NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT citroflavonoid từ CITRUS

i
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN 3
1. CÁC LOÀI CITRUS 3
2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS 4
2.1. Thành phần hóa học 4
2.2. Flavonoid trong vỏ quả các loài Citrus (citroflavonoid) 5
3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CITROFLAVONOID 7
3.1. Tác dụng chống oxy hóa 7
3.2. Tác dụng giảm mỡ máu 8
3.3. Tác dụng chống viêm 8
3.4. Chống các bệnh tim mạch 8
3.5. Chống ung thƣ 9
3.6. Các sản phẩm thuốc trên thị trƣờng có hoạt chất là các citroflavonoid 9
4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ CITROFLAVONOID 9
5. CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID 10
6. VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT 13
PHẦN II. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 14
2. NGUYÊN LIỆU 14
2.1. Nguyên liệu cho chiết xuất 14
2.2. Dung môi, hóa chất 14
2.3. Động vật thí nghiệm 14
3. THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15
3.1. Thiết bị sử dụng cho điều tra, khảo sát các loài Citrus 15
3.2. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu qui mô phòng thí nghiệm 15
3.4. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ở qui mô pilot 15
3.5. Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm 16

3.5. Thiết bị sử dụng cho thử tác dụng sinh học 16
4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
4.1. Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu các loài thuộc chi Citrus 16
4.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng các citroflavonoid 16
4.3. Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm 17
4.4. Triển khai các quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 17
4.5. Phân lập các hoạt chất flavonoid chính làm chất đối chiếu 17
4.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus và sản phẩm bột
citroflavonoid 18
4.7. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học của bột citroflavonoid 18
4.7.1. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm 18
4.7.2. Thử độc tính cấp 21
4.7.3. Thử độc tính bán trường diễn 21
4.7.4. Đánh giá tác dụng phòng chống vữa xơ động mạch 22
4.7.5. Xử lý số liệu 23
4.7.6. Nơi thực hiện nghiên cứu 23
PHẦN III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24
1. ĐIỀU TRA, KHẢO SÁT, THU THẬP VÀ PHÂN TÍCH THÔNG TIN VỀ NGUỒN
NGUYÊN LIỆU CITRUS TẠI VIỆT NAM 24
1.1. Phạm vi điều tra 24
1.2. Thu thập tiêu bản và xác định tên khoa học của các loài Citrus 24
1.3. Kết quả thu mua nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus 25
1.4. Điều tra phỏng vấn nguồn nguyên liệu vỏ quả từ các loài Citrus 26

ii
1.4.1. Kết quả điều tra, phỏng vấn về diện tích trồng và sản lượng các loài 26
1.4.2. Kết quả điều tra, phỏng vấn các công ty/xí nghiệp kinh doanh các sản phẩm từ
các loài thuộc chi Citrus 27
1.5. Kết luận 28
2. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG

CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS VÀ CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT 28
2.1. Xây dựng phƣơng pháp Định tính các citroflavonoid 28
2.1.1. Nguyên tắc 28
2.1.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 29
2.1.3. Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 31
2.2. Phƣơng pháp định lƣợng bằng phép đo UV-VIS 35
2.2.1. Nguyên tắc 35
2.2.2. Thực nghiệm 35
2.2.3. Kết quả 36
2.3. Phƣơng pháp định lƣợng naringin và hesperidin bằng HPLC 36
2.3.1. Nguyên tắc 36
2.3.2. Thực nghiệm 36
2.3.3. Kết quả 37
3. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS
THU THẬP 40
3.1. Nguyên liệu 40
3.2. Phƣơng pháp định lƣợng 41
3.3. Phƣơng pháp xác định độ ẩm của mẫu thử 41
3.4. Tiến hành định lƣợng 41
3.5. Kết quả 42
3.5.1. Kết quả định lượng citroflavonoid 42
3.5.2. Bàn luận 44
3.6. Kết luận 45
4. PHÂN LẬP CÁC CITROFLAVONOID CHÍNH LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU 46
4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 46
4.2. Thực nghiệm và kết quả 46
4.2.1. Phân lập Naringin (ký hiệu là CF-1) 46
4.2.2. Phân lập Hesperidin (CF-2) 47
4.2.3. Điều chế Naringenin (CF-3) 50
4.2.4. Điều chế Hesperetin (CF-4) 51

5. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 53
5.1. Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do 53
5.1.1. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH 53
5.1.2. Tác dụng dọn gốc tự do superoside (O
2
–●
) 53
5.1.3. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy (OH
●
) 54
5.2. Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipid 54
5.3. Tác dụng chống oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) 55
5.4. Bàn luận 55
6. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHO CHIẾT XUẤT 56
7. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN LẬP CITROFLAVONOID TỪ VỎ QUẢ CÁC LOÀI
CITRUS Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 57
7.1. Phƣơng pháp thực nghiệm chung 57
7.1.1. Nguyên vật liệu 57
7.1.2. Thực nghiệm 57
7.2. Khảo sát các điều kiện chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu 57
7.2.1. Khảo sát dung môi chiết 57
7.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 58
7.2.3. Khảo sát thời gian và số lần chiết xuất 59

iii
7.2.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu 60
7.2.5. Khảo sát kích thước dược liệu 60
7.3. Qui trình loại tạp từ citroflavonoid chiết xuất 61
7.3.1. Nguyên liệu 61
7.3.2. Thực nghiệm 61

7.3.3. Kết quả 61
7.3.4. Kết luận 62
7.4. Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu 63
7.4.1. Nguyên vật liệu 63
7.4.2. Thực nghiệm 63
7.4.3. Kết quả 63
7.4.4. Kết luận 64
8. TRIỂN KHAI QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID TỪ VỎ
QUẢ CITRUS QUY MÔ PILOT 66
8.1. Triển khai và điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp cho từng công đoạn của quy
trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid 66
8.1.1. Nguyên vật liệu 66
8.1.2. Trang thiết bị, máy móc 66
8.1.3. Thực nghiệm 66
8.1.4. Xây dựng qui trình 67
8.2. Hoàn thiện độ ổn định của quy trình công nghệ chiết xuất Citroflavonoid 70
8.2.1. Nguyên vật liệu 70
8.2.2. Máy móc, trang thiết bị 70
8.2.3. Thực nghiệm 70
8.2.3. Kết luận 71
9. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM 74
9.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus dùng cho chiết xuất 74
9.1.1. Nguyên vật liệu 74
9.1.2. Thực nghiệm 74
9.1.3. Kết quả 75
9.1.4. Tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu 78
9.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid 79
9.2.1. Nguyên vật liệu 79
9.2.2. Thực nghiệm 79
9.2.3. Kết quả 79

