NGUYÊN TẮC VÀ KỸ THUẬT TRỮ LẠNH PHÔI NGƯỜI GIỚI THIỆU pot

NGUYÊN TẮC VÀ KỸ THUẬT TRỮ
LẠNH PHÔI NGƯỜI

GIỚI THIỆU
Hiện nay, kỹ thuật điều trị vô sinh bằng thụ tinh trong ống nghiệm gắn
liền với kích thích buồng trứng nhằm thu được nhiều trứng, tạo được nhiều
phôi qua đó có được một số phôi tốt để chuyển trở lại vào tử cung của người
mẹ. Kích thích buồng trứng sẽ có khả năng thừa phôi, nhưng nếu không kích
thích buồng trứng thì tỷ lệ điều trị thành công sẽ thấp do ít phôi tốt. Mặt
khác, nếu chuyển nhiều phôi sẽ tăng tỷ lệ đa thai, nhưng nếu đơn thuần hủy
phôi thừa là điều đáng tiếc, thậm chí bị cấm ở một số quốc gia. Trước những
mâu thuẫn đó trữ phôi để chuyển sau này có thể xem là câu trả lời thích hợp
nhất.
Phôi động vật đầu tiên được trữ thành công là phôi chuột vào năm
1972
(20)
. Tiếp sau đó, kỹ thụật trữ phôi được phát triển và áp dụng cho trữ
phôi gia súc. Mãi đến năm 1983 phôi người đầu tiên mới được trữ thành
công
(13)
. Trong một thời gian ngắn kỹ thuật trữ phôi được nghiên cứu phát
triển, các quy trình trữ được đơn giản và tối ưu hóa. Kể từ đó, kỹ thuật trữ
phôi trở thành một bộ phận không thể thiếu của kỹ thuật điều trị vô sinh
bằng thụ tinh trong ống nghiệm.
Xét về tính chất, so với trữ phôi thì trữ trứng giúp hạn chế được những
rắc rối pháp lý về quyền sở hữu phôi cũng như giúp cho việc cho trứng đơn
giản và an toàn hơn. Tuy nhiên xét về kỹ thuật, mặc dù trữ trứng động vật
(18)

cũng như trứng người
(3)

đã được thực hiện thành công, hiệu quả của kỹ thuật
này vẫn còn rất thấp
(3,16)
.Vào thời điểm hiện nay chỉ có kỹ thuật trữ phôi là
khả thi để áp dụng trên lâm sàng.
Tại Việt Nam, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trong những năm
qua đã đạt được thành công ổn định và đang đi vào giai đoạn phát triển. Kỹ
thuật trữ phôi nếu được áp dụng thành công sẽ càng làm tăng thêm hiệu quả
của điều trị, giảm chi phí cho bệnh nhân và hạn chế tỷ lệ đa thai. Trong
tương lai không xa, khi thụ tinh trong ống nghiệm được triển khai rộng rãi
trên cả nước thì càng có nhiều bệnh nhân có nhu cầu và được hưởng lợi từ
trữ phôi. Nói cách khác, trữ phôi sẽ trở thành loại dịch vụ mà một trung tâm
thụ tinh trong ống nghiệm hoàn chỉnh cần phải có.
NGUYÊN TẮC CỦA TRỮ LẠNH
Để trữ tế bào sống trong một thời gian dài thì tất cả hoạt động chức
năng bên trong tế bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196
o
C) hầu
hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại
dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian như ngừng trôi đối
với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ là bức
xạ từ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế yếu tố này không quan trọng và
một nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một
lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển
bình thường sau khi rã đông, và chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh
nào
(4)
. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến thành công của trữ lạnh chính là giai
đoạn làm lạnh và rã đông.
Những thay đổi bên trong tế bào khi làm lạnh

Để đạt được nhiệt độ trữ, tế bào sống phải được làm lạnh từ nhiệt độ
sống (thân nhiệt đối với tế bào động vật) xuống đến -196
o
C. Quá trình này
gây ra một số thay đổi trong môi trường và cả trong tế bào có khả năng ảnh
hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào được trữ:
Giảm tốc độ hoạt động của enzyme.
Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37
o
C xuống còn 7
o
C, hoạt
động của enzyme giảm 8 lần. Tuy nhiên ảnh hưởng của giảm hoạt động
enzyme lên tế bào vẫn chưa được làm sáng tỏ.
Giảm độ hòa tan của các khí trong môi trường.
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào
thường dùng CO
2
làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm
lạnh, các khí này không còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt
khí có khả năng làm tổn hại đến tế bào
(1)
.
Hình thành tinh thể nước đa
Nước trong môi trường khi lạnh dưới 0
o
C khoảng 10-15
o
C sẽ dần kết
tinh thành những tinh thể nước tinh khiết. Hiện tượng này xảy ra do môi

trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản lạnh có nhiệt độ đông đá
thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như
sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và
các bào quan
(1)
.
Tăng nồng độ chất hòa tan trong môi trường
Đây là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Khi nước chuyển
sang dạng tinh thể tinh khiết, lượng nước ở thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ
các chất hòa tan tăng lên gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu, kéo nước từ
bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng lipoprotein của tế bào
(7)
.
Tăng nhiệt độ tiềm ẩn
Đây cũng là một hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Phân tử
nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng. Nếu
nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để
làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0
o
C. Thay
đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau khi rã đông
(19)
.
Biện pháp hạn chế tác động của làm lạnh
Để giải quyết những tác động gây nên trong quá trình làm lạnh nêu
trên, ba biện pháp kỹ thuật chính được sử dụng:
Kiểm soát tốc độ làm lạnh
Tốc độ làm lạnh càng nhanh thì tinh thể tạo ra bên trong tế bào càng
nhiều. Tùy theo thể tích và diện tích màng bào tương mà mỗi loại tế bào có
tốc độ làm lạnh để trữ tối ưu khác nhau. Với tế bào trứng và phôi người, tốc

độ tối ưu theo nghiên cứu là 0,3
o
C/phút. Tốc độ này cho phép sự trao đổi
nước qua màng có thể diễn ra trước khi hoàn toàn chuyển thành thể rắn.
Sử dụng chất bảo quản lạnh.
Nếu làm lạnh càng chậm thì giảm được sự hình thành tinh thể bên
trong tế bào, giảm tổn thương bào quan. Tuy nhiên thời gian tế bào tiếp xúc
với môi trường có nồng độ chất hòa tan cao càng lâu thì tế bào càng bị tổn
thương màng bào tương. Để giải quyết mâu thuẫn này, chất bảo quản lạnh
được đưa vào sử dụng
(11)
. Đây là những chất tan trong nước, có khả năng tạo
liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế
bào. Với những tính chất này, chất bảo quản xâm nhập và thay chỗ cho nước
bên trong tế bào, giúp làm giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào
và giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đá.
Do không tạo thành tinh thể, chất bảo quản lạnh hạn chế sự gia tăng
nồng độ của chất hòa tan. Nó còn kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế
bào. Tuy nhiên, những ghi nhận về hiệu quả của từng loại chất bảo quản
khác nhau lên từng loại tế bào khác nhau (ví dụ như phôi ở những giai đoạn
khác nhau) chỉ dựa trên quan sát thực tế, cơ chế chưa được chứng minh. Bốn
loại chất bảo quản lạnh hiện đang được sử dụng trong trữ phôi là Glycerol,
Dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol (hay propylen glycol) và 1,2-ethanediol
(hay ethylene glycol). Đây là những chất bảo quản lạnh nội bào vì có khả
năng xâm nhập tế bào.
Một số đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được xem
như những chất bảo quản lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản
lạnh nội bào. Các chất này (thường là mono-, di- hoặc tri-saccharide) có tác
dụng làm giảm áp lực thẩm thấu bên ngoài tế bào, đồng thời giúp giảm
lượng nước bên trong tế bào để giảm tổn thương do hình thành tinh thể nước

đá.
Khởi phát sự tạo thành tinh thể nước đá. Biện pháp này nhằm hạn chế
sự tăng nhiệt độ tiềm ẩn do các tinh thể nước được tạo điều kiện để hình
thành dần dần. Ở khoảng -7
o
C, môi trường được cho tiếp xúc một vật có
nhiệt độ rất lạnh. Tinh thể nước đá hình thành từ điểm tiếp xúc sẽ kích thích
hình thành các tinh thể khác dần dần lan tỏa khắp môi trường. Kỹ thuật này
được gọi là tạo mầm tinh thể, giúp hạn chế hiện tượng tăng nhiệt độ tiềm
ẩn qua đó tránh được tác động của tăng nhiệt độ tiềm ẩn
(19)
.
Ảnh hưởng của bảo quản và rã đông
Như đã trình bày trong phần trước, tế bào có thể được bảo quản ở tình
trạng đông lạnh trong nhiều năm. Quá trình rã đông đưa tế bào từ nhiệt độ
bảo quản là -196
o
C trở lại nhiệt độ sống ban đầu của tế bào. Qui trình rã
đông có liên hệ chặt chẽ với qui trình làm lạnh, hay cụ thể hơn là phụ thuộc
vào lượng tinh thể nước đá còn lại bên trong tế bào. Hiện tượng tái kết tinh
hóa xảy ra trên những tinh thể này khi rã đông có khả năng tạo nên những
tinh thể lớn làm tổn thương tế bào. Do vậy tốc độ rã đông phải đủ nhanh để
hạn chế hiện tượng tái kết tinh hóa xãy ra.
Mặc khác, tốc độ rã đông lại không được quá nhanh để nước có thể
kịp trở lại vào bên trong tế bào. Với việc sử dụng chất bảo quản lạnh, phác
đồ làm lạnh và rã đông đối với phôi đã được đơn giản hóa, thời gian thực
hiện cũng được rút ngắn. Ứng với tốc độ làm lạnh 0,3
o
C/phút thì tốc độ rã
đông có thể đạt tới 300

