CHƯƠNG VII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT pptx

4/6/2011
1
CHƯƠNG VII.
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
THỰC VẬT
Quá trình chọn lọc tự nhiên
• Trao đổi vật liệu di truyền  tạo ra
những tính trạng mong muốn  gia
tăng sản lượng cây trồng.
• Tính trạng chỉ được tạo ra từ những
dòng hữu thụ.
• Không loại trừ được những tính trạng
không mong muốn.

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
• Giải quyết được những vấn đề trong
chương trình tạo giống cổ điển.
• Nhờ xác định và dòng hóa những gene
chuyên biệt cho tính trạng mong muốn
VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng
thuốc diệt cỏ, chín chậm, …

Overview genetic engineering
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
• Mục đích thay đổi di truyền
• Nguồn, chức năng và khả năng tiếp hợp
bền vững của gene chuyển
• Phân tích thành phần thực phẩm (hàm
lượng dinh dưỡng, độc tố tích lũy,…)

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
• Cây trồng chuyển gene thương mại đầu
tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene
Inc. )
• Ức chế gene tạo enzyme polygalactu-
ronase (PG) phân hủy pectin nhờ
chuyển antisense gene

Dòng hóa gene đích
• Nguồn gene đích có thể là DNA nhiễm
sắc thể hay cDNA từ mRNA
• Enzyme công cụ
• Vector tạo dòng

4/6/2011
2
Các enzyme công cụ
• Restriction
enzymes
(Enzyme cắt
giới hạn)
• Ligase
(Enzyme nối)


Cho trình tự DNA:
5’… CCTAGATCTTTAACC…TAGATCTAA…3’
3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’
A) Xử lý DNA trên với enzyme giới hạn
BgIII (A/GATCT). Sẽ thu được mấy đoạn

DNA trong 2 trường hợp DNA đã cho là
mạch thẳng và mạch vòng. Vẽ các đoạn
DNA được phóng thích (nếu có)
B) Có thể xen đoạn DNA được phóng thích
vào vector được cắt bởi enzyme BamHI
(G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa
Các vector tạo dòng
 Phage λ:
• DNA sợi đôi thẳng
• Kích thước: 48,5 kb
• Chèn DNA có kích thước 18-25 kb


Electron micrograph of bacterial
phage from the host
E. coli

Các vector tạo dòng
 Phage M13:
• DNA sợi đơn vòng
• Kích thước: 6,4 kb
• Nhiều dạng biến đổi của M13 có mang
các polylinker (hay MCS)


Các vector tạo dòng
 Plasmid:
• DNA vòng sợi kép, nằm ngoài NST VK
• Chèn DNA có kích thước 18-25 kb

pBR322
pBR322
4361 bp
pBR322
4361 bp
4/6/2011
3
Các vector tạo dòng
 Cosmid:
• Là vector plasmid chứa gene
cos
của
phage λ Tái bản giống plasmid
• Chèn được đoạn DNA lớn (35-45 kb)


Các vector tạo dòng
 Phagemid:
• Là sự kết hợp giữa phage M13 với
plasmid



Tạo plasmid tái tổ hợp
Xây dựng DNA library
• Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ
thuộc vào tính trạng mong muốn
chuyên biệt và vào hệ phương pháp
• Tập hợp những đoạn DNA hay cDNA

được gắn vào vector thích hợp
(plasmid hay phage)
• Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số
lượng và chọn lọc  DNA library


Xây dựng
DNA library
Sàng lọc gene mục tiêu
1. Chọn lọc:
• Vector mang gene kháng kháng sinh
(tetracyclin, penicillin hay ampicillin)
• Chỉ có dòng nào chứa vector mới sống
được trên môi trường chọn lọc có chứa
chất kháng sinh

Sàng lọc gene mục tiêu
2. Sàng lọc:
• Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase
thủy giải X-gal tạo sản phẩm có màu
xanh lam
• Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’  mất
khả năng thủy phân X-gal  khuẩn lạc
không có màu xanh

4/6/2011
4

Xây dựng DNA library
Sàng lọc gene mục tiêu

3. Xác định gene đích:
• Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc
• Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến
tính DNA có chứa các probe đánh dấu
phóng xạ
• Tìm vết phóng xạ
• So sánh với đĩa Petri ban đầu