9.2.4. Kết luận 81
10. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BỘT CITROFLAVONOID 81
10.1. Nguyên vật liệu 81
10.2. Thực nghiệm 82
10.3. Kết quả 82
11. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA BỘT CITROFLAVONOID 82
11.1. Nguyên liệu 82
11.2. Thực nghiệm 83
11.3. Kết quả 83
11.3.1. Kết quả theo dõi tình trạng chung và cân nặng động vật thí nghiệm 83
11.3.2. Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học 83
11.3.3. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 84
11.3.4. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 85
11.3.5. Kết quả xét nghiệm mô học 86
11.4. Kết luận 86
12. TÁC DỤNG PHÒNG CHỐNG VỮA XƠ ĐỘNG MẠCH CỦA SẢN PHẨM BỘT
CITROFLAVONOID 86
12.1. Thực nghiệm 86

iv
12.1.1. Nguyên vật liệu 86
12.1.2. Tiến hành thí nghiệm 87
12.2. Kết quả 87
12.2.1. Ảnh hưởng của thuốc thử trên các chỉ số lipid máu 87
12.2.2. Tác dụng của citroflavonoid lên mô bệnh học 89
12.3. Kết luận 90
13. NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID 91
13.1. Nguyên liệu nghiên cứu 91
13.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 91
13.3. Kết quả 91

13.3.1. Lần kiểm nghiệm thứ nhất 91
13.3.2. Lần kiểm nghiệm thứ hai 91
13.3.3. Lần kiểm nghiệm thứ ba 92
13.3.3. Lần kiểm nghiệm thứ tư 92
PHẦN IV. BÀN LUẬN 94
1. Bàn luận về các kết quả nghiên cứu đã thu đƣợc 94
1. 1. Khảo sát nguồn nguyên liệu vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus tại Việt Nam 94
1.2. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các flavonoid bằng sắc ký lớp
mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 94
1.3. Lựa chọn đƣợc một flavonoid để nghiên cứu chiết xuất ở qui mô lớn 96
1.4. Nghiên cứu và lựa chọn đƣợc qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô phòng thí
nghiệm (1 kg/mẻ) để áp dụng cho qui trình sản xuất ở qui mô lớn (>100 kg/mẻ) 98
1. 5. Đã triển khai quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả Citrus ở qui mô
pilot (>100 kg/mẻ). 99
1.6. Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở cho vỏ quả Citrus và cho sản phẩm bột
citroflavonoid 102
1.7. Tác dụng sinh học và độc tính của sản phẩm bột citroflavonoid 103
1.8. Độ ổn định của bán thành phẩm bột citroflavonoid 103
2. Phân tích hiệu quả kinh tế của việc sản xuất thử nghiệm bột citroflavonoid 103
2.1. Các số liệu thống kê về kinh tế của Qui trình chiết xuất 104
2.2. Phân tích về hiệu quả kinh tế nếu sản xuất thử nghiệm 105
3. Một số vấn đề còn tồn tại cần giải quyết 107
3.1. Khó khăn về tìm kiếm nguồn nguyên liệu cho chiết xuất lớn 107
3.2. Việc thực hiện chiết xuất ở qui mô pilot (≥ 120 kg) còn một số tồn tại 107
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108
1. Kết luận 108
2. Kiến nghị 109
TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tổng hợp kết quả về diện tích trồng và sản lƣợng quả một số loài Citrus 26
Bảng 2. Dung môi rửa giải cho định lƣợng citroflavonoid 32
Bảng 3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 38
Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của narigin và hesperidin 38
Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 38
Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp 40
Bảng 7. Kết quả xác định hàm lƣợng naringin và hesperidin trong các mẫu 42
Bảng 8. Số liệu
1
H và
13
C NMR của các chất CF-1 và CF-2 48
Bảng 9. Số liệu
1
H- và
13
C-NMR của các chất CF-3 và CF-4 trong DMSO 51
Bảng 10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các mẫu thử 53
Bảng 11. Tác dụng dọn gốc tự do superoxide của các mẫu thử 54
Bảng 12. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy của các mẫu thử 54
Bảng 13. Tác dụng chống oxy hóa lipid của các mẫu thử 55

Bảng 14. Tác dụng chống oxy hóa LDL của các mẫu thử 55
Bảng 15. Tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đƣợc 56
Bảng 16. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong nƣớc 62
Bảng 17. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong cồn 62
Bảng 18. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong cồn-nƣớc lạnh 62
Bảng 19. Hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm 64
Bảng 20. Hiệu suất sản phẩm chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm 68
Bảng 21. Hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm (quy mô pilot) 71
Bảng 22. Độ ẩm của các mẫu trần bì 75
Bảng 23. Độ tro toàn phần của các mẫu trần bì 76
Bảng 24. Độ tro không tan trong acid clohydric của các mẫu trần bì 76
Bảng 25. Kết quả xác định tạp chất của các mẫu trần bì 76
Bảng 26. Hàm lƣợng hesperidin trong các mẫu trần bì 78
Bảng 27. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu citroflavonoid 79
Bảng 28. Kết quả tro toàn phần của các mẫu citroflavonoid 80
Bảng 29. Hàm lƣợng % hesperidin trong các mẫu bột citroflavonoid 81
Bảng 30. Số liệu thử độc tính cấp của citroflavonoid 82
Bảng 31. Trọng lƣợng thỏ thí nghiệm ở các thời điểm theo dõi (kg) 83
Bảng 32. Kết quả theo dõi các chỉ số của máu thỏ ở các lô thí nghiệm 84
Bảng 33. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan thỏ ở các lô thí nghiệm 85
Bảng 34. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận thỏ ở các lô thí nghiệm 85
Bảng 35. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ triglycerid 87
Bảng 36. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ cholesterol toàn phần 88
Bảng 37. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ HDL- cholesterol 88
Bảng 38. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ LDL- cholesterol 88
Bảng 39. Kết quả quan sát đại thể và vi thể động mạch chủ 89
Bảng 40. Kết quả quan sát đại thể và vi thể gan 90
Bảng 41. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 1 91
Bảng 42. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 2 92
Bảng 43. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 3 92

