và
kỹ thuật trồng cà chua lại không quá phức tạp hay khó khăn, không tốn nhiều trang thiết
bị đặc biệt.
Vì những lý do đó mà cà chua thƣờng đƣợc trồng xen canh với các cây rau màu
khác trên những vùng đất thích hợp. Thế nhƣng, cà chua có thể bị ảnh hƣởng bởi rất nhiều
bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (nhƣ nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và
bệnh không do ký sinh (nhƣ độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự
mất cân bằng dinh dƣỡng). Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra
tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch.
Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều
dịch bệnh virus hơn. Ở Việt Nam, bệnh virus trên cà chua cũng xuất hiện ở nhiều nơi trên
diện tích lớn. Ví dụ nhƣ dịch virus vào tháng 3 năm 2005 ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm
Đồng đã làm cho 27 ha cà chua ở đây thiệt hại gần nhƣ 100% (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật

tỉnh Lâm Đồng). Do đó, cần phải xác định xu hƣớng lây lan của virus trên thế giới và tiến
hành những hoạt động kiểm dịch ở những nơi cần thiết đồng thời tiến hành những nghiên
cứu xa hơn nhằm phục vụ cho việc phòng chống bệnh virus cho cây trồng.
Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng
tôi thực hiện đề tài: ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus,
Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum


2
lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy
trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”.
1.2. Mục đích yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Chẩn đoán và phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic
Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ
thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay). Từ
đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu.
- Bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR.
1.2.2 Yêu cầu
- Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra trên đồng ruộng. Từ
đó khuyến cáo tác hại và các biện pháp khống chế bệnh do các virus này gây ra.
- Nắm vững nguyên tắc và các bƣớc tiến hành của kỹ thuật ELISA và RT - PCR.





3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cà chua
2.1.1 Sơ lƣợc về cà chua
Cà chua (Solanum lycopersicum) có xuất xứ ở miền Nam và Trung Mỹ. Cà chua
thuộc giới thực vật (Plantae), thuộc chi Magnoliopsida, chi phụ là Asteridae, thuộc bộ
Solanales, thuộc họ Solanaceae, thuộc giống Solanum, thuộc loài Solanum lycopersicum.
Tên cà chua xuất phát từ một từ trong tiếng Nahuatl là tomatl
(
2.1.2 Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới và Việt Nam
Sự xuất hiện của cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc xác định là từ những năm
70 trƣớc công nguyên ở Nam Mỹ. Vào thế kỉ 16, cà chua còn mọc hoang ở vùng núi
Andes của Nam Mỹ và phát triển ở Mêxicô. Sau đó, những ngƣời Châu Âu khám phá
vùng đất mới này và cà chua đƣợc vận chuyển về châu Âu bằng tàu. Do có hàm lƣợng
Licopen cao nên cà chua nhanh chóng đƣợc trồng ở Châu Âu để sử dụng vào các bữa ăn
hàng ngày và đƣa vào công nghiệp chế biến rau quả.
Ngƣời phƣơng Tây đặc biệt sùng bái quả cà chua. Từ năm 1931 - 1999, ở châu Âu
có khoảng 131 công trình nghiên cứu về cà chua. Sản lƣợng cà chua ƣớc tính ở một số
nƣớc Châu Âu năm 2004 nhƣ sau: Tây Ban Nha (2.300 tỷ tấn) tăng 34% so với năm
2003, Italy (5.800 tỷ tấn) tăng 9% so với năm 2003, Hy Lạp (1.050 tỷ tấn) tăng 8% so với
năm 2003. (Nguồn: Attaché Reports, USDA/FAS and USDA/ERS). Mỹ đã tạo ra cây
khoai - cà có đặc điểm cho củ (ở dƣới đất) giống khoai tây và cho trái (ở trên cây) giống
cà chua.
Tại Nhật Bản, cà chua cũng đƣợc khuyến khích ăn hàng ngày để phòng chống các
bệnh tim mạch và ung thƣ. Trung Quốc cũng cho phép các giống “rau quả không gian”
đƣợc trồng trên diện rộng khắp đất nƣớc. Trong đó, diện tích “cà chua không gian” (tạo
giống mới bằng tia vũ trụ trên không gian) chiếm hơn 2000 ha (Nguồn:
. "Rau quả không gian” ở Trung Quốc. Ngày
26 tháng 09 năm 2004). Chính phủ Malaysia đã thực hiện nhiều giải pháp nhằm phát triển


