TRÍCH LY ENZYME FICIN TỪ MỦ CÂY SUNG

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT


Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, công
nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme cũng ngày càng phát triển và có ứng dụng to
lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên
toàn thế giới đạt khoảng 2 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%),
và protease là nhóm enzyme được ứng dụng nhiều nhất (60%).
(:8080/417/1/T-1952.pdf)
Protease là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein, rất
cần thiết cho các sinh vật sống nên có mặt trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi
khuẩn, nấm, virus ) đến động vật (gan, dạ dày bê ) và thực vật (đu đủ, dứa, sung )
rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể.
So với protease động vật và vi sinh vật, protease thực vật có những đặc điểm rất
khác biệt khó có thể thay thế được. Có 3 loại protease thực vật phổ biến nhất là
bromelain, papain và ficin. Bên cạnh 2 loại enzyme đã được nghiên cứu rõ ràng và có
nhiều ứng dụng cụ thể là bromelain và papain thì ficin cũng là một enzyme quan trọng
có nhiều ứng dụng cần được đầu tư nghiên cứu.
Ficin được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực
phẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ sung để chống lại hiện tượng tủa protein trong
quá trình làm trong bia, ngăn cản sự hóa nâu rau củ, xử lý phụ phế phẩm trong chế
biến thực phẩm…), trong y học như làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun Ngoài ra, có
nhiều ứng dụng đang được nghiên cứu như sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnh
ngoài da, mụn nhọt.
Có thể thấy, sung là một loại cây dễ trồng, phát triển nhanh và enzyme ficin
được trích từ mủ sung là một loại enzyme có nhiều ứng dụng to lớn do đó đề tài “Trích
ly enzyme ficin từ mủ cây sung” được thực hiện nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu
ứng dụng về sau.

Khảo sát khả năng thu nhận enzyme ficin.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme ficin.
Khảo sát khả năng bất hoạt sự hóa nâu ở rau quả sơ chế.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
1
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
 !"#$
%&'()*+,) )
/0123)&'()*+,) )
Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân
liên kết peptide R
1
-CO-NH-R
2
trong phân tử protein và polypeptide tạo sản phẩm là
pepton, di-, tri-peptide, amino acid và là một trong những nhóm enzyme quan trọng
phổ biến có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau: protease thực vật (papain, bromelain, ficin), động vật (pepsin, trypsin,
pancretin, ), vi sinh vật (protease từ nấm mốc, vi khuẩn ). (Đồng Thị Thanh Thu,
1996)
Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
Protease (peptidase) thuộc nhóm chính 3, nhóm phụ 4 (EC.3.4)
45/06*571,859()&'()5:'*57*+,)
Protease được phân chia thành hai nhóm: endopeptidase và exopeptidase.
 Exopeptidase: cắt cầu nối peptidic ở đầu mạch (carboxipeptidase,
aminopeptidase, dipeptidase…). Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,
exopeptidase được phân chia thành hai loại:
o Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học

2
Protease
(EC.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
o Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
 Endopeptidase: tác dụng vào các phần trung tâm của mạch polypeptid (pepsin,
tripsin, chymotripsin, papain…). Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase
được chia thành bốn nhóm:
o Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin carlsberg, Subtilisin
BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính
đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
o Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài
protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein protease thường hoạt động ở
vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

o Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường
hoạt động mạnh ở pH trung tính.
o Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường
hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
Nguồn thu nhận enzyme protease:
-;+,) ).5<
Hầu hết các nhóm vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn đều có khả năng tổng hợp
protease. Các chủng có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.
mesentericus, B. Thermorpoteoliticus, Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus,
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
A. saitoi, Penicillium chysogenum, A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti…) (Lê
Ngọc Tú, 1982)
=;+,) )>?<
Nguồn protease từ động vật đã được ứng dụng từ lâu đời với nguồn gốc từ nội
tạng như pepsin, tripsin, từ dạ dày bê như renin, và cả protease được trích từ ruột cá
basa.
;+,) )5@<
Có 3 loại protease thực vật phổ biến nhất là bromelain, papain và ficin. Papain
thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả,
chồi, và vỏ dứa (Pineapple plant) và ficin thu được từ nhựa cây họ sung (Ficus).
A?B?:-)&'()*+,) )

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:
- Trong công nghiệp thực phẩm:
 Trong công nghiệp thịt, đồ hộp: làm mềm thịt, tăng hương vị và
giá trị thịt sau khi chế biến.
 Trong công nghiệp chế biến sữa: dùng các protease làm đông tụ
sữa (renin), protease vi sinh vật khác (Bacillus mensentericus, Mucor…) trong sản xuất
fomage.
 Công nghiệp nước giải khát: làm trong bia, rượu, nước quả.
 Công nghiệp nước chấm, nước mắm: rút ngắn quá trình thủy
phân, chế biến nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá…
- Trong y học: thuốc tiêu hóa, dùng cô đặc tinh chế huyết thanh miến dịch, thuốc
điều trị nghẽn tĩnh mạch, tiêu mủ vết thương…
- Trong công nghiệp nhẹ:
 Mỹ phẩm: dùng trong sản xuất xà phòng, dầu gôi, kem bôi da…
 Bột giặt: tăng khả năng tẩy rửa các vết bẩn.
 Thuộc da: làm sạch lông, mềm da.
 Tơ tằm: có thể sử dụng để làm bóng và tách rời các sợi tơ tằm do thủy phân
lớp sericine làm dính bết các sợi tơ tự nhiên. (Lê Ngọc Tú, 2004)
%&'()C
Enzyme ficin hay còn gọi là ficain là một thiol-protease có trong dịch nhựa của
các loài sung,vả thuộc giống Ficus, họ Moraceae. Tương tự các protease thực vật khác
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
4
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
(papain, bromelain) ficin cũng có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) ở trung tâm hoạt động,
quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Mã số phân loại: EC 3.4.22.3
D5.E*5F5G
Người ta thấy rằng cách đây hàng mấy thế kỉ, chất dịch nhựa của các cây sung,
vả đã được sử dụng để làm đông tụ sữa và sản xuất fomage.