Screening DNA library

Các phương pháp
chuyển gene:
• Gián tiếp qua
Agrobacterium
•
Tr
ự
c ti
ế
p: PEG,
xung đi
ệ
n, b
ắ
n
gene

Chuyển gene gián tiếp nhờ

Agrobacterium

•
Agrobacterium
sống
lân cận hay ngay
trên bộ rễ  xuyên
qua các vết thương
 tổ chức tế bào
thực vật phát sinh
bướu
4/6/2011
5
Chuyển gene gián tiếp nhờ
Agrobacterium

• Tác nhân gây tạo bướu là Plasmid Ti của
vi khuẩn
Chuyển gene gián tiếp nhờ
Agrobacterium

• Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA
• Sự di chuyển của T-DNA vào tế bào
thực vật chịu sự quy định của gene
vir


Chuyển gene gián tiếp nhờ
Agrobacterium

• Loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine
của T-DNA và thay thế vào đó là các marker
chọn lọc. Gen chuyển được xen vào giữa các
vùng bờ của T-DNA.
Chuyển gene gián tiếp nhờ
Agrobacterium

• Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với
nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công
vào hệ thống tổ chức của tế bào một
cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm
bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi
khuẩn.


Chuẩn bị
Agrobacterium
mang plasmid Ti chứa
gene đích:
• Sàng lọc
E.coli
chứa
gene đích
• Tiếp hợp giữa
E.coli
và
Agrobacterium

• Tái tổ hợp tương đồng
giữa 2 plasmid

4/6/2011
6
Quy trình chuyển gene
nhờ
Agrobacterium

• Chuẩn bị mô cấy và dịch huyền phù VK
• Ngâm chung mô với vi khuẩn
• Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày)
• Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh
• Cấy chuyền mô sang môi trường có tác
nhân chọn lọc
• Tái sinh cây chuyển gene

Một vài yếu tố ảnh hưởng
đến hiệu quả biến nạp
• Loại mô được biến nạp
• Giai đoạn phát triển của mô
• Mức độ khởi đầu của vi khuẩn
A.
tumefaciens
sử dụng
• Môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp
• Marker được sử dụng để chọn lọc thể biến
nạp
• Loại vector sử dụng
• Kiểu gen của thực vật.
Chuyển gene gián tiếp nhờ
Agrobacterium

• Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ
Agrobacterium
là có hiệu quả đối với một số
loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể
được biến nạp bằng con đường này.
• Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây
ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì
và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ
A. tumefaciens
.
Các phương pháp
chuyển gene:
• Gián tiếp qua
Agrobacterium
•
Tr
ự
c ti
ế
p: PEG,
xung đi
ệ
n, b
ắ
n
gene

• Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào
thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo

protoplast  Chuyển gene trực tiếp
bằng cơ chế vật lý đơn giản, không cần
có vector.
• Để nâng cao hiệu quả biến nạp, xử lý
protoplast với PEG hoặc dùng xung
điện.

4/6/2011
7
Chuyển gene bằng xung
điện
• Là một phương pháp cơ học
• Màng tế bào không cho các phân tử
phân cực như DNA tự do đi qua
• Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái
tương đối yếu của các tương tác kỵ nước
của phospholipid kép và khả năng tập hợp
lại một cách tự động của nó sau khi bị rối
loạn.  Xung điện chớp nhoáng có thể gây
rối loạn ở các vị trí của màng một cách
nhất thời, làm cho các phân tử phân cực
có thể đi qua nhưng sau đó màng có thể
đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không
bị ảnh hưởng gì cả.
Chuyển gene bằng xung
điện
• B1: Các tế bào chủ và DNA ngoại lai
được tạo thành dịch huyền phù và cho
vào trong một cuvette nhựa có điện
cực

Chuyển gene bằng xung
điện
• B2: Tạo xung điện bằng máy xung gene
(gene pulser)

• CT1 đóng: tụ
điện nạp điện
và tích một
điện áp cao
• CT2 đóng: điện
áp phóng qua
dịch huyền phù
tế bào
Chuyển gene bằng xung
điện
• Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm
2
(thay
đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong
vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây
 tạo ra các lỗ tạm thời
• Các phân tử đã được nạp điện đi qua màng tế
bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương
tự như điện di
4/6/2011
8