4

công nghệ sau chế biến rau quả, trong đó cà chua là một trong 8 loại rau đƣợc đƣa vào
danh sách ƣu tiên.
Ở Việt Nam, trong định hƣớng và mục tiêu phát triển nông nghiệp, nhà nƣớc ta
khuyến khích trồng các loại rau quả xuất khẩu, trong đó có cà chua. Năm 2003 diện tích
cà chua thu đông và vụ đông cả nƣớc ta đạt 11.936 ha. Vụ Đông 2003 ở Hà Tây - một
trọng điểm cà chua cho xuất khẩu của Nam Định, huyện Hải Tây trồng 135 ha cà chua,
huyện Hải Hậu đƣa diện tích cà chua lên trên 40 ha. Trên diện tích 1.450 ha cà chua vụ
đông của Nam Định có 652 ha đƣợc ký hợp đồng bao tiêu sản phẩm giữa nhà máy chế
biến và nông dân. Việt Nam đã đƣa ra thị trƣờng giống cà chua HT mang thƣơng hiệu
Việt Nam. Đây là giống rau lai cao cấp đầu tiên ở nƣớc ta có khả năng cạnh tranh trên thị
trƣờng.
Nhƣ vậy, trên thế giới và cả ở Việt Nam cà chua luôn đƣợc quan tâm và khai thác
nhƣ là một nguồn lợi không nhỏ, không thể thiếu đƣợc.
2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt
Với điều kiện thiên phú về nhiệt độ, ẩm độ và bức xạ, Đức Trọng và Đơn Dƣơng là
2 huyện trọng điểm về rau và cà chua của tỉnh Lâm đồng. Hàng năm 2 huyện này trồng
đến 3.500 ha cà chua (trong tổng diện tích 4.500 ha trồng rau màu của toàn tỉnh Lâm
Đồng) với sản lƣợng ƣớc tính khoảng 150.000 tấn. Cà chua đã trở thành cây trồng chủ lực
cho vùng rau này. Những năm trƣớc, bệnh héo rũ do vi khuẩn luôn đe dọa cà chua ở đây.
Nông dân đã chuyển qua trồng giống cà ghép (ghép giống M186 với gốc cà dại) để tăng
sức chống chịu với điều kiện ngoại cảnh và bệnh, trong đó chủ yếu là bệnh héo rũ do vi
khuẩn. Năm 2005, do thời tiết phức tạp: nắng hạn kéo dài kết hợp với tiết trời khô hanh
đã làm cho bệnh virus phát triển nhanh chóng. Ở Đức Trọng, hàng loạt cây cà chua đã bị
phá bỏ vì bệnh virus. Ƣớc tính vào tháng 3 năm 2005 có khoảng 27 ha cà chua bị nhiễm
bệnh virus (gần 100%) ở Đức Trọng (Nguồn: Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tỉnh Lâm
Đồng).
2.2 Bệnh hại trên cà chua
Bệnh cà chua trở thành yếu tố giới hạn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên
thế giới. Gần 200 bệnh cà chua đã đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau gây ra.