Bảng 44. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 4 93
Bảng 45. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 5 93
Bảng 46. Chi phí cho chiết xuất 120kg dƣợc liệu (1 mẻ chiết) ở qui mô nghiên cứu 105
Bảng 47. Dự kiến chi phí cho chiết xuất 1000kg dƣợc liệu ở quy mô sản xuất 106



vi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus. 5
Hình 2. Flavonoid nhóm flavan trong quả các loài Citrus và các glycosid của chúng 6
Hình 3. Flavonoid nhóm flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus. 7
Hình 4. Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid 8
Hình 5. Qui trình (I) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 10
Hình 6. Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 11
Hình 7. Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi 12
Hình 8. Qui trình (IV) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi 12
Hình 9. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 30
Hình 10. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 31
Hình 11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp hesperidin và naringin (trên), mẫu naringin (giữa)
và mẫu hesperidin (dƣới). 33
Hình 12. Sắc ký đổ của mẫu chuẩn hỗn hợp (trên cùng), mẫu thu hái chứa hesperidin (vỏ quả
quýt, giữa) và mẫu chứa naringin (vỏ bƣởi, dƣới cùng). 34
Hình 13. Sắc ký đổ của mẫu dƣợc liệu chỉ chứa naringin (trên), mẫu thử chỉ chứa hesperidin
(giữa) và mẫu chứa cả hai chất này (dƣới) 39
Hình 14. Qui trình phân lập và tinh chế naringin (CF-1) từ dƣợc liệu 47
Hình 15. Cấu trúc hóa học của CF-1 (naringin) và CF2 (hesperidin) 48
Hình 16. Qui trình phân lập và tinh chế hesperidin (CF-2) từ dƣợc liệu 49
Hình 17. Nguyên tắc điều chế naringenin 50

Hình 18. Nguyên tắc điều chế hesperitin 52
Hình 19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid
toàn phần trong sản phẩm 58
Hình 20. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid
toàn phần trong sản phẩm 59
Hình 21. Ảnh hƣởng của thời gian và số lần chiết đến hiệu suất chiết xuất 59
Hình 22. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng
citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 60
Hình 23. Ảnh hƣởng của kích thƣớc dƣợc liệu đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng
citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 61
Hình 24. Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu qui mô phòng thí nghiệm 65
Hình 25. Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quýt 69
Hình 26. Qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 73
Hình 27. Sắc ký đồ TLC định tính dƣợc liệu trần bì 77
Hình 28. SKĐ HPLC của hesperidin đối chiếu và dƣợc liệu trần bì 77
Hình 29. Đồ thị của phƣơng trình hồi qui 78
Hình 30. Sắc ký đồ TLC định tính bột citroflavonoid 80
Hình 31. Sắc ký đồ HPLC của hesperidin đối chiếu và mẫu bột citroflavonoid 81



1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) và đƣợc cho là có nguồn gốc từ
Đông Nam Á. Các cây thuộc chi Citrus thƣờng là các cây gỗ nhỏ hay cây bụi, phân bố chủ yếu
ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả mọng kiểu cam quít, ăn đƣợc. Vỏ quả ngoài chứa
nhiều túi tiết tinh dầu, vỏ quả giữa màu trắng, xốp, vỏ quả trong có chứa những lông mọng
nƣớc (đƣợc gọi là tôm, tép) có vị chua hay ngọt.
Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dƣới loài. Các cây Citrus rất phổ biến ở

Việt Nam gồm có: 1) Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck (tên đồng nghĩa C.
decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.), đƣợc trồng từ lâu đời ở Việt Nam, phân bố
khắp đất nƣớc; 2) Cam: C. sinensis (L.) Osbeck, (C. aurantium L.), đƣợc trồng từ lâu đời khắp
đất nƣớc; 3) Chanh: tên khoa học C. limonia Osbeck (chanh kiên) đƣợc trồng nhiều ở miền
Bắc và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) đƣợc trồng nhiều ở miền Nam; 4) Quít: tên khoa học
C. reticulate Blanco (C. nobilis Lour. ; C. chrysocarpa Lush.), nhiều giống quít nổi tiếng nhƣ:
quít đƣờng (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng…; 5) Quất: C. japonica Thunb.
(Fortunella spp), đƣợc trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận chủ yếu làm cây cảnh.
Thành phần hóa học chính của các loài Citrus là acid hữu cơ, alkaloid, carotenoid,
coumarin, flavonoid, limonoid, tinh dầu và các vitamin đƣợc phân bố trong các bộ phận (rễ,
thân, cánh, lá, và quả) của cây. Flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài
Citrus, phân bố ở tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lƣợng cao trong vỏ quả. Hiện nay số
lƣợng flavonoid đã đƣợc phân lập và xác định từ vỏ quả các loài Citrus là khoảng hơn 60 chất,
thuộc các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin. Thành phần flavonoid chính có
trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là các flavan. Các flavan aglycon và các flavan glycosid
của chúng chiếm hàm lƣợng rất lớn trong vỏ quả của các loài Citrus, tới hơn 90% trong
flavonoid toàn phần. Trong số các flavan, hay gặp và có hàm lƣợng lớn nhất là naringenin,
hesperitin và đặc biệt các glycosid của chúng là naringin, hesperidin. Các chất này chiếm hàm
lƣợng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô. Điều đặc biệt là narigenin, naringin,
hesperitin, và hesperidin có hàm lƣợng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhƣng lại rất hiếm
gặp ở các chi và họ khác. Vì vậy, chúng đƣợc coi là các flavonoid đặc trƣng của chi Citrus, và
đƣợc gọi là citroflavonoid.
Các citroflavonoid có rất nhiều các tác dụng sinh học đƣợc quan tâm, gồm có: 1) chống
oxy hóa; 2) hạ cholesterol trong máu, góp phần điều hòa mỡ trong máu của ngƣời béo phì,
ngƣời già, ngƣời bệnh; 3) chống viêm do ức chế các enzym gây ra quá trình viêm
(cyclooxygenase, lipoxigenase, phospholipase, phosphodiesterase); 4) chống các bệnh tim
mạch: có tác dụng làm bền thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống kết dính tiểu cầu và
tăng tính thấm của mao mạch; và 5) chống ung thƣ.
Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng để thu hái quả. Bƣởi, cam, chanh, và
quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến cả trên thế giới và Việt Nam. Vỏ quả và