Hàng thế kỉ nay, ở Trung Quốc và Nam Mỹ, chất nhựa của loài Ficus glasbrata
và Ficus laurifolia được biết đến như một loại thuốc uống để trị các bệnh do ký sinh
trùng đường ruột gây ra. (Julia et al., 1987)
Robbins (1930) phát hiện ra một loại enzyme có trong nhựa cây sung, vả có thể
tiêu hóa được loài giun tròn Acaris còn sống do đó có thể tiêu diệt được chúng. Ông là
người đầu tiên nghiên cứu enzyme này và đặt tên là ficin.
Caldwel (1943) nhận thấy chất nhựa các loài cây Ficus có khả năng tiêu diệt loài
sán dây Trichuris trichura.
Walti (1938) là người đầu tiên kết tinh được enzyme từ nhựa sung tươi.
Sau này, quá trình tách chiết và tinh sạch ficin được nhiều tác giả nghiên cứu
trong thời gian rất dài. Nhìn chung các quá trình tinh sạch ficin đều liên quan đến việc
tủa sơ bộ bằng muối. Sự tủa sơ bộ bằng muối đối với ficin được thực hiện lần đầu bởi
Englund (1968). (Sidney et al., 1970)
?6?H55<
Ficin là một protease được tìm thấy trong dịch nhựa của những cây thuộc giống
Ficus. Các cây thuộc giống Ficus có tên gọi thông thường là sung, vả, họ Moraceae,
bộ Urticales.
Ở Việt Nam, giống Ficus có khá nhiều loài khác nhau. Có thể kể tên một số loài
sung, vả theo tài liệu của Giáo sư Phạm Hoàng Hộ (1962) như sau:
Sung trổ (Ficus variegata)
Sung (Ficus racemosa L.)
Sung ba thùy (Ficus hirta)
Sung thằn lằn (Ficus pumila L.)
Vả (Ficus auriculata Lour)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
5
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
Sau đây là đặc điểm mô tả của một số loài thuộc giống Ficus có ở Việt Nam:
Cây vả (Ficus auricalata Lour): cây đại mộc nhỏ, thân to, nhánh to. Lá to gần
như tròn, mặt đưới có 5-7 gân lá, cuống lá khoảng 2,5cm, quả làm rau ăn. Cây được

trồng nhiều nơi ở Việt Nam và mọc hoang trong rừng. (Phạm Hoàng Hộ, 2000)
Cây sung trổ (hay còn gọi là ngõa rừng, vả rừng) (Ficus variegata Blume) là cây
thân gỗ nhỏ, có nhánh, đường kính 5-6 mm rất nhẵn. Lá hình trái xoan ngược, tù và có
khi tròn ở gốc, đầu hơi nhọn hoặc không, mặt trên lá rất nhẵn, bóng, mặt dưới màu
nhạt, mép lá có hoặc hơi có răng cưa không đều, lá dài 13-22 cm, rộng 5-13 cm, cuống
2-4 cm. Quả xếp 1-2 quả trên các nhánh từ gốc hoặc trên thân già, có cuống, quả hình
cầu, nhẵn hoặc có lông mịn, quả khi chín có màu lục sọc đỏ hoặc đỏ, đường kính 3-4
cm. Quả chín có vị ngọt.
Cây si (Ficus benjamica L.) là cây ưa ẩm, mọc hoang, hiện nay được trồng ở
nhiều nơi. Nhựa để chữa ứ huyết, nhức mỏi, chữa ho, cắt cơn hen.
Cây vú bò, hay vú chó (Ficus heterophyllus L.) mọc hoang ở vùng đồi, ven rừng
dùng làm thuốc bổ chữa hư lao, bạch đới, ngâm rượu chữa tê thấp.
Cây xộp (Ficus pumila L. hay Ficus glomerata Roxb) mọc hoang nhiều nơi và
được trồng ở một số vùng, dùng làm thuốc bổ, quả làm mứt ăn ngon. (Luisa et al.,
2000)
Cây sung (Ficus racemosa L.) là loài cây nhỏ, không có rễ phụ, cành mềm có
nhiều vảy, u lồi và sẹo, lúc non có lông nâu mềm, lá hình bầu dục thuôn tù ở gốc, nhọn
ở đỉnh, mặt trên bóng, mép nguyên hay nhăn nheo, trên phiến lá có nhiều u nhỏ gọi là
vú sung. Quả phức xếp dày đặc ở thân, cành, màu đỏ nâu khi chín, có hoa quanh năm,
quả ăn được. Cây thường mọc ở nơi ẩm ướt, bờ ao. (Võ Văn Chi, 1990)
Theo Giáo sư Đỗ Tất Lợi (1981) Ficus racemosa L. mọc hoang và được trồng
khắp nơi ở Việt Nam. Tên thông thường là sung, ưu đàm hoặc Lova (tiếng
Campuchia). Loài sung này có thân cây to, không có rễ phụ. Thân có nhựa màu trắng
như sữa, lá hình mũi giáo, đầu nhọn. Lá non cả 2 mặt đều phủ lông, phiến lá nguyên
hoặc hơi có răng cưa, dài 4-10 cm, rộng 4-8 cm. Lá sung bị loài sâu Syllidae ký sinh
gây ra những mụn nhỏ. Quả mọc thành từng chùm trên thân hoặc những cành to không
mang lá. Khi chín quả màu đỏ nâu, mặt quả phủ lông mịn, cuống quả ngắn.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
6
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT

Hầu hết các bộ phận của cây có chứa nhựa, thành phần gồm: cao su 2.4%, resin,
albumin, cerin, malic acid, renin, protease, diatase, esterase, lipase, đường, catalase,
peroxidase và đặc biệt là ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Từ nhựa có thể tách chiết được enzyme ficin sử dụng cho quá trình làm mềm thịt,
làm tan máu bầm, hoặc lọc trong nước giải khát Ngoài ra, từ các cây giống Ficus
người ta còn tách chiết được một số hợp chất tự nhiên khác như: monoterpenoid,
triterpenoid, các hợp chất phenol, flavonoid (Luisa et al., 2000)
I8,59-5J
Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của enzyme ficin ở những
phòng thí nghiệm khác nhau thì khác nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này chấp nhận
được vì có thể do tính đồng nhất của các chế phẩm enzyme thu được theo những tiến
trình khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm. Ngoài ra, một trong những lý do dẫn đến sự
khác nhau này liên quan đến những hoạt chất có hoạt tính chuyên biệt được phân tách
ra từ dạng nhựa thô. Bên cạnh đó, sự thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ những loài
khác nhau cũng là một nguyên nhân quan trọng tạo nên sự khác nhau này. (Sidney et
al., 1970)
Theo Marini-Betolo (1963), Metrione (1963), Gould (1964) thu được kết quả
thành phần các acid amin từ quá trình nghiên cứu chế phẩm enzyme ficin được tinh
sạch chỉ bằng phương pháp tủa phân đoạn bởi muối trung tính. Ngoài ra Englund
(1968) đã xác định thành phần acid amin thu nhận từ quá trình tủa bằng muối và sắc
ký trên CM-cellulose.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
7
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
KL?55*5M-(,-B:-*57E)&'()C
/ N(,-B
F?L?5O
-+PK),1, )+,)
,1
B

%?1B
1 Lysin 7 9 9 5
2 Histidine 2 2 2 1
3 Amonia - - 52 25
4 Arginine 8 7 10 10
5 Aspartic acid 20 21 21 17
6 Threonine 10 8 10 8
7 Serine 13 10 16 14
8 Glutamic acid 22 23 25 25
9 Proline 11 12 13 11
10 Glycine 28 30 32 28
11 Alanine 19 21 21 20
12 Half-cystine 7 4 9 8
13 Valine 15 15 19 18
14 Methionine 3 3 4 5
15 Isoleucine 7 10 10 7
16 Leucine 14 17 17 15
17 Tyrosine 11 14 15 15
18 Phenylalanine 6 5 6 5
19 Tryptophan 3 - 9 6
Q?.H?H-(,-B
R
206 211 300 243
*số lượng các gốc amino acid/ 1 mol protein
Cấu trúc bậc I của ficin có chứa nhóm sulfhydryl (-SH). Trình tự các amino acid
ở gần trung tâm phản ứng khá giống với trình tự đã được tìm thấy của những thiol-
protease thực vật như papain và bromelain.
Tuỳ theo nguồn thu nhận enzymee ficin từ các loài khác nhau mà thành phần hóa
học sẽ khác nhau. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học

8
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
45+45@F-B-(S(TU?17<59(V/5,8>?T
)&'()C.,.F5W*-*-=+,()1- (Whitaker, 1994)
a: kết quả được trình bày bởi R.C. Wong và I.E. Liener (1964) xác định trên chế
phẩm ficin tinh sạch bởi muối.
b: kết quả do A. Light, R. Frater, J.R. Kimmel và E.L. Smith (1964).
c: kết quả do L.P. Chao và I.E. Liener (1967), Husain và G. Lowe (1968).
Tính tương đồng về trình tự của các acid amin nằm quanh vùng hoạt động của
các protease thực vật trên phản ánh một cơ chế xúc tác chung.
XY55<1Z
Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin mà tính chất vật lý của chúng không
giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn. Một bảng tóm tắt về những tính
chất vật lý nghiên cứu được được trình bày ở bảng 2. Tất cả các số liệu đều thu được
từ việc nghiên cứu trên các loài sung ở nước ngoài.
Các kết quả ở bảng 3 tuy khác nhau nhưng sự chênh lệch không lớn. Như vậy
chúng ta có thể xác định một số tính chất vật lý chung của enzyme ficin như sau:
Một số tính chất vật lý:
• Trọng lượng phân tử : 23000 – 27000 dalton
• Nhiệt độ có hoạt tính : 30 -80
0
C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác:
50-65
o
C
• Hệ số lắng : 2,5 - 2,7 S
• Điểm đẳng điện : 9-10
• Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong
nước hoặc glycerine (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
KL?5[?Y55<1Z:-C\/B)';,1,]^)-1_`abc

Nguồn thu
nhận
Phương pháp tinh
sạch
Hệ số
lắng
(S
0
)
Trọng lượng
phân tử
Điểm
đẳng
điện
Hệ số
tinh
sạch
Hệ
số tắt
Bước
sóng
(nm)
Tác giả
F. glabrata Tủa muối → sắc
ký trên
CM_cellulose, pH7
25.500
±
750
1,95 21,0 267 Englund

F. glabrata Chỉ tủa muối 2,56 S 26.000 Bernhard
và
Gutfreund
F. glabrata Tủa muối → sắc 2,61 S
23.500
±
700
Liener
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
9
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
ký trên
CM_cellulose,
pH4,4
F. carica var
Kadota
Mỗi hợp chất có
hoạt tính được tách
trực tiếp từ nhựa
bằng sắc ký trên
CM_cellulose, pH7
> 9,6 1,88 20,2 Kramer và
Whitaker
F.
anthelmitica
Chỉ tủa muối 26.500 Marini
Bettolo
dY5559-5J
− Dịch nhựa tươi cây sung có pH = 5
− pH hoạt động của ficin khá rộng, từ pH 4-9,5

− pH tối thích (pH
opt
) của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzymee:
gelatin : pH
opt
= 5, casein : pH
opt
= 9.5 , hemoglobin: pH
opt
=7. Đối với cơ chất nhân tạo
như benzoyl-L-arginine ethyl ester, benzoyl L-argininamide, hippurylamide và
hippuryl methylester thì pH
opt
= 6,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
− Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxy hoá bởi không khí làm cho dịch nhựa
chuyển sang màu hồng nâu hoặc nâu và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm xuống.
− Dưới tác dụng của các tác nhân oxy hóa, ficin bị mất hoạt tính.
Ie,8>?
-05fF>?
Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò nhóm –SH của cystein, nhóm
imidazole của histidine trong hoạt động thủy phân của ficin. Nhóm –SH tham gia tạo
thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide
bị cắt).
Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion
của chất nhận khác. Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
Đầu tiên, ficin kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid
amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm
imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
10

