BIỆT HÓA IN VITRO CÁC TẾ BÀO MẦM TỪ MẢNH MÔ TINH HOÀN CHUỘT TÓM TẮT Mục pps

BIỆT HÓA IN VITRO CÁC TẾ BÀO MẦM TỪ MẢNH MÔ
TINH HOÀN CHUỘT

TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định sự biệt hóa in vitro các tế bào mầm trong tinh
hoàn thành các tế bào tinh trùng trưởng thành.
Phương pháp: Các mẫu mô tinh hoàn chuột trưởng thành được thu
nhận để phân lập các tế bào mầm. Các tế bào mầm và các tế bào đã biệt hóa
như Sertoli được đồng nuôi cấy trong môi trường GAMETE-100 bổ sung
với hormone FSH và testosteron. Các mẫu nuôi cấy được đánh giá sau 24
giờ và 48 giờ. Sự trưởng thành của tế bào mầm được đánh giá thông qua sự
hình thành đuôi (tiêm mao).
Kết quả: Các tế bào mầm tồn tại trong tinh hoàn có thể thu nhận và
nuôi cấy in vitro. Các số liệu thu được cho thấy với nồng độ FSH là 50
IU/ml và testosteron là 1 µM/ml thì thích hợp cho việc nuôi cấy và biệt hóa
các tế bào mầm thành tinh trùng.
Kết luận: FSH có vai trò quan trọng lên sự trưởng thành của tế bào
mầm, trong khi đó testosteron hầu như không có tác động đó. Tuy nhiên,
việc kết hợp FSH và testosteron sẽ cho kết quả cao hơn khi chỉ sử dụng FSH
hay testosteron.
ABSTRACT
IN VITRO GERM CELLS DIFFERENTIATION OF MOUSE
TESTICULAR TISSUES
Pham Van Phuc, Truong Dinh, Huynh Thi Le Duyen, Phan Kim Ngoc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 219 - 223
Objective: To identify in vitro germ cells differentiation of mouse
testicular tissues to mature sperms.
Method: Testis tissues derived from mouse adult testis is used for
isolation germ cells. Germ cells and some of different cells such as Sertoli
are co-cultured in vitro in medium GAMETE-100, plus with FSH and
Testosterone. After 24 and 48h of culture, progression of spermatogenesis

and percentage of matured germ cells are evaluated. Maturation of germ
cells are evaluated via appearance of tails (flagella).
Result: Germ cells of testicular tissues can be is olated and cultured in
vitro. Data showed that suitable FSH concentration is 50 IU/L and
testosterone is 1 µM/L.
Conclusion: FSH has an important role in maturation of germ cells.
In contrast with FSH, testosterone does not almost stimulate germ cell's
maturation. However, combination of FSH and testosterone can resulted in
maturation of germ cells better than if using only FSH or testosterone.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong quá trình phát triển phôi, tế bào mầm hình thành và di cư vào
cơ quan sinh dục. Khác với các cá thể cái, toàn bộ tế bào mầm đều đi vào
quá trình giảm phân và ngừng ở prophase II; trong khi đó các tế bào mầm
của cá thể đực lại nguyên phân và đến tuổi dậy thì bắt đầu giảm phân. Do
đó, trong cơ thể trưởng thành, ở tinh hoàn vẫn tồn tại một lượng lớn tế bào
mầm sinh tinh
(2)
.
* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP. HCM



Trong một số trường hợp vô sinh ở người, sự ngừng phân chia của các
tế bào mầm trong cơ thể đực không được kích hoạt thích hợp cho tiếp tục
giảm phân bình thường; hậu quả là không có tinh trùng trưởng thành hình
thành. Các nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào mầm trong cơ thể trưởng
thành của cá thể đực có thể tiếp tục quá trình giảm phân tạo tinh trùng
trưởng thành in vitro. Trong môi trường nuôi cấy, FSH và testosteron được
chứng minh là có vai trò trong sự trưởng thành của tế bào mầm sinh tinh in
vitro

(4,5)
.
Với kĩ thuật này, người ta đang hi vọng vào một phương pháp điều trị vô
sinh mới kết hợp với kĩ thuật ICSI (vi tiêm tinh trùng vào bào tương trứng).
Theo phương pháp này: đầu tiên các mảnh sinh thiết tinh hoàn được thu nhận,
sau đó chúng được nuôi cấy biệt hóa in vitro thành các tinh trùng trưởng thành
và cuối cùng sử dụng kĩ thuật ICSI để vi tiêm nó vào trứng
(3)
. Ngoài ý nghĩa
điều trị vô sinh, việc nuôi cấy biệt hóa in vitro các tế bào mầm tinh hoàn thành
tinh trùng trưởng thành còn ý nghĩa lớn trong bảo tồn giống, bảo tồn nguồn
gen.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các mảnh biểu mô tinh hoàn
của chuột trưởng thành để thu nhận tế bào cho nuôi cấy. Đây xem như là một
mô hình cho các nghiên cứu xa hơn.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thu nhận tinh hoàn
Chuột đực trưởng thành bị giết chết bằng kéo dãn khớp cổ. Giải phẫu,
kéo tuột lớp da đến hết hai tinh hoàn. Thu nhận hai tinh hoàn, cho vào dung
dịch PBSA.
Thu nhận tế bào đơn
Các mảnh mô tinh hoàn được đặt vào trong môi trường GAMETE-100
(Vitrolife). Tiến hành ép các mảnh mô bằng hai miếng lame sạch. Các mảnh
mô này được phân tách một phần bởi lực cơ học. Sau đó, chuyển toàn bộ các
mảnh mô sau khi ép vào dung dịch collagenase IV (1000 U/ml, Sigma), ủ ở
37
0
C, trong 15-30 phút. Huyền phù tế bào thu nhận được li tâm ở 2500
vòng/phút trong 5 phút, thu cặn. Tái huyền phù cặn trong môi trường
GAMETE-100 đã được làm ấm ở 30