lá của các loài Citrus còn đƣợc sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ phẩm và
thực phẩm. Tại các nƣớc Đông Á và Việt Nam, vỏ quả của các loài Citrus cũng đƣợc dùng
trong y học cổ truyền và y học dân gian. Vỏ quít (C. reticulate) thái mỏng phôi khô, còn đƣợc

2
gọi là trần bì, đƣợc dùng làm thuốc chữa ho, hen, viêm họng có đờm. Quả cam chua (C.
aurantium) thái phơi khô, đƣợc gọi là chỉ xác hay chỉ thực, đƣợc dung chữa chán ăn, không
tiêu, đau bụng, nôn mửa. Trong công nghiệp Dƣợc phẩm, các flavonoid của chi Citrus đƣợc
dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu. Các công ty Dƣợc phẩm hàng đầu thế
giới của nƣớc Pháp đã đƣa ra một số sản phẩm có hoạt chất là các citroflavonoid nhƣ Daflon,
Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Circularine. Trong số này, sản phẩm thuốc Daflon của
công ty Dƣợc phẩm Servier (Pháp) là nổi tiếng và bán chạy nhất. Thành phần chính của thuốc
Daflon là phân đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài Citrus, hàm lƣợng 500 mg,
gồm diosmin 450 mg và flavonoid tƣơng đƣơng với 50 mg hesperidin. Thuốc có tác dụng làm
tăng trƣơng lực của tĩnh mạch, giảm ứ trệ ở tĩnh mạch, tăng sức bền ở mao mạch, đƣợc dùng
điều trị các bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân)
và đặc biệt đƣợc dùng để điều trị bệnh trĩ.
Các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng rất rộng rãi ở nƣớc ta với mục đích chính là lấy quả
và làm cảnh. Nhân dân có sử dụng quả hoặc vỏ quả của một số loài để làm thuốc theo y học cổ
truyền, y học dân gian, tuy nhiên, số lƣợng sử dụng là không nhiều vì nhu cầu thấp. Có thể dễ
dàng nhận thấy sau khi sử dụng quả của các loài Citrus, vỏ quả giữa (còn đƣợc gọi là cùi) đƣợc
đem vứt đi mà không đƣợc sử dụng gì cả. Đây là một nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc rất dồi
dào, sẵn có quanh năm, là phế phẩm của ngành thực phẩm. Thế nhƣng hiện tại chƣa có sản
phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài Citrus đƣợc sản xuất bởi
các công ty dƣợc phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất lớn về các thuốc này.
Tuy có một số nghiên cứu ở Việt Nam về việc ứng dụng các flavonoid để làm thuốc
chữa bệnh, nhƣng chƣa có nghiên cứu cho qui mô công nghiệp và do đó chƣa thể triển khai
đƣợc trong công nghiệp. Công nghệ hóa dƣợc và sản xuất dƣợc phẩm ở nƣớc ta nói chung và ở
Hà Nội nói riêng, đã có những phát triển vƣợt bậc trong những năm qua. Chúng ta có thể triển
khai những qui trình công nghệ chiết xuất và sản xuất thuốc trên những dây chuyền công nghệ

mới của các công ty dƣợc phẩm. Tại Viện Dƣợc liệu cũng có dây chuyền chiết xuất hoạt chất
và dây chuyền sản xuất viên bao phim ở qui mô bán công nghiệp (qui mô Pilot).
Với những lý do kể trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công
nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả các loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae”. Mục tiêu tổng
quát của đề tài là xây dựng đƣợc qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid đạt tiêu chuẩn
dƣợc dụng, có thể dùng để sản xuất các thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch rất hiệu quả,
đem lại nhiều lợi nhuận về kinh tế và xã hội. Các mục tiêu cụ thể của đề tài gồm có:
1. Xây dựng đƣợc qui trình công nghệ chiết xuất sản phẩm chứa trên 50% citroflavonoid
từ vỏ quả của một số loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae làm nguyên liệu sản xuất thuốc.
2. Đánh giá đƣợc độc tính cấp, độc tính bán trƣờng diễn và tác dụng hỗ trợ điều trị các
bệnh rối loạn thành mạch của sản phẩm.
3. Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid.



3
PHẦN I. TỔNG QUAN
1. CÁC LOÀI CITRUS
Chi Citrus là một chi thực vật lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) [1], [2], đƣợc cho là có
nguồn gốc từ Đông Nam Á [3]. Các cây thuộc chi Citrus thƣờng là các cây gỗ nhỏ hay cây bụi,
phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả mọng kiểu cam quít, có múi, ăn
đƣợc. Vỏ quả ngoài chứa nhiều túi tiết tinh dầu, vỏ quả giữa màu trắng, xốp, vỏ quả trong có
chứa những lông mọng nƣớc (đƣợc gọi là tôm, tép) có vị chua hay ngọt [1], [2].
Có nhiều phân loại về các loài trong chi Citrus [3], [4]. Theo Engler thì có 9 loài [4],
theo Swingle có 16 loài [5], còn Tanaka lại liệt kê 166 loài thuộc chi Citrus [6]. Ngày nay, đã
có rất nhiều cá thể lai giữa các loài trong chi này nên phân loại rất phức tạp.
Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dƣới loài [1], [2], [7], [8], trong đó có các
cây cho quả ăn rất phổ biến sau:
- Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck, (còn có các tên đồng nghĩa C.
decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.). Đây là cây đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc

Đông Nam Á và Nam Á. Ở Việt Nam, bƣởi là cây đƣợc trồng từ rất lâu đời, phân bố khắp
đất nƣớc. Có nhiều giống bƣởi ở nƣớc ta, hay đƣợc biết đến nhƣ bƣởi Biên Hòa (Đồng
Nai), Da Xanh (Bến Tre), Đoan Hùng (Phú Thọ), Năm Roi (Cần Thơ), Phúc Trạch (Hà
Tĩnh). Tại Hà Nội có bƣởi Diễn cũng khá nổi tiếng.
- Cam: tên khoa học Citrus sinensis (L.) Osbeck (cam vỏ nhẵn) và C. nobilis Lour.
(cam sành). Cam là cây trồng thu hái quả phổ biến nhất, đƣợc trồng rộng rãi ở các nƣớc
nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới. Ở nƣớc ta cam cũng đƣợc trồng từ lâu đời. Ngày nay
có nhiều giống cam quí đƣợc trồng ở nƣớc ta nhƣ cam Bố Hạ (Yên Thế, Bắc Giang), cam
Vinh và cam xã Đoài (Nghệ An), cam Bắc Quang (Hà Giang).
- Chanh: Citrus limonia Osbeck (chanh kiên) đƣợc trồng nhiều ở miền Bắc và C.
aurantifolia Swingle (chanh ta) đƣợc trồng nhiều ở miền Nam. Tuy chanh đƣợc trồng
nhiều nơi để lấy quả và lá, nhƣng năng suất quả thấp hơn các loài kể trên nên đƣợc trồng ít
hơn cam và bƣởi.
- Quít: Citrus reticulate Blanco, (C. nobilis Lour. và C. chrysocarpa Lush). Giống
quít C. reticulate đƣợc trồng nhiều ở các nƣớc nhiệt đới. Ở nƣớc ta có nhiều giống quít nổi
tiếng nhƣ: quít đƣờng (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng… Quít đƣợc trồng lấy
quả ở các tỉnh miền núi phía bắc nhƣ Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu, Lạng
Sơn, Thái Nguyên. Ở Hà Nội (Hà Tây cũ) cũng có nhiều vùng trồng quít.
- Quất: Citrus japonica Thunb., (Fortunella spp.), có nguồn gốc từ Trung Quốc,
ngày nay đƣợc trồng nhiều tại các nƣớc nhiệt đới và bán nhiệt đới. Ở Việt Nam quất đƣợc
trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận với mục đích làm cây cảnh, trang trí cho ngày
Tết là chính. Vùng trồng quất nổi tiếng là Quảng Bá, Quảng An, Tứ Liên. Ngày nay thì các
tỉnh lân cận Hà Nội cũng trồng nhiều, và đã đƣợc di thực vào miền Nam. Mặc dù quất ra
rất nhiều quả nhƣng ít đƣợc dùng làm thức ăn hơn các loài Citrus kể trên.
- Chấp: C. aurantium L., đƣợc trồng nhiều tại miền bắc.

4
- Phật thủ: Citrus medica L. var. sarcodactylis (Sieb.) Swingle
Các loài liệt kê ở trên là các loài có nguồn gốc từ châu Á, đã đƣợc trồng trọt từ lâu.
Ngày nay, đã có rất nhiều cá thể lai mà chúng ta không xác định đƣợc chính xác tên loài [4],

nhƣng để xác định các cá thể thuộc chi Citrus là tƣơng đối dễ dàng.
Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng để thu hái quả. Bƣởi, cam, chanh, và
quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến trên cả trên thế giới và ở Việt Nam. Vỏ
quả và lá của các loài Citrus còn đƣợc sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ
phẩm và thực phẩm. Tại các nƣớc Đông Á, lá và vỏ quả của các loài Citrus cũng đƣợc dùng
trong y học cổ truyền và y học dân gian [7], [8]. Trong công nghiệp Dƣợc phẩm, các flavonoid
của chi Citrus đƣợc dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu.

2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS
2.1. Thành phần hóa học
Các cây Citrus đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu rất kỹ về thành phần
hóa học. Các thành phần hóa học chính của chúng là acid hữu cơ, alkaloid, coumarin, tinh dầu
và các vitamin đƣợc phân bố trong các bộ phận (rễ, thân, cánh, lá, và quả) của cây.
● Carotenoid: các carotenoid có trong vỏ quả các loài Citrus là các chất sắc tố từ vàng
đến đỏ cam và tan trong tinh dầu vỏ [9]. Các chất thƣờng gặp là caroten (, , ),
cryptoxanthin, auroxanthin [9].
● Tinh dầu: vỏ quả ngoài của tất cả các loài Citrus chứa một lƣợng lớn tinh dầu nằm
trong túi tiết [10], [11]. Thành phần trong tinh dầu rất đa dạng, bao gồm các monoterpen, các
alcol, các aldehyd, các ester, ether, và các ceton. Một số thành phần chính trong tinh dầu
Citrus có thể kể đến là cymen, geraniol, geranial, limonene (chiếm hơn 80%), -pinen, -
pinen, sabinen, terpinen, terpinolen… Vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại nhiều nơi ở Việt
Nam cũng đƣợc xác định có chứa hàm lƣợng lớn về tinh dầu [12]. Tinh dầu Citrus có tác dụng
chống oxy hóa, chống ung thƣ, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm [10], [13]. Tinh dầu
đƣợc sử dụng trong công nghiệp làm mỹ phẩm và làm gia vị [10].
● Limonoid: đây là thành phần đặc trƣng và có hàm lƣợng lớn của các cây thuộc họ
Rutaceae và Meliaceae nói chung, chi Citrus nói riêng [14], [15]. Về cấu trúc hóa học,
limonoid là các dẫn chất của triterpen có chứa nhiều oxy trong phân tử và có một vòng furan ở
vị trí C-17, tồn tại cả ở dạng aglycon tự do và dạng glycosid [14], [15]. Một số limonoid có vị
đắng và đây chính là nguyên nhân gây ra vị đắng trong vỏ quả và cả dịch quả của các loài
Citrus [14]. Các limonoid có các tác dụng sinh học chống ung thƣ, giảm cholesterol trong máu,

có tác dụng diệt côn trùng và ký sinh trùng sốt rét, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, và
kể cả chống HIV [14], [15].
● Coumarin: các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ Rutaceae nói chung [10], [17],
[18], [19], [20]. Tuy nhiên hàm lƣợng coumarin trong vỏ quả thấp hơn trong rễ, thân, cành [18].
Vì coumarin là các chất ít phân cực nên có thể tìm thấy trong tinh dầu của vỏ quả, nhƣng cũng
có thể tìm thấy trong vỏ quả trong [10], [18]. Một số coumarin hay gặp trong các loài Citrus là
bergamottin, bergapten, imperatorin, isoimperatorin, osthol, psoralen Coumarin có các tác