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
Ở giai đoạn đầu, Zn
2+
rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt
động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí
bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…)
Enzyme –SH +Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H+
Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.
=/@5,859-=5,8:-C
Giống như các hợp chất sinh học khác, ficin cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức,
phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch.
F'fH5,85,F
Khi có mặt của các nhân tố kim loại kiềm như EDTA và các nhân tố khử như:
cyanide, cystein, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol thì hoạt tính của ficin
sẽ tăng lên. (Nguyễn Hữu Chấn, 1996)
Cystein hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0.005-0.05M có thể làm tăng hoạt
tính ficin ở dạng tinh thể và HCN 0.075M làm ficin có hoạt tính xúc tác cực đại so với
các tác nhân hoạt hóa khác. Hoạt tính ficin còn tăng cao hơn khi phối hợp HCN với
cystein (cao hơn khi sử dụng riêng lẻ HCN).
F'fH^4(5g(
Do nhóm –SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của ficin nên ficin bị
bất hoạt bởi những chất có tác dụng kết hợp với lưu huỳnh như HgCl
2
, N-
ethylmalenide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide.
Một số chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật cũng có thể làm bất

hoạt ficin như: những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosyl-L-phenyalanine và N-
tosyl-L-lysine, diisopropylphosphofluoridae (DFP) do gốc cystein tối cần thiết cho xúc
tác của enzyme liên kết với các gốc này.(Lê Ngọc Tú, 1982)
1,3- dibromoacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin do nối với gốc cystein và với
gốc histidin cách xa gốc cystein phản ứng khoảng 5
0
Α
.(Nguyễn Tiến Thắng, 1998)
Trong lòng trắng trứng có một loại protein có một loại protein có khả năng kìm
hãm hoạt động của ficin. Người ta cho rằng khi protein này kết hợp với ficin tạo ra
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
11
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
một phức hợp mang tính chất bất hoạt đã được tách chiết với nồng độ không đổi là
1x10
-9
M (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Y55'=G
Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như: protein sữa,
hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả loài
giun Ascaris sống đều có thể bị thuỷ giải bởi enzymee ficin.
Ficin còn thể hiện tính chuyên biệt rộng liên quan đến thuỷ giải các liên kết
peptide, este, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. (Đỗ Tất Lợi, 1981)
Dựa vào công thức cấu tạo chung R’ - NH – CHR – CO – X, sự phân cắt nối –
CO – X được xác định khi gốc R là chuỗi bên của glycine, serine, threonine,
methionine, lysine, arginine, citruline, leucine, isoasparagine và tyrosine. Những cơ
chất có gốc R xuất phát từ alanine, phenylalanine hoặc tryptophan có thể đóng vai trò
như một chất cho hoặc nhận trong các phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) do
ficin xúc tác. Cấu phần X của các cơ chất này không những xuất phát từ các rượu,
ammoniac, mercaptan, aniline, hoặc γ-nitrophenol. Một nhóm benzoyl carbobenzoyl

đã được sử dụng như chất thay thế R’ của cơ chất nhân tạo. (Nguyễn Hữu Chấn, 1996)
Sự khác biệt trong việc khảo sát tính chuyên biệt của ficin cũng được giải thích
bởi nguyên do: hầu hết các thí nghiệm đã được tiến hành với các chế phẩm enzyme
chưa tinh sạch và chế phẩm thu được là hỗn hợp nhiều hợp chất có hoạt tính riêng lẻ
và có thể bị biến đổi. Englund (1968) đã khảo sát tính chuyên biệt của một hợp chất có
hoạt tính của chế phẩm ficin bằng cách cho nó phản ứng với chuỗi β đã được oxy hóa
của insulin, kết quả xác định được 7 điểm phân cắt chính xác và có 2 sự phân cắt khác
được đánh dấu phóng xạ.
Mặc dù không có mô hình phân cắt có tính chuyên biệt nhưng dường như có một
sự ưu tiên thủy phân những liên kết peptide liên quan đến các acid amin thơm.
BY5=[?(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Bền vững với nhiệt độ: W. Cohen khi khảo sát tính bền vững của enzyme ficin
dạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2h ở 50
o
C.
Dịch enzyme ficin sẽ bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mà
nguyên nhân có thể do từng phần của enzyme bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện
tượng oxi hoá.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
12
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng (4.5-9.5) độ bền vững của
enzyme ficin đạt đến mức cực đại. Tuy nhiên trong một vùng pH hẹp dao động quanh
pH = 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu. Nguyên nhân là do một nhóm –SH
tối cần thiết bị oxi hoá. Tuy nhiên sự giảm tính bền vững ở pH này sẽ mất đi khi gia
tăng nồng độ cystein từ 0.01 lên 0.025M.
Ficin có độ bền vững cực đại ở pH = 7.5 và pH
opt
trung bình ở khoảng 6-7.5.
Từ một nghiên cứu về tính bền vững của 10 hợp chất trích từ nhựa cây F. cariva