5
Có 2 nhóm nguyên nhân gây bệnh chính trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không
do ký sinh. Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Bệnh
không do ký sinh thƣờng là do độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi
sự mất cân bằng dinh dƣỡng, mối quan hệ về oxy không hợp lý, hay ảnh hƣởng của thuốc
trừ cỏ, thuốc trừ sâu, sấm chớp. Những triệu chứng không do ký sinh gây ra thƣờng nhẹ
hơn những triệu chứng gây ra bởi ký sinh và gây khó khăn thêm cho việc chẩn đoán bệnh
cho cây trồng.
Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus
gây hại nhƣ CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus), TSWV
(Tomato Spotted Wilt Virus), CTV (Citrus Tristeza Virus). Các virus này gây ra những
triệu chứng tƣơng đối giống nhau là lá vàng loang lổ, xoăn, cây nhỏ, đều lan truyền qua
bọ phấn Bemisia. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh
phát triển nhiều trong điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ từ 20 - 30
o
C, nhiều nắng, ít mƣa.
Tỷ lệ mắc bệnh và tính nghiêm trọng của bệnh thay đổi từ mùa này sang mùa khác vì
những mối quan hệ phức tạp
(2)
.
Bệnh virus hại cà chua
Bệnh virus hại cà chua là 1 tập đoàn có rất nhiều bệnh hại, trong đó các loại virus
quan trọng gây ra rất nhiều tác hại cho cà chua ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới gồm:
bệnh khảm vàng (TMV: Tomato Mosaic Virus), bệnh khảm mảng lồi lõm (CMV:
Cucumber Mosaic Virus), bệnh đốm héo (TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus), bệnh xoăn
ngọn cà chua (TLCV: Tomato Leaf Curl Virus), bệnh xoăn vàng ngọn (TYLCV: Tomato
Yellow Leaf Curl Virus), bệnh đốm hình nhẫn (TRSV: Tomato Black Ring Virus), bệnh
lùn bụi cà chua (TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus) và virus X, Y của khoai tây
(5)

.
Bệnh virus đang gây thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất cà chua ở nƣớc ta và ở
nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Cây cà chua bị bệnh thƣờng không có
quả hoặc quả rất nhỏ. Nhiều trƣờng hợp bệnh rất nặng, không cho thu hoạch gây ra mất
mùa cà chua.
Sơ lƣợc về CMV, TMV và TSWV


6
Hiện nay, thuật ngữ “emerging plant virus” đã đƣợc hình thành. Thuật ngữ này
xuất phát từ thuật ngữ “emerging virus” đƣợc đúc kết từ đầu những năm 1980 để mô tả
tình cảnh bi kịch do bệnh AIDS gây ra. Sau đó, thuật ngữ này dƣờng nhƣ trở nên thích
hợp với tình hình dịch bệnh virus trên cây trồng. Ba virus điển hình cho thuật ngữ này là
CMV, TMV, CTV vì ba virus này phân bố rất rộng về địa lý, rất dễ gây ra dịch bệnh cho
những cây trồng quan trọng về kinh tế. TSWV (có khi đƣợc gọi là “Super virus”) trong
những năm gần đây lại gây dịch bệnh nghiêm trọng trên hai đối tƣợng có giá trị kinh tế
cao là cà chua và thuốc lá. Ngƣời ta xếp TSWV vào loại “re - emerging plant virus”. Hiện
nay, ba virus CMV, TMV, TSWV đang gây bệnh rất nguy hiểm trên cà chua.
2.2.1 Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV)
2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra
Trƣớc đây, virus TSWV đƣợc báo cáo dƣới nhiều tên khác nhau, ví dụ: virus đồng
thau cà chua (Tomato Bronzing Virus), Kromnek Virus, Pineapple Yellow Potyvirus,
Makhorka Tip Chlorosis Virus, Vira Cabeca Virus và nhiều tên khác (Sakimura, 1962;
Best, 1968; Smith, 1972)
(1)
. Hiện nay, virus TSWV thƣờng đƣợc gọi là Tomato Spotted
Wilt Virus hay Tomato Spotted Wilt Tospovirus hay Pineapple Yellow Spot Virus. Nó
còn có các tên khác nhƣ Spotted Wilt, Bronze Leaf (ở Anh), Maladie bronze’e (ở Pháp),
Bronceado (ở Tây Ban Nha). Ngoài ra, tên Lycopersicon Virus 3 cũng đƣợc sử dụng rộng
rãi để chỉ virus TSWV. Sự thay đổi trong thuật ngữ phản ánh sự thay đổi nhiều của triệu