5
dụng sinh học chống ung thƣ [18], [19], chống oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm
[10].
● Alkaloid: alkaloid có nhiều trong họ Rutaceae [20], [21], [22]. Thông thƣờng các loài
Citrus có chứa alkaloid có cấu trúc protoalkaloid là dẫn xuất của tyramin [21], [22]. Các
alkaloid này có tác dụng diệt côn trùng [22].
● Flavonoid: flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài Citrus, phân bố ở
tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lƣợng cao trong vỏ quả [9], [23], [24]. Hiện nay số lƣợng
flavonoid đã đƣợc phân lập và xác định từ vỏ quả các loài Citrus là khoảng hơn 60 chất, thuộc
các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin (Hình 1) [23], [24]. Thông thƣờng, các
flavonoid tồn tại trong Citrus ở cả dạng aglycon tự do và dạng glycosid [23].
O
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'

2'
3'
4'
5'
6'
O
O
2
4
5
7
1'
2'
4'
O
O
2
4
5
7
1'
3'
4'
Khung flavanon
Khung flavon
Khung flavonol
OH
O
O
+

2
4
5
7
1'
3'
4'
Khung anthocyanin
OH
OH
HO

Hình 1. Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus.

2.2. Flavonoid trong vỏ quả các loài Citrus (citroflavonoid)
Thành phần flavonoid chính có trong vỏ quả của các loài Citrus là các flavan glycosid
của chúng [9], [23]. Một số flavonoid gồm các flavan aglycon gồm naringenin, isosakuranetin,
hesperitin, và eriodictyol, còn các glycosid của chúng đa số có đƣờng gắn với cacbon ở vị trí
số 7 (Hình 2). Trong số các flavan, naringenin, hesperitin và các glycosid của chúng là
naringin, hesperidin là các thành phần chính của vỏ quả các loài Citrus [26], [27]. Các chất này
chiếm hàm lƣợng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô [28], và chiếm tới hơn 90%
flavonoid toàn phần trong vỏ quả Citrus [23], [24], [25], [26], [27]. Trong nhiều loài Citrus,
các glycosid naringin và hesperidin có nhiều trong quả nhƣng lại không tìm thấy dạng aglycon
của chúng [28], [29]. Điều đặc biệt là narigenin, naringin, hesperitin, và hesperidin có hàm
lƣợng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhƣng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác [9]. Vì
vậy, chúng đƣợc coi là các flavonoid đặc trƣng của chi Citrus, và đƣợc gọi là citroflavonoid.
Các flavon cũng có thấy ở các loài Citrus, nhƣng trong vỏ quả thì có hàm lƣợng thấp hơn
nhiều [23], [26], [27], [28]. Thƣờng gặp là apigenin, luteolin, diosmetin, nobiletin, tangeretin,
sinensetin và glycosid của diosmetin là diosmin và neodiosmin (Hình 3). Trong số này,
diosmetin, nobiletin, và diosmin có hàm lƣợng cao, còn quercetin và rutin cũng hay gặp trong

quả Citrus nhƣng có hàm lƣợng thấp [23], [29].
Các anthocyanin là các chất màu quan trọng trong quả của các loài Citrus, đặc biệt là các
loài cam, quít, quất [25], [26]. Thông thƣờng thi khi quả chín sẽ có hàm lƣợng anthocianidin
cao, do đó vỏ quả từ xanh sẽ chuyển sang màu vàng, màu cam, hoặc đỏ. Các anthocyanin
thƣờng thấy trong chi Citrus là cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin [30].


6
O
O
HO
OH
OH
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
O
HO
OH
OH
2
4
5
7

1'
2'
4'
O
O
HO
OH
OCH
3
2
4
5
7
1'
3'
4'
Naringenin
Isosakuranetin
O
O
HO
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'

3'
4'
Hesperetin
Eriodictyol
O
O
O
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
OH
O
O
HO
H
3
C
Hesperidin
O

O
O
OH
OH
2
4
5
7
1'
4'
O
HO
HO
O
Narigin
OH
O
O
O
OH
OH
2
4
5
7
1'
4'
O
HO
HO

OH
O
O
HO
H
3
C
Narirutin
O
O
O
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Neohesperidin
OH
O
OH

HO
HO
H
3
C
O
OH
HO
HO
H
3
C
OH
HO
HO
OH
O
O
O
OH
OH
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O

HO
HO
OH
O
O
HO
H
3
C
Eriocitrin
O
O
O
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Neoeriocitrin
OH

O
OH
HO
HO
H
3
C
HO
OH
O
O
O
OH
OCH
3
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
OH
O
O
HO
H

3
C
Didymin
O
O
O
OH
OCH
3
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Poncirin
OH
O
OH
HO
HO
H
3
C
HO

OH

Hình 2. Flavonoid nhóm flavan trong quả các loài Citrus và các glycosid của chúng


7

Hình 3. Flavonoid nhóm flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus.