o
C/phút. Cuối cùng phôi được rửa sạch các chất bảo
quản lạnh để tiếp tục nuôi cấy trong môi trường.
Làm lạnh cực nhanh (Vitrification)
Đây là kỹ thuật mới ứng dụng hiện tượng đông đặc của nước khi giảm
nhiệt độ thật nhanh. Khi này nước không chuyển thành nước đá (ice) thông
qua thành lập tinh thể nước đá (crystallization) mà chuyển thành dạng kính
(glass). Ở dạng kính, phân tử nước cũng như các chất hòa tan khác được giữ
nguyên vị trí. Kỹ thuật này có ưu điểm là giúp tế bào trữ lạnh tránh được
những tổn thương do hiện tượng hình thành tinh thể nước đá gây ra
(12)
.
Tuy nhiên chất bảo quản với được dùng trong kỹ thuật này có nồng độ
rất cao, có khả năng gây nên những tổn thương về cấu trúc di truyền cho tế
bào. Có lẽ đây là lý do tại sao phôi sau trữ có cấu trúc và phát triển rất tốt
khi nuôi trong ống nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất
thấp. Người ta cho rằng thành công của phương pháp phụ thuộc vào loại và
cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản
lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực
hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá.
Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực tế nhưng tiềm năng của
nó rất lớn vì tính đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm
đang được sử dụng
(14)
.
CÁC KỸ THUẬT TRỮ LẠNH PHÔI
Dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên, những phác đồ
trữ phôi được đưa ra và hoàn chỉnh dần. Hai phác đồ được sử dụng rộng rãi
hiện nay áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi nang) và cho giai đoạn
muộn (phôi nang).

Trữ phôi giai đoạn sớm
Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay cho giai đoạn này là 1,2
propanediol (PROH). Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) là loại chất bảo
quản lạnh được sử dụng thành công đầu tiên ở người nhưng phác đồ dùng
DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh cũng như rã đông nên ít
được dùng hơn. Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng kèm với
sucrose để làm chất bảo quản bên ngoài tế bào
(9)
.
Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản
là môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phôi có bổ sung
20% huyết thanh. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi
trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và
sucrose trong từng môi trường là:
- Làm lạnh 1: 1,5M PROH (15 phút)
- Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (5 phút)
Sau đó phôi được cho vào các ống trữ thể tích khoảng 0,25ml và trữ
theo chương trình:
- Từ nhiệt độ phòng xuống -7
o
C: giảm 1-2
o
C/phút
- Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước
khi chạm vào thành ống trữ phôi
- Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30
o
C: giảm 0,3
o
C/phút

- Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50
o
C/phút, hoặc có thể cho trực
tiếp vào nitơ lỏng
Đến lúc này phôi được giữ liên tục trong nitơ lỏng. Chỉ đến lúc sử
dụng phôi mới được rã đông. Với chất bảo quản lạnh là PROH, ống chứa
phôi có thể được làm rã đông bằng cách giữ trong không khí trong 30 giây,
sau đó nhúng vào nước ấm 37
o
C trong 60 giây. Ngược với trước khi làm
lạnh, sau khi rã đông, phôi lại được chuyển lần lượt qua các môi trường khác
nhau để rửa sạch chất bảo quản lạnh vốn có thể gây độc cho phôi. PROH có
nồng độ giảm dần để tránh sự thoát nước quá nhanh ra khỏi phôi. Thời gian
phôi được giữ trong mỗi môi trường ra đông là 5 phút:
- Rã đông 1: 1M PROH – 0,2M sucrose
- Rã đông 2: 0,5M PROH – 0,2M sucrose
- Rã đông 3: 0,25M PROH – 0,2M sucrose
- Rã đông 4: 0M PROH – 0,2M sucrose
Sau môi trường rã đông 4, phôi được cho trở lại vào môi trường cấy.
Chất lượng phôi sau khi rã đông được kiểm tra sau 1 giờ. Ở một số trung
tâm, phôi sau khi rã đông được nuôi cấy 1 ngày để xem khả năng phát triển
của phôi trước khi chuyển trở lại vào buồng tử cung.
Trữ phôi giai đoạn muộn
Các bước trữ phôi cũng tương tự như trữ phôi giai đoạn sớm. Tuy nhiên
chất bảo quản lạnh là Glycerol. Nồng độ glycerol dùng trước khi làm lạnh là:
- Làm lạnh 1: Glycerol 5% (10 phút)
- Làm lạnh 2: Glycerol 9% trong môi trường chứa sucrose (10 phút)
Môi trường sau khi rã đông là:
- Sucrose 0,5M (10 phút)
- Sucrose 0,2% (10 phút)

