Các kỹ thuật chẩn đoán lao tại BV Phạm Ngọc Thạch

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO
ĐANG ÁP DỤNG TẠI BV.PNT
KHOA VI SINH BV.PHẠM NGỌC THẠCH
ISO 15189 - 2007 1
CÁC YÊU CẦU CHO MỘT XÉT NGHIỆM
VI SINH CHẨN ĐOÁN
 Nhanh
 Độ nhậy và độ đặc hiệu
 Đơn giản
 Dễ thực hiện
 Rẻ tiền
 An toàn cho môi trường
 Không độc hại
ISO 15189 - 2007 2
WHO- Khuyến cáo về các kĩ thuật chẩn đoán lao, lao
đa kháng
Soi kính
Kính hiển vi ánh sáng thường
Kinh hiển vi huỳnh quang thông
thường
Kính hiển vi huỳnh quang đèn LED
Nuôi cấy, định danh
Kháng sinh đồ
Thuốc chống lao hàng 1
Thuốc chống lao hàng 2
Sinh học phân tử
ISO 15189 - 2007 3
QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA CÁC KỸ
THUẬT CHẨN ĐOÁN VK LAO
ISO 15189 - 2007 4

1880s Phương pháp nhuôm
Ziehl-Neelsen
1900s Mantoux test (tuberculin)
1920s Purified Protein Derivative (PPD)
1930s Lowenstein-Jensen
1940s Dubos agar, Ogawa
1950s Middlebrook 7H9
1990s Khuyếch đại a xít Nucleic
2000s ELISPOT, QuantiFERON
20XX Hain, Xpert &?????
Soi TT
Miễn dịch
Nuôi cấy
SHPT
SOI KÍNH HIỂN VI
Tìm sự hiện diện của AFB trong mẫu bệnh phẩm
 Phương pháp soi trực tiếp : Làm tiêu bản trực tiếp từ mẫu
bệnh phẩm
 Phương pháp soi thuần nhất: Làm tiêu bản từ mẫu bệnh
phẩm đã được xử lý.
 Nhuộm Ziehl – Neelsen : S = 45-60% , Sp = 99%
 Nhuộm Auramin : S = 45 – 80% , Sp > 90%
Bệnh phẩm áp dụng: TẤT CẢ CÁC LOẠI BỆNH PHẨM
ISO 15189 - 2007 5
SOI KÍNH HIỂN VI (tt)
Ưu điểm:
 Đơn giản, rẻ tiền, Cho kết quả trong vòng 2 giờ
 Phát hiện được nguồn lây
 Giúp theo dõi kết quả điều trị .
 Kỹ thuật đơn giản.

Nhược điểm:
 Độ nhạy thấp. Mẫu bệnh phẩm phải có từ > 5000 vi khuẩn / 1
ml , mới có kết quả dương tính.
 Không phân biệt được MTB với NTM
 Không phân biệt được VK sống hay chết; VK kháng thuốc.
ISO 15189 - 2007 6
SOI KÍNH HIỂN VI (tt)
 Nghiên cứu so sánh độ nhạy của soi trực tiếp và thuần nhất từ
bệnh phẩm đàm: không có sự khác biệt về ĐỘ NHẠY giữa 2
phương pháp
 Không có đủ bằng chứng thuyết phục cho thấy xử lí đờm bằng
hoá chất, hoặc li tâm cho kết quả tốt hơn làm tiêu bản trực
tiếp nên việc sử dụng các kỹ thuật này trong chương trình
chống lao không được khuyến cáo.
ISO 15189 - 2007 7
Đọc kết quả (KQ KHQ được quy đổi sang Z-N)
Kết quả Z-N
Kết
quả trên phiếu yêu
cầu
0 AFB
0 AFB/ 100 qt
0 - AFB
Ghi
số cụ thể
1-
9 AFB/ 100 qt
AFB 4 AFB
1+
10

-99/ 100 qt
AFB 1+
2
+
1-
10 AFB/ 1 qt
AFB 2+
3+
>10 AFB/ 1 qt
AFB 3+
ISO 15189 - 2007 8
Nuôi cấy và định danh
ISO 15189 - 2007 9
Ưu điểm
Chẩn đoán xác định MTB
Độ nhạy cao, tăng số BN phát hiện (30%-50% so với STT)
Chẩn đoán ở giại đoạn sớm (trước khi thành nguồn lây chính)
Phân lập được chủng VK để làm KSĐ, Nghiên cứu
Nhược
điểm
Phức tạp, Giá thành cao; chuẩn bị môi trường, xử lí bệnh phẩm
Thời gian kéo dài (VK mọc)
Trang thiết bị đặc chủng
Đòi hỏi kĩ năng của KTV
Điều kiện ATSH
Hạn chế
Việc khử tạp cũng giết chế một phần vi khuẩn lao
LOD: 100 bacilli/ml sputum
•Cấy lỏng nhạy hơn 10%, nhanh hơn vài tuần, nhưng có tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn Cấy
đặc và đòi hỏi điều kiện ATSH cao hơn