Ưu điểm
• Với một số cây một lá mầm quan trọng
(loài lúa phụ

Japonica
, ngô, lúa mì) mà
không thể thể thực hiện được bằng
phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ
Agrobacterium
thì người ta đã thành
công với phương pháp này. Hiệu quả
biến nạp cao.
• Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có
kích thước lớn.
• Nếu các xung điện có cường độ và
chiều dài không đúng thì một số lỗ của
tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng
không thể đóng lại sau khi tế bào
phóng điện, làm cho tế bào bị tổn
thương hoặc bị thủng
Nhược điểm
• Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA
ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong
suốt thời gian điện biến nạp là tương
đối không đặc hiệu. Điều này dẫn đến
kết quả là không cân bằng ion mà sau
đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế
bào và tế bào chết
Nhược điểm
• Phải tạo protoplast, tái sinh
protoplast không đơn giản, tốn nhiều
công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu
tố môi trường.
Nhược điểm

Chuyển gene bằng PEG
• PEG tạo ra các lỗ tạm thời trên màng
tế bào  giúp DNA thấm vào trong tế
bào.
• Tần số chuyển gene bằng phương pháp
này không cao
• PEG còn gây kết dính tế bào trần 
ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào
4/6/2011
9
Các phương pháp
chuyển gene:
• Gián tiếp qua
Agrobacterium
•
Tr
ự
c ti
ế
p: PEG,
xung đi
ệ
n, b
ắ
n
gene

Chuyển gene bằng súng
bắn gene
• Tên chính xác: hệ thống phân phối hạt

biolistic (biolistic particle delivery
system; biolistics = biology +
ballistics).
• Là một thiết bị sử dụng để đưa thông
tin di truyền vào tế bào, được thiết kế
đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai
vào tế bào thực vật.
Chuyển gene bằng súng
bắn gene
• Gồm 2 buồng bằng thép không gỉ nối
với 2 bơm chân không
Chuyển gene bằng súng
bắn gene
• Nguyên lý chung của phương pháp này
là sử dụng áp lực xung của khí helium
để gia tốc các hạt.
• Ðạn sử dụng cho loại súng này là các
hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc
DNA.
Chuyển gene bằng súng
bắn gene
• DNA được gắn vào các hạt tungsten (vàng,
bạc) có đường kính khoảng 1μm
• Các hạt này được đặt bên trên một cái đĩa ở
mặt bên trong của súng
• Sự bùng nổ khí ở 1000psi làm cho đĩa bắn về
phía trước
• Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt
tungsten được phóng về các tế bào đích

4/6/2011
10
Chuyển gene bằng súng
bắn gene
• Mục tiêu của súng bắn gene thường là
callus nuôi trên đĩa petri
• Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel
và callus bị phá hủy nhiều nhưng cũng
có một số tế bào tiếp nhận hạt
tungsten được bao bọc DNA  DNA
xâm nhập và hợp nhất vào NST

Ưu điểm
• Thao tác dễ dàng
• Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế
bào, mô
• Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống
sót cao
• Cho phép đưa các gene vào tế bào ở vị
trí mong muốn
Xác nhận gene chuyển
(nhờ reporter gene)
• Gene mã hóa
β
-
glucuronidase
(GUS)
phân giải X-glucuronide (X-gluc) là
một reporter gene hữu hiệu
• Mô thực vật được chuyển gene có màu

xanh


4/6/2011
11

Phương pháp phát hiện
• Khi gene đã được dòng hóa và chuyển
và tế bào chủ, cần phải xác nhận xem
gene lạ có được sát nhập vào NST vật
chủ hay không
• Có thể sử dụng 2 phương pháp
Southern blot hay Northern blot
Phương pháp Southern blot
• DNA được cắt bởi một hay vài
restriction enzyme  tạo ra các phân
đoạn DNA
• Tách các phân đoạn DNA nhờ điện di
trên gel agarose
• DNA trên gel được biến tính tạo mạch
đơn
• Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực
mao dẫn
Phương pháp Southern blot
• DNA được gắn lên màng là bản sao của
DNA trên gel
• Lai với probe có đánh dấu phóng xạ và
có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai
• Loại bỏ probe không gắn lên màng
• Xác nhận sự hiện diện của DNA ngoại