var. Kadata, người ta đã phát hiện rằng 5 hợp chất vẫn giữ lại ít nhất 75% hoạt tính
của chúng sau 1h ở pH = 7; 55
0
C, cũng với điều kiện như thế, 5 hợp chất còn lại ít bền
hơn.
Sự tái hoà tan các kết tủa enzyme (sau khi tủa bằng muối ) vào trong nước hay
các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzyme. Do đó, để tránh được
hiện tượng này người ta thường hoà tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm phosphate
0.01M, pH 7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzyme lên các nhân tố mang như: Blue acid
83 (BB), Red acid 17 (BR), Brilliant Blue R, Bordeaux R, Jurga’s Red, Lin Red (LE),
Jenelle’s Orange (JO)…đề làm tăng tính bền vững của enzyme. (Ohmori et al., 1996)
)>.H'fH^5FL552T?1^5Lh?5:'*57*+,):-C
Nhiệt độ: Hoạt động thuỷ giải protein của enzyme ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều
bởi nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzyme , tốc độ phản ứng
của enzyme tỉ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ. Mỗi enzyme có một nhiệt độ thích hợp
nhất cho hoạt động xúc tác của enzyme, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến tối
đa. Điểm nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạt động cùa enzyme.
Độ pH: Độ pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của
enzyme. Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme gọi
là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến mức cực đại.
Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme do:
- Tác động vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme
- Tác động vào trạng thái ion hoá của cơ chất
- Tác động vào độ bền của phân tử enzyme
- Tác động vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tử
enzyme… (Nguyễn Đức lượng, 2004).
a05fijF:-5,1*+,) )
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT

Thiol protease còn có các tên khác là cystein proteinase hoặc sulfhydryl protease.
pH
opt
trung bình khoảng 6 - 7,5. Có khả năng bền nhiệt từ 60 – 80
0
C ở pH tự
nhiên. Tâm hoạt động gồm 2 acid amin là cystein và histidine.
Cơ chế thủy phân gồm 2 giai đoạn: acyl hóa và đề acyl hóa
45I05fijiF:-5,1*+,) )
k>.H2?B?:-)&'()C
-+,?l??5G*5@*5m(
- Trong lĩnh vực chế biến thịt: ficin được dùng để thủy phân một phần các
protein tham gia cấu trúc kết quả là tăng chất lượng thịt, giảm thời gian chế biến.
- Trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa: Trong sản xuất
fomage, người Âu Mỹ dùng ficin thay thế cho rennin trong giai đoạn làm đông tụ sữa.
Ficin là enzyme có khả năng làm đông tụ sữa tốt mà ít thủy phân sâu casein do đó ít
ảnh hưởng xấu đến chất lượng fomage. Ficin được gọi là một rennin thực vật. (Judie,
1991)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
14
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
Ficin cũng được dùng để bảo quản những sản phẩm chứa protein trong sữa, bơ và
sữa khô bằng cách làm giảm hiệu quả chịu nhiệt của kappa casein ở mức thấp nhất và
làm cho vật liệu của sữa chịu đựng được tốt quá trình xử lý nhiệt hoặc thanh trùng
Pasteur. (Hà Duyên Tư, 2000)
- Trong công nghiệp sản xuất bia: tăng cường độ bền của bọt bia và làm giảm độ
đục của bia trong suốt thời gian bảo quản. (Ngô Tuấn Kỳ, 1998)
- Trong công nghiệp chế biến rau, củ, quả: Nguyên liệu rau, củ, quả tươi trong
quá trình sơ chế khi bóc vỏ, cắt lát (khoai tây, táo ) thường bị hóa nâu do quá trình
oxy hóa các hợp chất tự nhiên dưới tác dụng của một enzyme có sẵn trong nguyên

liệu. Trước đây người ta thường dùng sulfite (SO
2
) để tránh hiện tượng này. Sự hóa
nâu này cần 4 yếu tố: O
2
, Cu, một enzyme (thường là polyphenol oxidase – PPO) và
một cơ chất. Cũng như papain, bromelain, ficin được dùng như một yếu tố kìm hãm
phản ứng hóa nâu do enzyme. Tác dụng thủy phân protein của ficin gây nên sự bất
hoạt của enzyme gây phản ứng hóa nâu. (Whitaker, 1994)
=+,?'5J
Chế phẩm enzyme ficin chưa được ứng dụng nhiều, tuy nhiên người ta đã sử
dụng enzyme này làm thuốc xổ giun, trị các bệnh do ký sinh trùng đường ruột gây ra,
loét da, đau họng, dùng làm thuốc thử tế bào máu. (Sidney et al., 1970)
Ở Việt Nam, enzyme ficin tinh sạch chưa phổ biến và chưa được dùng trong y
học nhưng từ lâu, nhân dân ta coi nhựa sung, nguồn thu nhận của enzyme ficin là một
vị thuốc quí để chữa nhức đầu và một số bệnh ngoài da (chốc, nhọt, sưng đau, tụ
máu ) (Đỗ Tất Lợi, 1981)
+,?F1n5@^5F
Enzyme ficin có khả năng kìm hãm hiện tượng Melanosis (đốm đen) ở loài tôm
hồng (Penaeus duorarum) một cách đáng kể. Ficin tác động như một chất thay thế cho
các sulfite trong việc tránh khỏi sự hình thành các chấm đen dưới điều kiện bảo quản
đông lạnh hơn một tuần. Người ta cho rằng mô hình tác động của enzyme ficin là sự
kìm hãm lên enzyme polyphenol oxydase, tác nhân gây nên hiện tượng xuất hiện đốm
đen ở tôm.
Ở các nước Âu Mỹ trước đây, ficin là một thành phần trong nước rửa chén. Sau
này nó không được dùng nữa vì người ta thấy nó có tác dụng xấu đối với da.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
15
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
Bên cạnh đó, ficin còn được dùng trong việc nghiên cứu sự thủy phân thức ăn