Đánh giá hiệu quả trữ phôi
Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng
sống của phôi sau khi rã đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của
phôi trong môi trường nuôi cấy và cấp độ thứ ba là khả năng phát triển của
phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ. Ở cấp độ 1, phôi được
đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống (survival index)
tính bằng tỷ lệ tế bào còn sống trên tổng số tế bào. Cấp độ 2 đánh giá phôi
sau 24 giờ, biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống
trên tổng số phôi được rã đông. Cấp độ 3, cũng là cấp độ quan trọng nhất, là
tỷ lệ phôi làm tổ sau khi chuyển.
So với trữ phôi giai đoạn sớm, trữ phôi giai đoạn muộn có tỷ lệ sống
sau trữ lớn hơn do thể tích tế bào trong phôi nhỏ hơn. Tuy nhiên khó khăn
cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi
cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang (blastocyst). Để đạt được điều này,
một mặt bệnh nhân phải có nhiều phôi, mặt khác quy trình nuôi cấy phôi
phải thật tốt. Hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu đối chứng đủ mạnh để so sánh
hiệu quả của trữ phôi giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Thực tế cho thấy ở
những quốc gia không cho phép trữ phôi giai đoạn muộn như Đức, việc trữ
phôi ngay cả ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus) vẫn có giá trị lâm sàng.
Những điểm cần lưu ý trong kỹ thuật trữ lạnh
Tạo mầm tinh the
Đây là bước quyết định thành công của kỹ thuật làm lạnh chậm. Mặc
dù hiện nay các máy làm lạnh đều có tùy chọn tạo mầm tinh thể tự động
nhưng độ tin cậy vẫn không bằng thao tác bằng tay có kiểm soát.
Huyết thanh
Mặc dù cơ chế của việc dùng huyết thanh trong trữ lạnh phôi chưa
được làm rõ nhưng các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng dùng huyết thanh trong
môi trường trữ lạnh giúp gia tăng tỷ lệ có thai cũng như tỷ lệ thai làm tổ sau
khi chuyển phôi
(17)

. Tuy nhiên dùng huyết thanh trong trữ lạnh làm gia tăng
nguy cơ các bệnh truyền nhiễm cũng như phải chấp nhận tính không ổn định
của huyết thanh với rất nhiều thành phần không thể xác định được.
Thao tác thực hiện và thời gian lưu trư
Nghiên cứu cho thấy chỉ 40 giây ở nhiệt độ phòng có thể ảnh hưởng
đến chất lượng phôi đang được trữ lạnh
(15)
. Vì vậy, yêu cầu thao tác trong
quy trình trữ lạnh rất quan trọng. Cho đến nay, tuy có báo cáo rằng khả năng
sống của phôi giảm đi sau 4 năm lưu trữ
(10)
, nhiều báo cáo khác cho thấy
phôi có thể trữ an toàn trong thời gian kéo dài đến 8 năm
(2,6)
, và hầu hết
thống nhất cho rằng khả năng sống và làm tổ của phôi không bị ảnh hưởng
trong khoảng thời gian tối đa được chấp nhận là 5 năm.
Chuẩn bị nội mạc
Tuy không trực tiếp liên quan đến quy trình trữ lạnh nhưng đây là một
trong những yếu tố quyết định thành công của chương trình trữ lạnh phôi
(10)
.
Phôi có thể được chuyển trong chu kỳ tự nhiên, nhưng với những bệnh nhân
có rối loạn về rụng trứng như nhóm bệnh nhân buồng trứng đa nang thì đồng
bộ hóa (synchronization) tử cung và phôi là điều kiện tiên quyết.
KẾT LUẬN
Trữ lạnh giúp tăng thêm cơ hội thụ thai cho bệnh nhân điều trị vô
sinh. Trữ lạnh còn cho phép chủ động hơn trong điều trị vô sinh, cho phép
chuyển phôi với số lượng giới hạn để giảm tỷ lệ đa thai, hoặc hoãn chuyển
phôi nếu có nguy cơ quá kích buồng trứng nặng. Đối với kỹ thuật cho phôi