0
C.
Nuôi cấy và biệt hóa
Nhiều công trình nghiên cứu in vitro và khảo sát in vivo cho thấy, việc
trưởng thành của tinh trùng (hay sự biệt hóa từ các tế bào mầm sinh dục) được
kiểm soát bởi hai hormone là FSH (Puregon, Organon) và testosteron (Puregon,
Organon). Vì nồng độ FSH trong tác động lên sự biệt hóa chưa được xác định rõ
ràng, nên trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát tác động của
hormone FSH lên sự trưởng thành với 4 nồng độ khác nhau: 10 IU/L, 25 IU/L, 50
IU/L, 100 IU/L. Trong khi đó, nồng độ của testosteron đã được xác định trong
trong tinh hoàn là 1 µM/L
(5)
.
Nghiệm thức 1: Xác định nồng độ FSH tối ưu. Nghiệm thức này được
tiến hành 5 lô, mỗi lô lặp lại 3 lần. Trong đó, lô 1 là lô đối chứng, tế bào
được nuôi trong môi trường không bổ sung hormone. Các lô 2,3,4,5 tế bào
được nuôi trong môi trường có bổ sung với hormone FSH với nồng độ lần
lượt là 10 IU/L, 25 IU/L, 50 IU/L, 100 IU/L tương ứng với các lô.
(b)

(a)
1
mm

Hình 1. (a) Các mảnh biểu mô tinh hoàn, (b) Nhóm tế bào thu nhận sau khi
phân cắt với enzyme (X20).
Nghiệm thức 2: Xác định tác động của FSH và testosteron lên sự
trưởng thành tinh trùng. Trong nghiệm thức này, chúng tôi tiến hành 4 lô,
với lô 1 là lô đối chứng (không bồ sung hormone vào môi trường nuôi cấy),
lô 2: môi trường nuôi có bổ sung với hormone FSH (50 IU/L, là nồng độ

được xác định tối ưu trong nghiệm thức 1), lô 3: môi trường nuôi có bổ sung
hormone testosteron (1 µmol/L) và lô 4: môi trường nuôi có bổ sung hai
hormone FSH (50 IU/L) và testosteron (1 µmol/L). Các lô thí nghiệm trên
được lặp lại 3 lần.
Các lô thí nghiệm của các nghiệm thức trên được nuôi ở 30
0
C, 5%
CO
2
. Tác động của FSH lên sự trưởng thành của tinh trùng trong nghiệm
thức 1 được đánh giá sau 24 giờ nuôi cấy. Ở nghiệm thức 2, tiến hành đánh
giá sự trưởng thành của tinh trùng sau 24 và 48 giờ. Sự trưởng thành của
tinh trùng được đánh giá gián tiếp thông qua sự xuất hiện đuôi. Điều này dựa
trên sinh lí bình thường là khi tinh trùng trưởng thành sẽ giảm phân để đạt
được bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n) và có xuất hiện đuôi dài. Do vậy, những
tinh trùng xuất hiện đuôi sẽ được đánh giá là trưởng thành.
Tỉ lệ tinh trùng trưởng thành sau khi nuôi trong các môi trường, các
mốc thời gian được ghi nhận bằng cách đếm liên tục trên đĩa nuôi số lượng
tế bào xuất hiện đuôi trong 100 tế bào đếm được. Kết quả ở hai nghiệm thức
được xử lí bằng phần mềm tính xác xuất thống kê Statraphic 7.0.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tác động của FSH lên sự trưởng thành của tế bào mầm
Sau 24 giờ nuôi cấy, số lượng tinh trùng bắt đầu xuất hiện đuôi trong lô đối
chứng chiếm 7,33%. Ở lô thí nghiệm có bổ sung 10 IU/L FSH, tỉ lệ phần trăm tinh
trùng trưởng thành là 10,33%. Tuy nhiên, sự sai khác giữa hai số liệu này không
có ý nghĩa thống kê, nghĩa là ở nồng độ 10 IU/L hiệu quả tác động của FSH không
rõ ràng hay không có tác động lên sự biệt hóa thành tinh trùng.
Bắt đầu từ nồng độ FSH là 25 IU/L, hiệu quả tác động của nó ngày càng rõ
rệt với vai trò làm biệt hóa tế bào tiền thân tinh trùng thành các tế bào tinh trùng. Ở
nồng độ FSH 25 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành là 20,67%, khác biệt

có ý nghĩa thống kê với tỉ lệ phầm trăm tinh trùng trưởng thành ở nồng độ FSH là
10 IU/L.
Nồng độ FSH mà tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành đạt cao nhất là 50
IU/L. Ở nồng độ FSH cao hơn 100 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành
có giảm nhưng sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê.