cho bò và một số ứng dụng trong lĩnh vực thú y. (Whitaker, 1994)
B >.H5f*5m()&'()C520?(8
Ficin thương mại là hỗn hợp một số protease và một ít peroxidase cộng thêm chất
độn (đường hoặc bột), màu nâu nhạt, không mùi hoặc có thể là nhựa sung tươi được
trích từ thân sau đó lọc rồi sấy phun hoặc đem sấy rồi nghiền thành bột
%&'()o)Bp Chứa hỗn hợp của các enzyme thực vật như: bromelain,
papain, lipase, amylase, ficin, chiết xuất hạt nho và cây cà chua bổ sung vào chế độ ăn
hỗ trợ tiêu hóa giúp tăng cường chức năng đường ruột, tăng khả năng bảo vệ tế bào bởi
các vi sinh vật
%&'()Pip Kết hợp các enzymee bromelain các enzyme bromelain từ quả
dứa, papain từ quả đu đủ và ficin từ quả sung hỗ trợ tiêu hóa protein.
qphỗ trợ tiêu hóa
Ia45545?5O)&'()C
Nghiên cứu tại Universidade Federal de Rio de Janeiro (Brazil) ghi nhận ficin
trích từ F. carica khi cho dùng liều 3ml/kg/ngày trong 3 ngày liên tiếp, có hoạt tính
tiêu diệt các loại giun Syphacia obvelata (41.7%) nơi chuột (Journal of
Ethnopharmacology, 1999)
Nghiên cứu tại ÐH Y học Ardabil (Iran) so sánh hoạt tính trừ mụn cóc của ficin
từ Ficus carica với phương pháp điều trị bằng sinh hàn (cryotherapy) ghi nhận kết quả
nơi 25 người: ficin có nhiều tác dụng tốt như thời gian trị liệu đuợc rút ngắn, không
xẩy ra các phản ứng phụ, dễ sử dụng và mức độ tái nhiễm thấp hơn (theo dõi trong 6
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
16
45X5f*5m(
%&'()o)B
45d5f*5m(
%&'()Pi
45e5f*5m(
q
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT

tháng). 11 bệnh nhân lành hẳn sau khi dùng ficin so với 14 bệnh nhân dùng
cryotherapy (International Journal of Dermatology, 2007)
Nghiên cứu tại Truờng Y Tế Cộng đồng, ÐH Sơn đông (Trung Quốc) ghi nhận
ficin trích từ lá Ficus carica có các hoạt tính kháng HSV khi thử trên các dòng tế bào
Hep-2, BHK21 và PRK Các liều MTC là 0.5 mg/ml ; TDO là 15 mg/ml và TI là 30
mg/ml (Chinese Pharmaceutical Journal, 2004)
Nghiên cứu ngăn chặn sự hóa nâu ở rau củ trong quá trình sản xuất thực phẩm
bằng phương pháp sử dụng enzyme ficin (McEvily et al., 1992)
I!r5<0=L5m=DBD5*+,)5l5O-)&'()
I 5[??'s5?^5?5O)&'()
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định.
Trong những điều kiện bất lợi, chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính
(denaturation) và bị mất hoạt độ. Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú
ý tránh những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó. Thông thường phần lớn các
enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH 7.2). Vì
vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme.
Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân và các điều kiện về nhiệt độ
cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme. Đặc biệt là khi tách và làm sạch enzyme,
cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Nhiệt độ thường dùng cho các công việc này thông thường từ 0
0
C đến 5
0
C. Đối
với các enzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt độ
thấp hơn (từ - 5
0
C đến - 20
0
C). Trong các trường hợp này, người ta hay sử dụng các

hỗn hợp lạnh như nước đá với CO
2
hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí người
ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc
Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch có pH < 5
hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trong acid. Do đó, tùy
thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh pH quá acid hoặc quá kiềm. Khi điều
chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ và rất thận trọng
các acid hoặc kiềm. Và khi thêm hóa chất để điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 0
0
C.
Khi làm việc với enzyme cũng cần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính
(mất hoạt tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh việc tạo bọt có thể
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
17
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
xảy ra, người ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không
được lắc. Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tính
enzyme. Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm ammonium
sulfate dưới dạng dung dịch bão hòa.
Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật
và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng ) không dùng các dụng cụ, dao
kéo đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe ) mà phải
dùng dụng cụ inox (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần
tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc
lạnh vì tiến hành nhanh hơn. Ở một số trường hợp, khi tách và làm sạch enzyme có
hiện tượng giảm dần hoạt độ, vì vậy cần phải làm thí nghiệm nhanh. Tốt nhất là
thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quảng. Ví dụ: tách chiết các enzyme
chống oxy hóa (antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu không thì

mất hoạt tính. Còn ở microsome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn không
ảnh hưởng đến hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và các enzyme oxy hóa
khử.
Một điều cần chú ý nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme,
nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản
ứng phải được giữ ở nhiệt độ ấy. Lúc này nhất thiết phải dùng máy ổn nhiệt
(thermostate). Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độ cần thiết thì mới tiến hành
đo. pH trong quá trình này cũng phải được giữ ổn định bằng dung dịch đệm và phải
đảm bảo độ chính xác của pH những phản ứng tạo acid thì phải thêm kiềm vào và
ngược lại. Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác
lượng dịch enzyme. Người ta thường dùng loại pipette không chia độ hoặc sau này
dùng các loại micropipette. Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzyme
vào dung dịch nghiên cứu. Ví dụ đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thì
không nói chuyện nhiều. Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở
nhiệt độ thấp. Một số enzyme ổn định ở dung dịch đậm đặc của ammonium sulfate.
Trong trường hợp này, người ta giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch
ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm. Trong điều kiện
phòng thí nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme sẽ làm mất hoạt độ enzyme hoàn
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
18
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
toàn. Nhưng ở điều kiện chân không nếu sấy khô ở nhiệt độ thấp hoặc dùng
phương pháp đông khô (lyophilization) thì có thể duy trì được hoạt động bình
thường của chúng.
I >.H*520?*5F*5.85)&'()
Tinh sạch enzyme là một quá trình tách chiết, thu nhận và loại bỏ các tạp chất
không cần thiết nhưng đặc biệt là enzyme vẫn giữ được hoạt tính sau quá trình tinh
sạch. Đồng thời các phương pháp sử dụng để tinh sạch enzyme phải phụ thuộc vào
hoạt tính, độ ổn định của enzyme vào pH, nhiệt độ, lực ion, tính hòa tan và tính bền
vững trong các dung môi hữu cơ, trong dung dịch muối… Người ta thường dùng các