hoặc cho trứng, trữ phôi cho phép thực hiện quy trình an toàn vì có thời gian
phát hiện những bệnh truyền nhiễm trong thời gian cửa sổ.
Kỹ thuật trữ phôi hiện được áp dụng thường quy ở các trung tâm thụ
tinh trong ống nghiệm trên thế giới với kết quả ổn định. Ở Việt Nam, kỹ
thuật trữ lạnh phôi cần được nghiên cứu để áp dụng trong tình hình hiện nay.
Hy vọng trong tương lai không xa sẽ có những hướng dẫn cụ thể có tính
cách pháp lý làm cơ sở cho việc phát triển và ứng dụng kỹ thuật này trong
điều trị.
Cám ơn
Cám ơn Bs Hồ Mạnh Tường đã đọc và góp ý cho bài.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. ASHWOOD-SMITH MJ (1986). The cryopreservation of
human embryos Hum Reprod 5: 319-32
2. AVERY S, MARCUS S, SPILLANNE S et al. (1995). Does
the length of storage time affect the outcome of frozen embryo replacement?
J Assist Reprod Genet 1: 67S
3. CHEN C (1986). Pregnancy after human oocyte
cryopreservation Lancet 1: 884-6
4. GLENISTER PH, LYON MF (1997). Long term storage of
eight-cell mouse embryos at -196oC IVF 3: 20-7
5. KHOA HIếM MUộN – BệNH VIệN PHụ SảN Từ DŨ Báo cáo
hoạt động 2001
6. LIN YP, CASSIDENTI DL, CHACON RR et al. (1995).
Successful implantation of frozen sibling embryos is influenced by the
outcome of the cycle from which they were derived Fertil Steril 63: 262-7
7. LOVELOCK JE (1953). The mechanism of the protective
action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing Biochem
Biophys Acta 11:28-36
8. MANDELBAUM J (1995). Embryo freezing in human: an
overview In: Hedon B, Bringer J, Mares P eds. Fertility and Sterility-a

current overview. Proceedings of the 15
th
World Congress on Fertility and
Sterility 419-3
9. MANDELBAUM J, JUNCA AM, PLACHOT M et al. (1987).
Human embryo cryopreservation, extrinsic and intrinsic parameters of
succes Hum Reprod 2: 709-15
10. MANDELBAUM J, PLACHOT M, JUNCA AM et al. (1994).
Human embryo cryopreservation in an IVF program. Limits, facts, prospects
In: Mori T, Aono T, Tomminaga T, Hiroi M eds. Frontiers in
endocrinology. Ares Serono Symposia 505-12
11. POLGE C, SMITH AU, PARKES AS (1949). Retrieval of
spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperature Nature
164: 666
12. RALL WF, FAHY GM (1985). Ice-free cryopreservation of
mouse embryos at -196oC by vitrification Nature 313: 573-5
13. TROUNSON A, MOHR L (1983). Human pregnancy following
cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo Nature 305:
707-9
14. TROUNSON AO, SJOBLOM P (1988). Cleavage and
development of human embryos in vitro, after ultra rapid freezing and
thawing Fertil Steril 50:373-6
15. TYLER JPP, KIME L, COOKE S et al. (1996). Temperature
change in cryo-containers during short exposure to ambient temperature
Hum Reprod 11:1510-2
16. VAN UEM JF, SIEBZEHNRUEBL ER, SCHUUH B, KOCH R
et al. (1987). Birth after cryopreservation of unfertilized oocytes Lancet
3:752-3
17. WARNES GM, PAYNE D, JEFFREY R et al. (1997). Reduced
pregnancy rates following the transfer of human embryos frozen or thawed

in culture media supplemented with normal serum albumin Hum Reprod 12:
1525-30
18. WHITTINGHAM DG (1977). Fertilization in-vitro and
development to term of unfertilized mouse oocytes previously stored at -
196oC J Reprod Fertil 49: 89-94
19. WHITTINGHAM DG (1977). Some factors affecting embryo
storage in laboratory animals Amsterdam: Ciba foundation 97-108
20. WHITTINGHAM DG, LEIBOSP, MAZUR P (1972). Survival
of mouse embryos, frozen to -196oC and -289oC. Science 178: 411-4