HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng pps

HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN

TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein
(AFP).
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.
Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật
ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào
lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F, có
thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định
lượng AFP trong 90 mẫu huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của
người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+), 16
mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh
của bệnh nhân u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1


ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh nhân u gan là > 500 ng/ml
(76%), AFP < 500 ng/ml (24%).
Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng AFP được sản xuất từ chuột LOU có khả năng định lượng AFP trong
huyết thanh từ 0,5-350ng/ml.
ABSTRACT
THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE
DETERMINATION

USING

ANTI-ALPHA-FETOPROTEIN

MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU
RAT

Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007:
208 - 212
Purpose: Set up the system for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies.
Method: Experimental research.


Results: The test ELISA for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat had realized
and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml.
In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum
samples, composed of 35 serum samples of normal donors, 14 serum
samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with
acute B hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the
serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum
concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP <
500 ng/ml (24%), respectively.
Conclusion: The system for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat can quantify
from 0,5ng/ml to 350ng/ml.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng được Georges Kohler và César
Milstein trình bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng thể đơn dòng đã
được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận diện và
định lượng kháng nguyên.


* Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh

Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có trọng lượng phân tử
khoảng 70.000 dalton, được tổng hợp ở gan phơi thai và túi ối, vì vậy nồng độ
AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh bào thai người rất cao. Tuy nhiên
AFP có trong huyết thanh người sau sinh và người trưởng thành rất thấp, chỉ

khoảng 3ng/ml(7,9,11).
Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát AFP tăng rất cao, và việc
định lượng AFP trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh ung thư gan
nguyên phát.
Với kháng thể đơn dịng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphơ B
của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng tôi xây
dựng hệ thống định lượng AFP trong huyết thanh người bằng kỹ thuật
ELISA(5,10).


Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein sử dụng kháng thể
đơn dòng kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của
chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm.
Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu
- Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể đơn dịng kháng AFP có gắn
men peroxidase.
- Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại Trung Tâm Đào Tạo Bồi
Dưỡng Cán Bộ Y Tế và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh. Trong đó
25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan,
trong đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân được chẩn đốn
viêm gan siêu vi B cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14 mẫu huyết
thanh có HBsAg (+) nhưng khơng có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam –
4 nữ, 35 mẫu huyết thanh của người bình thường khỏe mạnh, HBsAg (-).


Phương pháp thu thập số liệu

- Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng độ AFP và giá
trị mật độ quang tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA.
- Xác định mật độ quang tương ứng của các nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50,
75, 100, 150, 200, 300, 350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh chế và
chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM.
- Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể định lượng được bằng kháng
thể đơn dòng từ chuột LOU: dùng phương pháp ELISA
- Xác định mật độ quang tương ứng của các nồng độ thấp của AFP: 0;
0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5 ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể
định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU với phương pháp
ELISA.
- Định lượng AFP trong các mẫu huyết thanh bằng hệ thống định
lượng sử dụng kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng phương pháp
ELISA.
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh số thứ tự từ 1 đến 90, trong
đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường được đánh số từ 1 đến 35, 14


mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến
49, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp được đánh số
từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh số từ 66
đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định lượng khơng pha lỗng, lần 2 những
mẫu huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1 sẽ được pha loãng với tỉ
lệ 1:2. Những mẫu huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên 350ng/ml thì
chúng tơi quyết định lấy kết quả cuối cùng là trên 500 ng/ml.
Xử lý số liệu
Chương trình Point To Point, chương trình dùng cho xử lý số liệu trong
kỹ thuật Elisa để tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương trình SPSS
11.5
KẾT QUẢ

Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật
độ quang tương ứng
Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy khi nồng độ AFP tăng thì
DO cũng tăng theo. Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500 ng/ml thì
DO tăng khơng đáng kể.


Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng nồng độ AFP trong huyết
thanh đến mức cao nhất là 350ng/ml.
Qua đường cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng
thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng tôi nhận thấy hai
đại lượng DO và nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận.
+ r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và nồng độ AFP có mối liên hệ
thuận rất chặt chẽ.
+ Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng: y = a + bx, trong đó:
Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính là: y = 0,599 + 0,0055x
+ P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan tuyến tính theo chiều
thuận giữa hai đại lượng DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương quan có
ý nghĩa thống kê.


Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng
thể đơn dòng từ chuột Lou

Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP


Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ thống định lượng
AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể
định lượng được (đồ thị 2)

Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng độ AFP giảm thì giá trị DO
giảm theo, nhưng khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn đi ngang.
Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể
đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng được là 0,5 ng/ml.
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh
bằng hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng
AFP của chuột LOU

Số
thứ

Số

tự mẫu

mẫu

trị

huyết

huyết

Giá

Giá

Giá trị

nhỏ trị lớn nhất trung bình

nhất

thanh

thanh

1-

35

1,08

7,26

2,7780


35

36-

14

0,91

6,08

3,7993

50-

16

6,2

113,53

32,1806

49

65

Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan (những
mẫu huyết thanh từ số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là
có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).
BÀN LUẬN
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein trong huyết thanh người bằng
phương pháp Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản xuất từ tế bào
lymphơ B của chuột Lou và dịng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml
so với hệ thống định lượng của các hãng khác là Abbott 0,4ng/ml(2) và
Maxim Biotech 2ng/ml(6), và AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao
nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là 350ng/ml(2) và Maxim Biotech là


300mg/ml(6). Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các thử nghiệm đặc
tính và định lượng khơng có phản ứng chéo với các protein của huyết thanh
nhất là với albumin, protein có trọng lượng phân tử và cấu trúc gần giống

với AFP.
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90 mẫu huyết thanh có kết quả
tương đồng với các nghiên cứu trong và ngồi nước(2,6,8).
Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng được
sản xuất từ chuột Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5350ng/ml, và chúng tôi hy vọng góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ
thống định lượng AFP.
KẾT LUẬN
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng
kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của
chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dịng tế bào IR983, có thể định lượng
nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến 350ng/ml.
Mật độ quang và nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận với r
= 0,880, p = 0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: nồng độ AFP
chuẩn).


Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ thống định lượng AFP sử
dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những người bình thường là 2,8
ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân có HBsAg(+) là
3,8 ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân Viêm gan siêu vi B
cấp là 32,1 ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan đa số là > 500
ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).