phương pháp sau đây để tinh sạch enzyme:
-;520?*5F*F55f)&'()B@-+Y55t--
!f:-=S?(H(Wang, 2001)
Đây là phương pháp kết tủa protein nhờ vào sự bổ sung muối trung tính ở nồng
độ cao vào dung dịch protein. Protein tồn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng giữa
các lực tĩnh điện và các tương tác kỵ nước nên khi thêm muối ở nồng độ cao thì sự
cân bằng sẽ bị phá vỡ làm chúng tạo tủa lắng xuống.
Các phân tử protein trong dung dịch được một lượng nước che chắn, bao bọc
các phần tử kỵ nước trên bề mặt phân tử protein cản trở các phân tử protein tương tác
với nhau. Khi dung dịch có nồng độ muối cao sẽ tranh giành lớp vỏ nước làm cho
lượng nước liên kết giảm đi nên các protein có thể tương tác lẫn nhau tạo sự lắng tủa.
Người ta có thể sử dụng các loại muối khác nhau để lắng tủa protein như:
nitrate, sulfate, phosphate, amoni, kali, natri…dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả
năng kết tủa tủa các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng
độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các
dịch enzyme. Tuy nhiên trong thực tế phòng thí nghiệm người ta thường dùng muối
amonium sulfate (NH
4
)
2
SO
4
thêm vào dạng dung dịch bão hòa hoặc tinh thể để tủa
phân đoạn loại bỏ những enzyme phi protein. Khi thu được tủa protein người ta sẽ
dùng phương pháp thẩm tích để loại muối.
Người ta đã nhận thấy muối (NH
4
)
2
SO

4
là tốt nhất vì nó không ảnh hưởng mà
còn giúp ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ
biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25
0
C). Nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
cần
thiết để kết tủa enzyme khác nhau thì khác nhau. Thường dùng hai dạng tinh thể hoặc
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
19
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
bão hòa
- Khi dùng dạng tinh thể:
Người ta cho từng ít một vào dịch chiết enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn
đến lượng kết tủa ban đầu của enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy
khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối.
- Khi dùng dung dịch bão hòa:
Cần tra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão
hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định, enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5)
hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH
4
)
2
SO
4

. Khi cho dung dịch
(NH
4
)
2
SO
4
vào dịch chiết enzyme thì nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
không tăng đột ngột.
Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h hoặc để qua đêm,
mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn. Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc
qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca
++
làm bền
(CaCl
2
hoặc Ca(COOH)
2
).
Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và xác định
được lượng (NH
4
)
2
SO

4
thêm vào để dung dịch enzyme đạt được một độ bão hòa nhất
định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng (NH
4
)
2
SO
4
đưa vào để dung
dịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm.
Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm
tích thường là 24 - 48h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt.
Có thể loại muối bằng cách lọc gel. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành
với thời gian ngắn nên không làm mất hoạt độ enzyme.
Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch
nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng.
!f:-=S?B?(l5[0
Trong nhiều quy trình sản xuất quy mô lớn người ta thường dùng phương pháp
này để kết tủa protein. Để đạt hiệu quả lắng tủa, dung môi phải trộn đều hoàn toàn với
nước và có tính ưa nước để tránh làm biến tính protein. Sự bổ sung dung môi hữu cơ
có tác dụng làm giảm khả năng liên kết của nước quanh phân tử protein. (Nguyễn
Hữu Chấn, 1996)
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ
thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào
dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol,
isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. (Whitaker, 1994)

Ở phương pháp này cũng chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5
0
C trở xuống).
Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0
0
C và có thể đến -20
0
C,
như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định cấu trúc không gian của protein enzyme.
Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy
li tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là
dung dịch thường có màu và có thể xảy ra khả năng biến tính không thuận nghịch của
protein. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
=;520? *5F* .s^Z>
;520?*5F*BU?5+7'*57E\1J?)1P?)1C1+-,c
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng
và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Gel là mạng lưới phân tử có cấu trúc không gian 3 chiều ghép hở ở dạng hạt.
Các lỗ bên trong hạt có kích thước trong một mức độ nào đó chúng chỉ cho những
phân tử nhỏ vừa hoặc nhỏ hơn đi qua mà các phân tử lớn hơn không đi qua được.
Nguyên tắc chung của phương pháp này là dùng để tách các phân tử có trọng
lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích
thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột
trong khi các phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh
và rửa giải ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
Gel sephadex là loại thường được sử dụng. Sephadex là tên gọi của các dextran
mạng alkyl hóa (do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng
được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose). Trọng lượng phân tử của dextran có
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
21

45a,8>?:-*57E.)*5-B)i
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
thể đạt tới hàng triệu và lớn hơn. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc
glucose tạo thành các liên kết glycoside 1,6. Sephadex được điều chế từ dextran bằng
cách cho tác dụng với epichlohidrin để tạo mạch polysaccharide [-CH
2
-C
2
H
5
O(OH)
3
-
O-]n dạng lưới phân nhánh có liên kết ngang –O-CH
2
OH(OH)-CH
2
O- gọi là "sàng
phân tử" và chất này trở thành không tan trong nước. Số liên kết ngang tạo ra càng
nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. (Boyer, 1993)
Phương pháp lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào
cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dịch
enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng
phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt
Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp
này là protein enzyme ) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt
sephadex và sẽ rơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột . Vì vậy ta có thể tách
được chất có trọng lượng phân tử cao hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ.
;520?*5F*.s^Z+-,Q,
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của

các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của
phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và
các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa
có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong
nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex,
Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
22
45kF5F*57E5),^Y552W=S?.s^Z1J?)1
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
nhóm ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect
thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá
là polystyrol (như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn.
;520?*5F*GB(?)1/u/P*,1'-+'1-(B)
Phương pháp này kết hợp với phương pháp sắc ký có thể xác định được trọng
lượng phân tử của các protein dựa vào một thang chuẩn hoặc xác định độ tinh sạch
của chế phẩm enzyme thu được.
Trong phương pháp này, các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề
mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để tạo thành một phức hợp
mang điện tích âm (do điện tích âm của SDS đã lấn áp các điện tích thực tế của
protein), lượng SDS liên kết với protein tạo phức hợp SDS-protein tỉ lệ với kích thước
protein đó và chúng sẽ di chuyển một chiều về cực dương. Thêm vào đó, một chất
khử là mercaptoethanol hoặc dithithreitol (DTT) được thêm vào để phá vỡ cầu nối –S-
S- (disulfite) của protein và các tiểu đơn vị của chúng nhờ đó sự di chuyển trong gel
của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước. (Hoefer, 1994)
Tốc độ di chuyển của protein phụ thuộc vào:
- Điện tích của mỗi phân tử tùy theo pH của môi trường, do đó phải dùng dung
dịch đệm để duy trì một pH ổn định.
- Cấu trúc và trọng lượng phân tử.