Hình 2. (a) Biểu đồ tác động của FSH lên sự trưởng thành tinh trùng
ở các nồng độ khác nhau. (b) Tác động của FSH và testoteron lên sự trưởng
thành của tế bào mầm sinh tinh.
Như vậy, nồng độ FSH tối thiểu có thể gây tác động lên sự biệt hóa là 25
IU/L. Nồng độ FSH tối ưu là 50 IU/L. Bởi vì ở nồng độ 100 IU/L tỉ lệ tinh trùng
trưởng thành tương đối cao nhưng do sử dụng nồng độ FSH cao gấp hai nên
không được lựa chọn. Thật vậy, nồng độ FSH cao được chứng minh trên người là
có thể gây chết và sự trưởng thành không bình thường của tinh trùng.

Hình 3. Một số dạng tinh trùng sau khi nuôi cấy. (a) Tinh trùng với đuôi
mới hình thành ngắn, thân chưa định hình, phần đầu chưa rõ rệt, (b) Tinh trùng
dị dạng với hai đuôi mọc về hai phía, phần thân và phần đầu chưa hình thành, (c)
Tinh trùng với đuôi tương đối dài, đầu tròn nhưng thiếu phần thân. (d) Tinh
trùng trưởng thành với đuôi dài, phần thân và đầu định hình khá rõ rệt.
Sự tác động của FSH và testosteron
Sau 24 giờ, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành ở lô đối chứng là 11% (tương
đương với tỉ lệ này ở nghiệm thức 1). Ở lô bổ sung Testosteron, tỉ lệ này là
10,67%. Sự sai khác giữa hai lô này không có ý nghĩa thống kê, nghĩa là hầu như
testosteron không tác động lên sự trưởng thành, biệt hóa của tinh trùng. Ở lô bổ
sung FSH với nồng độ 50 IU/L thì tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành là
34,33% (kết quả này cũng tương tự ở nghiệm thức 1). So với lô đối chứng và lô
bổ sung testosteron thì cho thấy, ở nồng độ 50 IU/L, FSH đã có tác động tốt lên
sự biệt hóa, trưởng thành của các tế bào gốc tiền thân tinh trùng.

Ở lô FSH kết hợp với testosteron, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành là
46,33%. Tỉ lệ này cao hơn hẳn so với các lô khác. Như vậy, tuy testosterone
không có vai trò trong sự biệt hóa thành tinh trùng nhưng khi kết hợp với
FSH làm gia tăng tỉ lệ tinh trùng trưởng thành.
Vai trò cụ thể của testosterone chưa được xác định rõ ràng trong nghiên cứu
này, nhưng một số nghiên cứu khác trên người cho thấy testosteron không có vai
trò trong sự biệt hóa thành tinh trùng nhưng testosteron có vai trò duy trì các tế bào
Sertoli (những tế bào đồng nuôi cấy) sẽ giúp Sertoli hỗ trợ các tế bào tiền thân biệt
hóa thành tế bào tinh trùng trưởng thành
(1)
.
Thật vậy, trong nuôi cấy tiến hành trong các thí nghiệm, các mảnh biểu
mô tinh hoàn chứa cả các tế bào Leydig, tế bào Sertoli và tế bào mầm sinh dục
đều được tiến hành nuôi chung (đồng nuôi cấy). Việc nuôi cấy này được đánh
giá cao vì những tế bào hỗ trợ tế bào mầm trong tinh hoàn có vai trò quan trọng
trong sự biệt hóa thành tinh trùng.
KẾT LUẬN
Các tế bào mầm tồn tại trong tinh hoàn chuột có thể thu nhận và nuôi cấy in
vitro. Dưới các tác nhân testosteron và FSH các tế bào mầm sinh dục từ tinh hoàn
có thể biệt hóa thành tinh trùng.
FSH có vai trò quan trọng trong sự kích thích biệt hóa tế bào gốc tiền thân
tinh trùng thành các tế bào tinh trùng. Nồng độ FSH thích hợp nhất cho nuôi cấy là
50 IU/L. Hormone testosteron không có tác động trực tiếp lên sự biệt hóa nhưng
kết hợp với FSH tăng cường sự biệt hóa.
Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ là bước đầu cho thấy khả năng trưởng thành
của tế bào mầm sinh tinh in vitro dưới tác dụng của FSH và testosteron. Việc dựa
vào hình thái xuất hiện đuôi chưa hoàn toàn chính xác để kết luận tinh trùng
trưởng thành. Hơn nữa, việc hư hại trong bộ nhiễm sắc thể khi trưởng thành in
vitro chưa được đánh giá. Do vậy, việc tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về vấn đề này
đang là vấn đề cần thiết.