chứng bệnh, tùy thuộc vào loài virus, cây chủ và vùng địa lý nơi bệnh đó đƣợc tìm thấy.
Báo cáo đầu tiên về bệnh do TSWV (bệnh héo đốm cà chua) trên cà chua có từ
năm 1915 ở miền Nam nƣớc Úc (Brittlebank, 1919). Bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng
cho cà chua ở Úc trong nhiều năm và vẫn là vấn đề nghiêm trọng ở New South Wales.
Những vùng khác cũng có tổn thất nặng nhƣ Argentina, Hawaii.
Sau chiến tranh thế giới thứ hai, bệnh héo đốm cà chua giảm rõ rệt ở Tây Âu và
Mỹ (có thể do việc phòng trừ bọ trĩ bằng hóa chất) trong khi ở Đông Âu, Nam Mỹ và
Nam Phi, virus này vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng. Những năm đầu của thập niên 80,
TSWV đã phát triển nhanh chóng và lan rộng ra nhiều vùng địa lý khác nhau (Barker,
1989; Marchoux và cộng sự, 1991; Varia và cộng sự, 1993) cùng với sự phát triển nhanh


7
chóng của vectơ bọ trĩ cẩm chƣớng (Frankliniella occidentalis) (Mantel và Van de Vrie,
1998; Brodsgaard, 1989). Từ năm 1998, TSWV đã trở thành vấn đề chính cho những
ruộng cà chua
(4)
.
Bệnh do virus TSWV bộc phát trên nhiều quốc gia sản xuất nông nghiệp trên khắp
các lục địa, chủ yếu trong vùng khí hậu nóng. Ở vùng khí hậu ôn đới thì TSWV phổ biến
trong canh tác nhà lƣới.


8
2.2.1.2 Phân loại của virus TSWV
TSWV thuộc họ Bunyaviridae, một họ lớn của những virus đƣợc mang bởi động
vật chân đốt. Họ Bunyaviridae có 5 giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus,
Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó, Tospovirus đƣợc xem là thuộc 10 virus gây bệnh
cây nổi bật nhất. Tác động của Tospovirus rất lớn.
Một thời gian dài TSWV đƣợc phân loại nhƣ là đại diện duy nhất của nhóm virus

cây đơn xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989,
TSWV đƣợc chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I. Giữa năm 1989 và 1992, hai
dòng này đƣợc xác định là khác nhau về huyết thanh học và tên của chúng đã đƣợc thay
đổi thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I). Nhờ sinh học phân tử, ngƣời
ta nhận thấy virus TSWV có những đặc tính chung của họ Bunyaviridae. Vì vậy, hiện nay
TSWV đƣợc phân loại nhƣ là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ
Bunyaviridae. Sử dụng kháng huyết thanh đơn dòng và đa dòng để xác định cấu trúc
nucleoprotein của TSWV, ngƣời ta thấy rằng TSWV là loài gây bệnh cho nhiều cây trồng
trên thế giới (de Avila và cộng sự, 1990). Những nghiên cứu này cũng chứng minh sự tồn
tại của những loài Tospovirus khác nhau là TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm
huyết thanh I), GRSV: Groundnut Ringspot Virus (nhóm huyết thanh II), TCSV: Tomato
Chlorotic Spot Virus (nhóm huyết thanh III), INSV: Impatiens Necrotic Spot Virus (nhóm
huyết thanh IV), GBNV: Groundnut Bud Necrosis Virus (nhóm huyết thanh V), WSMV:
Wattermelon Silver Molt Virus.
2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế
TSWV thƣờng ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới. TSWV đã đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ,
châu Á, châu Úc, Macedonia, Nam Serbia, Nam và Bắc Mỹ. Ở châu Âu, TSWV xuất hiện
ở nơi có khí hậu ấm và trong các nhà kính. Ở Yugoslavia, TSWV trãi rộng ở những vùng
khô, ấm và có nắng nhiều.
TSWV gây đe dọa nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. TSWV là một
trong 10 virus gây hại nghiêm trọng nhất. TSWV gây thiệt hại trên toàn thế giới hơn 1 tỉ
đô la hàng năm (Goldbach and Peter, 1994).
2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV


9
TSWV có phổ ký chủ rất rộng. Chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và
nhiều cây trồng khác nhau. Những công trình nghiên cứu về loài ký chủ mới của TSWV
đƣợc xuất bản với tốc độ rất nhanh (German và cộng sự, 1992). Cho đến nay, danh sách
ký chủ của TSWV là 1090 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai

lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn. Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm nhiều cây công
nghiệp quan trọng nhƣ ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, các loại rau nhƣ cần tây,
rau diếp. Hoa thƣợc dƣợc (Dahlia pinnata Cav.) rất mẫn cảm với virus này. Đậu phộng
đƣợc xem là ký chủ chính của virus này ở Úc và Hoa Kỳ. Cây bồ công anh (Taraxacum
officinalis L.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), và nhiều loài cà hoang dại đều là ký chủ
của TSWV. Cây cảnh và cỏ dại thƣờng là nguồn chứa TSWV. Ở những vùng có mùa
đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa
đông mát mẻ thì cây ký chủ hàng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng.
Việc lây nhiễm nhân tạo trên Petunia là nhanh nhất, chính vì vậy nó là cây chỉ thị tốt cho
TSWV.
2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV
Các phần tử virus bằng nhau về kích cỡ và có đƣờng kính khoảng 85nm. Đặc trƣng
của những phần tử TSWV là vỏ lipid chứa 2 loại glycoprotein G
1
và G
2
bao quanh một
genome RNA gồm ba phần đã đƣợc đóng gói chặt chẽ bởi nhiều bản sao của tiểu đơn vị
nucleoprotein (N) và 10 - 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van
Poelwijk và cộng sự, 1993).
Bộ gen virus là RNA chia thành 3 phần, là loại ambisense ssRNA chứa 5 gen mã
hóa ít nhất 6 protein cấu trúc của virus:
- LRNA (dài 8.897 nucleotide) là RNA lớn nhất. Đó là sợi negative sense và là sợi
đơn cistron. LRNA mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA.
- MRNA (4.821 nucleotide) mã hóa 2 protein vỏ (G1 và G2) và một protein phi
cấu trúc đƣợc xem nhƣ là protein di chuyển từ tế bào đến tế bào (NSm).
- SRNA (2.916 nucleotide) mã hóa nucleoprotein (N) và một protein phi cấu trúc
thứ 2 (NSs).

10
RNA có những trình tự cuối bổ sung từng phần, cho phép RNA thích nghi với sự
thành lập vòng giả (Elliott và cộng sự,2000).
Bộ gen của virus mã hóa cho 6 protein đặc biệt:
- RNA polymerase (330kDa) đƣợc mã hóa bởi LRNA.
- Protein NS
M
(34kDa) có mặt trong sự di chuyển từ tế bào virus sang tế bào chủ,
đƣợc mã hóa bởi MRNA sense.
- Glycoprotein G
1
(78kDa) và G2 (58kDa) nhô ra trên bề mặt của virus, đƣợc mã
hóa bởi MRNA sense bổ sung.
- Protein NS
S
(52kDa) đƣợc mã hóa bởi SRNA sense (chức năng chƣa biết).
- Protein N (29kDa) là protein cấu trúc bao phủ đoạn RNA genome tạo ra
nucleocapside, đƣợc mã hóa bởi sợi RNA sense bổ sung (Hull, 2002).
2.2.1.6 Tính chất của virus TSWV
TSWV có nhiệt độ Q10 là 41,2
o
C, độ pha loãng tối thiểu (DEP) là 1: 10
-5
, thời
gian sống trong in vitro (LIV) của nó ở 24
o
C từ 2 đến 5 giờ, điểm nhiệt độ virus không
hoạt động (TIR) là 40 - 46
o
C. Virion đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của cây chủ,