lai trong cây được chuyển gene
Phương pháp Northern blot
• Tương tự như Southern blot
• Sử dụng mRNA thay vì DNA
• mRNA mạch đơn  không cắt bằng
restriction enzyme
• Probe là các cDNA bổ sung với mRNA
của gene được chèn
• Điểm bất lợi lớn nhất của tất cả các
phương pháp chuyển gene trực tiếp là
các DNA ngoại lai có xu hướng tái sắp
xếp, tái tổ hợp dẫn tới hiện tượng sát
nhập nhiều đoạn DNA và tái sắp xếp
các đoạn gene chuyển.
• Những cụm gene này dễ dẫn đến hiện
tượng tái tổ hợp nội tại  transgene
silencing.
 Sử dụng vật liệu chuyển gene trực
tiếp là đoạn DNA thuần
4/6/2011
12

Nghiên cứu chuyển gene
trên thế giới
• Chuyển gene chịu mặn từ các loài cây
Đước (Rhizophoraceae) vào cây lúa.
• Chuyển gene Bt vào nhiều loại cây
trồng như lúa, bông, ngô, đậu tương,…
• Chuyển các gene tham gia vào quá
trình quang hợp của cây C

4
vào cây C
3

để tăng hiệu suất quang hợp
• Chuyển gene cố định đạm (nif gene)
vào cây lúa
Nghiên cứu chuyển gene
trên thế giới
• Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào
cây lúa
• Chuyển gene chín chậm (ripening delay
gene) vào cây cà chua
• Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa
bệnh và có tác dụng làm dược phẩm:
gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp
vitamin A,…
 Tăng năng suất cây trồng, tăng chất
lượng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi
trường
Một số nghiên cứu chuyển
gene ở Việt Nam
Chuyển gene kháng sâu đục
thân vào cây lúa
Nguy
ễ
n H
ữ
u H
ổ

, Nguy
ễ
n Văn Uy
ể
n, Karabi Datta,
Swapan Kumar Datta (Vi
ệ
n sinh h
ọ
c nhi
ệ
t đ
ớ
i,
Vi
ệ
n lúa Qu
ố
c t
ế
)

• Vật liệu: giống lúa Nàng Hương Chợ Đào
• Môi trường nuôi cấy mô lúa: MS có bổ
sung 2,4-D (tạo mô sẹo) hoặc NAA,
Kinetin (tái sinh cây)
• Chủng VK
Agrobacterium tumerfasiens
:
LBA4404 mang plasmid pBIN-BAR-

UBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp giữa
cryIA và cryIB, gene Bar
4/6/2011
13
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn: duy trì vi khuẩn
trên môi trường thạch LB có chứa 50
mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifampicin.
Tăng sinh trên môi trường AB lỏng lắc
có chất kháng sinh trước khi gây nhiễm
cho tế bào lúa
• Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa đã
khử trùng được nuôi cấy trên môi
trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D 
mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
• Gây nhiễm: mô sẹo có khả năng phát
sinh phôi được gây nhiễm với dịch vi
khuẩn (OD=2) có chứa Acetosyringone
• Chọn lọc: cụm mô được rửa lại bằng nước
cất vô trùng có bổ sung 500 mg/l
Cefotaxime  Nuôi cấy trên môi
trường chọn lọc có Phosphinothricin (3
mg/l)  Cấy chuyền mô kháng PPT sang
môi trường chọn lọc từ 3-4 lần

• Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung
0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l
Cefotaxim, có hoặc không có PPT
• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho
gene bar, sau đó chạy điện di trên gel
agarose

• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin
Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng
vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA
• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện
protein cryIAb/cryIAc

• Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung
0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l
Cefotaxim, có hoặc không có PPT
• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho
gene bar, sau đó chạy điện di trên gel
agarose
• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin
Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng
vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA
• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện
protein cryIAb/cryIAc

• Thí nghiệm Southern blot: sử dụng
enzyme giới hạn Hind III đối với gen
cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I đối với
gen bar.
• Thử tính kháng thuốc diệt cỏ thương
mại Basta: theo dõi hiện tượng cháy lá
• Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm)
cho vào đĩa petri, đặt 6 con sâu đục
thân lên đoạn thân  tính tỉ lệ số sâu
chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho
vào đĩa