Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi

NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI
VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG
CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI

Hà Thị Thuý
1
, Trần Thị Hạnh
1
,Nguyễn Hồng Chiên
1
,
Đỗ Năng Vịnh
1
, Vũ Văn Vụ
2
1
Viện di truyền nông nghiệp,
2
Đại học Quốc gia Hà Nội

I. Đặt vấn đề:

Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC -
embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống
citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên
cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát
sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng,
nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể
(Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản
nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹo
phôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra

nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn,
không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000).

Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm
(Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãn
đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn được
tạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15
tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo,
1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấy
mô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and
Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây
(Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầu
nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống
citrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây
(Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho
thấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả
tạo callus và tái sinh phôi tốt nhất.

Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trình
tạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và tái
sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạt
và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.

II. Nguyên liệu và phương pháp:

a/ Nguyên liệu:

Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác
nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du,
Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt

Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai
Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu.

Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi
khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu
nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa
được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành
quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3,
đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ
cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau
thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau.

Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 noãn.
Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả
non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏ
lụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi non
rồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trên
được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.

b/ Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy:

Theo kết quả nghiên cứu nuôi cấy bầu nhuỵ và noãn ở quả
non của một số giống citrus thì môi trường MT (Murashige
& Tucker) là môi trường thích hợp nhất cho tạo callus phôi
hoá (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Vì vậy chúng tôi tiến hành thí
nghiệm nuôi cấy noãn và hạt non trên nền môi trường này.

+Môi trường tạo callus phôi hoá:

- MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5;
0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Malt
extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch.

- MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75;
1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract +
50g/l đường + 5,0g/l thạch.

+ Môi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phôi hoá: MT
+ BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/l
Malt extract + 1,0g/l glutamin

+ Môi trường tạo phôi:

• G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch
• G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch
• BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch

+ Môi trường nẩy mầm phôi vô tính: MS hoặc MT + 30g/l
đường, không có chất điều hoà sinh trưởng.

Môi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Noãn được nuôi trên
đĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml môi
trường thạch, để trong tối.

Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trường
đặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng
( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân mô
sẹo trong tối ở nhiệt độ (25 - 27
o

C). Quá trình phôi hoá của
mô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện có
chiếu sáng 2400 Lx và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày.

III. Kết quả và thảo luận

1.Tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng

Để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng, chúng tôi tiến hành khử
trùng quả non với hai loại hoá chất Ca(ClO)
2
ở nồng độ 6%
và HgCl
2
ở nồng độ 0,01%. Kết quả cho thấy với các chất
khử trùng khác nhau và trong khoảng thời gian khác nhau
thì tỉ lệ tạo mẫu sạch là khác nhau.
Khử trùng bằng Ca(ClO)
2
ở nồng độ 6% trong thời gian 10
và 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch tương ứng là 62,4% và
87,8%. Khử trùng bằng HgCl
2
nồng độ 0,01% trong thời
gian 5 và 10 phút, tỉ lệ tạo mẫu sạch tương ứng là 65,5% và
93%. Như vậy, khử trùng bằng HgCl
2
cho tỉ lệ mẫu sạch rất
cao nhưng sau đó mẫu nhanh chóng bị thâm đen. Hiện
tượng này không thấy xuất hiện khi khử trùng bằng

Ca(ClO)
2
. Vì vậy chúng tôi đã chọn chất khử trùng thích
hợp cho quả non là Hypoclorit canxi - Ca(ClO)
2
ở nồng độ
6% trong thời gian 15 phút.

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi noãn bầu nhuỵ trước
và sau thụ phấn lên khả năng tạo callus phôi hoá(EC).

Trước khi hoa nở 1-2 ngày (trước khi thụ phấn) noãn được
tách ra để nuôi cấy. Sau khi hoa được thụ phấn, cánh hoa
và nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Kích
thước của noãn tăng dần, sự tăng kích thước là kết quả của
quá trình phân bào xảy ra ở các mô khác nhau, trong đó có
lớp tế bào phôi tâm (nucellar), phôi hữu tính nhị bội và nội
nhũ tam bội thể. Kết quả noãn phát triển thành hạt non.

Sau khoảng 2-5 tháng nuôi cấy, chúng tôi quan sát phản
ứng tạo callus phôi hoá từ noãn và hạt non ở các giống
khác nhau. Đối với nuôi cấy noãn trước thụ phấn, chúng tôi
chỉ thu được callus dạng cứng, màu vàng mà không thu
được callus phôi hoá ở tất cả các giống. Đối với hạt non (từ
quả non) có độ tuổi từ 1-8 tuần tuổi, chúng tôi đã thu được
callus phôi hoá ở các giống cam Vân du, cam Sành, quýt
Đường canh và quýt Chum. Riêng với giống bưởi Phúc
Trạch, chúng tôi chưa thành công trong việc tạo callus phôi
hoá mà chỉ thu được dạng callus cứng, màu vàng trắng.

Mô sẹo phôi hoá tạo được từ noãn (hoặc noãn đã được
phân hoá thành hạt non) đã được nhiều tác giả khẳng định
là có nguồn gốc từ mô phôi tâm (Buttton and
Bornman,1971; Gmitter and Moore,1986). Trong một số
trường hợp, mô sẹo phôi hoá đã được tạo ra từ nội nhũ,tuy
nhiên tỷ lệ cây tái sinh từ nội nhũ hạt non rất thấp (Gmitter
et al.,1991).
Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm ở các giống khác nhau, kết quả
thu được được thể hiện ở bảng 1, Biểu đồ 1.