- Cường độ điện trường.
- Nhiệt độ.
- Tính chất của giá mang (giấy, acetate cellulose, gel…).
- Thời gian điện di.
XA?B?)&'()Cv^4(5g(.@.w((5-'59-7B,)&'()
\)&'(-=+,]?c+,?.05f+-xL
XW5G5?
Ngày nay, rau quả chế biến sẵn đang ngày một trở nên phổ biến với nhiều sản
phẩm đa dạng và yêu cầu chất lượng ngày càng cao. Một trong những khó khăn trong
việc nâng cao chất lượng sản phẩm là rau quả thường bị hóa nâu làm giảm giá trị cảm
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
23
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
quan của sản phẩm do đó việc kiềm chế sự sẫm màu do enzyme polyphenol oxydase
(PPO) ở các loại rau quả sơ chế đang rất được quan tâm. Những phản ứng hóa nâu ở
rau quả thường được thấy rõ khi nguyên liệu bị những tác động cơ học như gọt vỏ, cắt
lát… Từ lâu, sự hóa nâu do enzyme được kìm hãm bởi các hợp chất sulfite. Cho đến
nay các hợp chất này vẫn được sử dụng nhưng với liều lượng và chủng loại phải theo
một tiêu chuẩn nghiêm ngặt bởi các hợp chất này còn gây ảnh hưởng không tốt đến
sức khỏe người sử dụng. Do đó hiện nay xuất hiện nhu cầu sử dụng chất thay thế các
hợp chất sulfite với những phương pháp mới trong ngành công nghiệp chế biến thực
phẩm và nhiều chất thay thế đã được tìm ra và nghiên cứu.
X5[?'fHL552T?fxF+4559-7B,)&'()
Sự hóa nâu do enzyme đòi hỏi 4 yếu tố khác nhau: oxi, kim loại đồng, enzyme
xúc tác phản ứng oxy hóa và cơ chất có sẵn trong nguyên liệu.
Enzyme quan trọng nhất gây nên sự hóa nâu ở rau quả là polyphenol oxidase
(nhóm enzyme xúc tác oxy hóa các hợp chất phenol). (Whitaker & Lee, 1995)
Sự gọt vỏ và cắt lát là những hoạt động chủ yếu trong quá trình sơ chế rau quả.
Trong quá trình này, các tế bào bị phá vỡ, những cơ chất có sẵn trong nguyên liệu tiếp
xúc phản ứng với các enzyme oxy hóa. Trong điều kiện có O

2
sự sẫm màu nhanh
chóng xảy ra oxy hóa phenol thành ortoquinone. Oortoquinone bị polymer hóa nhanh
chóng tạo thành các sắc tố có màu nâu hoặc đen.
Phản ứng tổng quát:
Các hợp chất phenol
enzyne PPO
các ortoquinone (màu nâu hoặc đen).
XIF*520?*5F*?hL*5LO?59-7
Theo lý thuyết, phản ứng do enzyme PPO xúc tác có thể ngăn cản được bằng các
cách:
Dùng các tác nhân lý hóa: nhiệt độ (>=80
0
C), acid (pH=2)…
Loại bỏ 1 trong 2 nhân tố tham gia quyết định vào phản ứng (O
2
hoặc/và các hợp
chất phenol.
Ngăn cản sự tạo thành melanin (Whitaker & Lee, 1995)
Ngày nay, trong lĩnh vực này, có nhiều phương pháp mới để tránh sự hóa nâu ở
rau quả. Các phương pháp đó thuộc 3 nhóm: hóa học, vật lý, enzyme.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
24
O
2
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2011 Trường ĐHCT
XX;520?*5F*)&'()?hL.@.m((T+-xL.05f
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng enzyme là các tác nhân bất hoạt PPO
không cho PPO hoạt động xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol thành ortoquinone.
Phương pháp enzyme là một trong những phương pháp tự nhiên được coi là lý

tưởng nhất để ngăn cản phản ứng hóa nâu. Trong nhiều chất kìm hãm PPO được biết,
chỉ có một vài chất có khả năng thay thế cho sulfite (Vamos, 1989). Lozano (1963) và
Meza (1995) đã sử dụng dịch quả thơm với enzyme bromelain là chất thay thế sulfite
đầy hứa hẹn.
Các enzyme protease được nhận thấy rằng có khả năng kìm hãm phản ứng sẫm
màu ở táo và khoai tây (Taoukis,1989; Labuza,1992; Luo,1992). Các enzyme được
dùng thử nghiệm chứng minh tác dụng này là papain, bromelain và ficin. Theo
Taoukis (1989), ficin có tác dụng như một hợp chất sulfite.
I
;y$;;z;{A
I;520?G?5O
Iu?_5f=D_59-5
-u?
Ống nghiệm, đũa thủy tinh, cốc thủy tinh, chai thủy tinh màu tối, ống đong,
eppendorf
=5f=D
Máy khuấy từ, micropipette, máy ly tâm, pH kế, cân điện tử, máy lắc ủ, máy
vortex…
9-5
Aceton, Ammonium sulfate, ethanol
Tris- HCl buffer, Disodium Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Na
2
EDTA),
phosphate buffer.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
25