•Định danh chỉ xác định MTB và NTM
•Các kỹ thuật định danh: SVHH, miễn dịch, SHPT
Phương pháp nuôi cấy
Có 2 phương pháp:
 Nuôi cấy trên môi trường đặc – Cấy LJ/ OGAWA
 Nuôi cấy trên môi trường lỏng – Cấy MGIT
 Được coi như “tiêu chuẩn vàng” vì có thể định danh
được VK lao với độ đặc hiệu > 98%
Bệnh phẩm áp dụng: TẤT CẢ CÁC LOẠI BỆNH PHẨM
ISO 15189 - 2007 10
QUY TRÌNH XN LAO TẠI PXN
ISO 15189 - 2007 11
Mẫu bệnh phẩm
Xử lý mẫu
Nuôi cấy
TB/NTM
6-8 tuần
Nhuộm soi
Âm tính
Dương tính
Định danh
KSĐ
Nuôi cấy trên môi trường đặc
Nguyên tắc:
 VK lao có khả năng mọc trên một số môi trường đặc biệt tạo
thành các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường có thể quan sát
bằng mắt thường . Thời gian (+) trung bình 3 - 6 tuần ; (-) 8
tuần
 Bệnh phẩm lâm sàng gửi tới PXN để cấy tìm VK lao nếu
không đảm bảo vô trùng thì sẽ được khử tạp để loại bỏ các VK

thông thường- các loại VK mọc nhanh.
ISO 15189 - 2007 12
Đọc và ghi nhận KQ cấy
Đọc Báo cáo KQ
Các
khuẩn lạc mọc dầy khắp
mặt
môi
trường (>500 khuẩn lạc)
4+
Mọc
nhiều > 200 khuẩn
lạc,
nhưng
không đầy khắp mặt
môi
trường
3+
100
~ 200 khuẩn lạc 2+
20
~ 100 khuẩn lạc 1+
<
20 khuẩn lạc
Ghi
số khuẩn lạc đếm được
Không
mọc Âm tính
Ngoại
nhiễm Ngoại nhiễm

ISO 15189 - 2007 13
Nuôi cấy trên môi trường lỏng
BACTEC MGIT 960
 960 vị trí đặt tuýp
 Thời gian nuôi cấy: (+) 7- 21 ngày
(-) 6 tuần
 Áp dụng cho tất cả các loại bệnh phẩm lâm
sàng trừ máu và nước tiểu
ISO 15189 - 2007 14
Cấy âm tính
Ít hoặc không phát quang
Cấy dương tính
Phát quang mạnh
Vị trí nhạy cảm
ở giữa
Bề mặt
Nguyên lý
ISO 15189 - 2007 15
F
F
F
F
FO2
FO2
F
F
F
F
CO2
O2

O2
O2
O2
O2
F
F
FO2
FO2
FO2
FO2
FO2
F
FO2
FO2
CO2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
CO2
CO2
O2
Cấy vào môi trường
ISO 15189 - 2007 16
Đọc kết quả
ISO 15189 - 2007 17

ISO 15189 - 2007 18
M. TB, NTM Yếu tố thừng
NTM Ngoại nhiễm tạp khuẩn
Một số phiếu KQ nuôi cấy
ISO 15189 - 2007 19
MA = MOTT = NTM
 Tỷ lệ ≈ 7%
 Nhóm sinh trưởng nhanh ( M. fortuitum, M. chelonae
…)
 Nhóm sinh trưởng chậm (MAC , M. kansasii , M.
marinum )
 Nhóm sinh trưởng chậm khác ( M. simiae complex, M.
xenopi …. )
 Nhóm sinh trưởng khó ( M. haemophilium,
M. ulcerans)
Thu thập mẫu bệnh phẩm
 Mẫu thu thập trong lọ vô trùng, có nắp vặn chặt
 Lưu trữ lạnh nếu thời gian chuyển mẫu đến phòng XN >
1 giờ
 Không cần môi trường vận chuyển hay chất bảo quản
 Mẫu bệnh phẩm hô hấp : thu thập 3 mẫu sáng sớm trong
3 ngày khác nhau
 Mẫu dịch thể, ápxe, mô : hút hay cắt chứ không dùng
gạc để lấy mẫu. Mẫu mô có thể ngâm trong ít nước muối
vô trùng để tránh bị khô.
Định danh NTM
 Hình thái vi khuẩn, sắc tố
 Thời gian sinh trưởng
 Sinh hóa
 Hain test

 DNA Sequence hay PCR - ELISA
DST - NTM
 Mối tương quan giữa DST in vitro và đáp ứng lâm sàng :
hạn chế
 Ngưng kháng của nhiều loại NTM không có ý nghĩa
lâm sàng (xác định ngưng cho từng loài)
 Độ lặp lại kém
 Cẩn trọng khi sử dụng DST vì nhiều bệnh NTM không
đáp ứng điều trị khi dựa trên kết quả DST in vitro
 Không làm DST cho NTM nhóm sinh trưởng nhanh trên
môi trường agar vì kết quả mâu thuẫn
 DST trong môi trường broth
Điều trị NTM
ISO 15189 - 2007 24
Điều trị theo cá thể
Phối hợp thuốc
Thời gian điều trị ???
Theo dõi điều trị ??? đến khi cấy (-)
Một số ví dụ về điều trị NTM
 M. kansasii: rifampin, isoniazid, ethambutol,
ethionamide, streptomycin, and clarithromycin
 M. fortuitum : macrolides và quinolones, doxycycline và
minocycline, sulfonamides . Một số nghiên cứu mức độ
nhạy cảm amikacin (100%), ciprofloxacin & ofloxacin
(100%), sulfonamides (100%), cefox-itin (50%),
imipenem (100%), clarithromycin (80%), doxy-cycline
(50%)
 M. chelonae: tobramycin (l00%), clarithromycin (l00%),
linezolid (90%), imipenem (60%), amikacin (50%), clo-
fazimine, doxycycline (25%), and ciprofloxacin (20%)

* Nhóm mọc nhanh: Kháng tự nhiên với các thuốc kháng lao
ISO 15189 - 2007 25