trong tế bào chất. Thể vùi có trong tế bào nhiễm, có hình dạng bất thƣờng. Những cụm
viron hay không bào có thể nảy chồi từ túi chứa dịch của lƣới nội chất.
2.2.1.7 Vector truyền
Tất cả virus đều kí sinh bắt buộc, có nghĩa là chúng không thể sống sót ở bên ngoài
kí chủ và lan truyền bởi hạt hay côn trùng. TSWV đƣợc mang bởi bọ trĩ (thrips). Chúng là
những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5mm) sống ở trên hoa, lá và đất. Có chín loài bọ trĩ
đƣợc xem là vector truyền TSWV. Trong đó, có những loài quan trọng nhất vì chúng
phân bố rất rộng rãi, đó là: Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F. schultzei
(Trybom), F. fusca (Hind), Thrips tabaci Lind. Vì sự phân bố rộng của Western Flower
Thrip (Frankliniella occidentalis), Onion thrips (Thrips tabaci) nên chúng đƣợc xem là
vector chính của bệnh.
Sự nhiễm tự nhiên trên đồng ruộng gây ra bởi bọ trĩ theo kiểu bền vững (Hình 2.1).
Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa. Ấu trùng vừa nở ra (có màu
vàng) bắt đầu ăn ngay. Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng thu virus vào


11
bên trong. Thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên. Ấu trùng phát triển đầy
đủ sẽ chui vào đất (sâu khoảng 8cm) và trở thành nhộng, không ăn nữa. Sau đó chúng
trƣởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất. Ấu trùng bọ trĩ chƣa lan truyền bệnh cho cây
ngay đƣợc mà phải chờ đến khi chúng trƣởng thành. Có 2 lý do để cần thời gian này: (1)
phải có thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, chúng đi từ miệng vào tuyến
nƣớc bọt, khi đó chúng sẵn sàng cho sự truyền qua một cây khác; (2) bọ trĩ non không có
cánh nên khó có cơ hội di chuyển từ cây này sang cây khác và hầu nhƣ hoàn toàn không
thể tiếp cận đƣợc những cây mới trồng ra ruộng. Những con bọ trĩ trƣởng thành có thể
mang virus suốt đời nhƣng không truyền cho giai đoạn trứng. Thế hệ kế tiếp mang virus
bằng việc ăn cây bị nhiễm. Thời gian từ trứng đến giai đoạn trƣởng thành có thể thay đổi
do nhiều yếu tố, ngƣời ta xác định đƣợc là 14 ngày ở 29,5
o
C đối với Western Flower

Thrip.

Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ
(Nguồn: T.A. Zitter and M.L. Daughtrey và J.P. Sanderson, 1989.)
Câu hỏi đặt ra là TSWV có đƣợc truyền qua hạt không? Ngƣời ta đã chứng minh
rằng cây nhiễm TSWV không thể truyền virus sang hạt của nó và hạt nhiễm virus là do từ
bên ngoài (Y. Antignus et al, 1997).
2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV
Theo Best, ánh sáng mặt trời ngăn cản sự hình thành vết hoại tử. Do đó, khi cây
đƣợc chiếu sáng liên tục cây sẽ ít bệnh hơn và thời điểm xuất hiện bệnh cũng trễ hơn.
Bệnh thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp (đối với các nƣớc nhiệt đới là thời tiết mát
và ẩm). Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ. Mƣa nhiều và to trong
mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp. Thời tiết ấm áp và khô là điều kiện
tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản. Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trƣởng sinh
1. Trứ ng
2. Ấ u trùng (thu virus)
3. Nhộ ng (không ă n)
4. Nhộ ng (không ă n)
5. Bọ trĩ trưởng
thành (truyề n virus)