3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CITROFLAVONOID
Nhƣ đã trình bày ở trên, flavonoid là một trong những thành phần hóa học chính của các
loài Citrus. Các citroflavonoid cũng giống nhƣ các flavonoid nói chung, có rất nhiều tác dụng
sinh học đã đƣợc biết. Dƣới đây nhóm tác giả liệt kê những tác dụng có nhiều ý nghĩa trong
việc sử dụng chúng làm thuốc trong y học.
3.1. Tác dụng chống oxy hóa
Các flavonoid có nhóm hydroxy (OH) gắn với vòng thơm có tác dụng chống oxy hóa [31].
Nếu flavonoid có nhóm catechin (nhóm o-dihydroxy), hay có một nhóm OH ở vị trí số 3 và số
5 (Hình 4) sẽ cho tác dụng chống oxy hóa mạnh [31], [32]. Các nhóm này có tác dụng loại bỏ

8
các gốc tự do trong của cơ thể, nhƣ các gốc tự do superoxid (O
2
-
●
), hydroxy (OH
●
), lipid
peroxyl (LOO
●
), lipid alkoxyl (LO

●
), oxyd nitric (NO
●
). Các gốc tự do là nguyên nhân gây ra
quá trình oxy hóa trong cơ thể, chúng có thể gây ra sự oxy hóa lipid, protein và kể cả DNA
[33]. Khi các quá trình oxy hóa xảy ra nhiều trong cở thể, chúng sẽ gây ra sự phá hủy các tế
bào và do đó dẫn đến bệnh tật.

Hình 4. Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid
Các Citrus flavonoid, vì vậy, có tác dụng chống oxy hóa mạnh [24], [25]. Thông thƣờng
thì các aglycon flavonoid có tác dụng mạnh hơn các glycosid của chúng [32]. Chúng giúp cơ
thể chống lại sự oxy hóa lipid, protein và DNA gây ra bởi các gốc tự do.
3.2. Tác dụng giảm mỡ máu
Citroflavonoid có tác dụng hạ cholesterol trong máu, góp phần điều hòa mỡ trong máu
của ngƣời béo phì, ngƣời già và do đó phòng ngừa bệnh tật [24], [25].
3.3. Tác dụng chống viêm
Các flavonoid nói chung và citroflavonoid nói riêng có tác dụng chống viêm. Chúng ức
chế các enzym gây ra quá trình viêm nhƣ cyclooxygenase (COX), lipoxigenase, phospholipase,
phosphodiesterase [24]. Trên mô hình in vitro, mô hình tế bào, các flavonoid đã đƣợc chứng
minh có tác dụng chống viêm [35], [36]. Trên mô hình in vivo, diosmin [25] và hesperidin [37]
có tác dụng ức chế quá trình viêm gây ra bởi carragenin trên chuột.
3.4. Chống các bệnh tim mạch
Vì có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol trong máu, và tác dụng chống viêm nên các
citroflavonoid có tác dụng phòng và chống các bệnh về tim mạch. Làm bền thành mạch, chống
oxy hóa các lipoprotein và chống viêm đã đem lại tác dụng chống vữa xơ động mạch, một
bệnh rất hay gặp ở ngƣời cao tuổi và ngƣời béo phì. Các citroflavonoid còn có tác dụng chống
kết dính tiểu cầu và tăng tính thấm của mao mạch [36]. Đây là một tác dụng quan trọng của
flavonoid vì nó giúp thành mạch bền vững hơn và nó chống các rối loạn thành mạch nhƣ vữa
xơ động mạch, nhồi máu cơ tim, viêm tĩnh mạch gây tê đau tay chân, trĩ [33], [34]. Những tác
dụng trên cũng góp phần làm giảm một số triệu chứng các bệnh về não nhƣ bệnh mất trí nhớ,

Alzheimer và Parkinson [36]. Các công ty dƣợc phẩm trên thế giới đã dựa trên tác dụng này
của citroflavonoid để làm thuốc chữa bệnh. Một số sản phẩm lƣu hành trên thị trƣờng đƣợc liệt
kê ở phần dƣới đây.
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H

9
3.5. Chống ung thƣ
Tác dụng chống ung thƣ của citroflavonoid đã đƣợc chứng minh trên cả in vitro và in
vivo [23], [24], [36]. Chúng có tác dụng chống đột biến gen, vì có tác dụng bảo vệ DNA trƣớc
sự tấn công của các tác nhân gây ung thƣ nhƣ các gốc tự do, các tác nhân vật lý và hóa học
[24], [25]. Các citroflavonoid cũng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ và ức chế sự
phát triển của khối u nên phòng ngừa và làm chậm quá trình sinh ung thƣ và phát triển ung thƣ
[24], [25], [36].
3.6. Các sản phẩm thuốc trên thị trƣờng có hoạt chất là các citroflavonoid
Các công ty Dƣợc phẩm hàng đầu thế giới của nƣớc Pháp đã đƣa ra một số sản phẩm có
hoạt chất là các citroflavonoid nhƣ Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Circularine.
Trong đó, sản phẩm Daflon, dạng bào chế là viên bao phim, của công ty Dƣợc phẩm Servier,
Pháp là nổi tiếng nhất và bán đƣợc nhiều nhất. Thành phần chính của thuốc Daflon là phân
đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài Citrus, hàm lƣợng 500 mg (bao gồm diosmin
450 mg và flavonoid tƣơng đƣơng với 50 mg hesperidin). Thuốc có tác dụng làm tăng trƣơng
lực của tĩnh mạch, giảm ứ trệ ở tĩnh mạch, tăng sức bền ở mao mạch, đƣợc dùng điều trị các

bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân) và điều trị
các triệu chứng của bệnh trĩ. Thuốc Daflon đã đƣợc lƣu hành ở Việt Nam từ lâu và bán rất
chạy trên thị trƣờng.
Hiện tại chƣa có sản phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài
Citrus đƣợc sản xuất bởi các công ty dƣợc phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất
lớn về các thuốc này.
4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ CITROFLAVONOID
Các nghiên cứu trong nƣớc về chi Citrus lại chủ yếu về tinh dầu, dinh dƣỡng, trồng trọt
để tăng giá trị kinh tế. Vẫn còn có ít nghiên cứu về các citroflavonoid.
Năm 1990, Nguyễn Thị Chung đã có nghiên cứu về chiết xuất và bào chế các flavonoid
từ vỏ quả của một số loài Citrus ở Việt Nam ở qui mô nhỏ [39]. Gần đây, Võ Văn Lèo đã thực
hiện luận án nghiên cứu về các loài Citrus thu hái ở miền nam. Đây là nghiên cứu sâu và toàn
diện về thành phần citroflavonoid [40]. Tác giả đã công bố một số kết quả chính thu đƣợc sau
đây: (1) Phân lập đƣợc từ vỏ bƣởi hai flavonoid glycosid hesperidin và naringin. Các aglycon
của chúng là hesperidin và naringin thu đƣợc bằng cách thủy phân hai glycosid tƣơng ứng.
Xây dựng đƣợc qui trình chiết xuất quy mô phòng thí nghiệm hai flavonoid glycosid này. (2)
Phân lập đƣợc 5 chất thuộc nhóm polymethoxyflavon là 7-hydroxy-3,3,4,5,6,8-
hexamthoxyflavon, nobiletin, 5-O-desmethylnobiletin, sinensetin, tangeretin. Hai chất có hàm
lƣợng rất cao trong vỏ quả Citrus là nobiletin và tangeretin (3). Xây dựng đƣợc phƣơng pháp
định lƣợng hai thành phần citroflavonoid chính là naringin và hesperidin trong vỏ quả các loài
Citrus bằng các phƣơng pháp điện di mao quản (CE), đo quang (UV-VIS), và sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC). Các kết quả khẳng định rằng hàm lƣợng hesperidin và naringin trong các
loài chanh, bƣởi là rất cao, thấp nhất là 2,8%, thông thƣờng là khoảng 5−10%, và đặc biệt quả
thanh bì thu hái ở Tiền Giang có hàm lƣợng hesperidin tới tận hơn 23%.

10
Tác giả Nguyễn Văn Tựu đã chiết xuất hesperidin với hiệu suất khá cao và đã đƣa ra
đƣợc tiêu chuẩn cho dƣợc liệu vỏ quít [41]. Đây là tiêu chuẩn cho dƣợc liệu dùng trong Y học
cổ truyền, còn đƣợc gọi với tên khác là trần bì.
5. CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID

Thông thƣờng để chiết xuất flavonoid nói chung từ dƣợc liệu, ngƣời ta thƣờng dùng qui
trình sau đây (Hình 5). Theo qui trình này thì sau khi chiết với cồn (EtOH), tất cả các chất từ ít
phân cực và phân cực đều đƣợc chiết và hòa tan vào dung môi cồn. Sau khi lắc với n-hexan để
loại chất béo và chất ít phân cực (sẽ ở phân đoạn 1), lắc tiếp phân đoạn nƣớc với ethyl acetate
(EtOAc) rồi cô cạn dung môi EtOAc sẽ cho phân đoạn flavonoid toàn phần. Phân đoạn
flavonoid toàn phần sẽ chứa cả flavonoid dạng aglycon và dạng glycosid. Tuy nhiên trong
phân đoạn này vẫn còn có nhiều tạp chất ít phân cực khác và hàm lƣợng flavonoid glycosid sẽ
thấp vì vẫn còn có rất nhiều glycosid vẫn ở trong phân đoạn nƣớc [9].


Hình 5. Qui trình (I) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu
Còn một cách khác để chiết flavonoid nhƣ trong qui trình II (Hình 6). Ở qui trình này,
thì các chất có độ phân cực kém đã bị loại bỏ từ đầu. Do đó dịch chiết EtOAc sẽ có các chất
phân cực vừa phải, vì EtOAc là một dung môi có độ phân cực trung bình. Nhƣ vậy nếu muốn
chiết flavonoid glycosid thì qui trình II sẽ cho hiệu suất thấp hơn qui trình I, bởi vì chỉ có rất ít
flavonoid glycosid tan trong EtOAc. Cả hai qui trình I và II đều là các qui trình nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm, sử dụng các dung môi độc hại, đắt tiền (n-hexan, CHCl
3
, EtOAc) và
có hiệu suất chiết xuất không cao. Các qui trình này chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu,
chiết tách và phân lập flavonoid từ dƣợc liệu.
Tác giả Võ Văn Lẹo có đƣa ra 3 qui trình chiết xuất hesperidin và naringin [40] là chiết
ngấm kiệt hoặc chiết nóng với cồn (Hình 7, qui trình III) và chiết với nƣớc nóng (Hình 8, qui
trình IV). Qui trình III tƣơng tự nhƣ qui trình I, nhƣng có ƣu điểm không dùng các dung môi là
Dƣợc liệu
chiết với cồn
Cao chiết toàn phần
Bã dƣợc liệu

Phân đoạn 1

thu hồi dung môi đến tỷ lệ 1:1
(1 kg dƣợc liệu cho 1 lít cao)
Flavonoid toàn phần
lắc với n-hexan

Phân đoạn nƣớc
thu hồi dung môi
lắc với EtOAc
Phân đoạn nƣớc
thu hồi dung môi EtOAc
thêm đồng thể tích nƣớc

11
CHCl
3
và EtOAc, là các dung môi độc hại không đƣợc phép sử dụng trong công nghiệp dƣợc
phẩm. Nếu hàm lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu cao thì có thể kết tinh dễ dàng chứ không cần
phải loại tạp [40]. Tuy nhiên, nếu để kết tinh thì sẽ cho hiệu suất thấp và nhiều đƣờng khác
cũng có thể kết tinh theo. Tác giả Nguyễn Văn Tựu cũng đã chiết xuất hesperidin với hiệu suất
khá cao từ dƣợc liệu vỏ quít [41], tuy nhiên, qui mô của qui trình này là trong phòng thí
nghiệm (1 kg/mẻ).
Theo qui trình IV thì các flavonoid đƣợc chiết bằng nƣớc nóng rồi sau đó loại tạp bằng
cách thêm cồn và lọc. Qui trình này cũng có ƣu điểm là không sử dụng các dung môi độc hại
và đơn giản, nhƣng nhƣợc điểm của nó lại là tốn nhiều năng lƣợng để đun sôi nƣớc và để bay
hơi dung môi. Nếu chiết xuất ở qui mô lớn, việc này sẽ có thể làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng
sản phẩm do tiếp xúc với nhiệt độ cao và làm tăng giá thành sản phẩm do cần nhiều năng
lƣợng. Mặt khác có nhiều flavonoid có độ phân cực thấp nên sử dụng dung môi là nƣớc sẽ
không cho hiệu suất cao.

Hình 6. Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu


Dƣợc liệu
chiết với ether dầu hỏa
Dƣợc liệu
Phân đoạn I

thu hồi dung môi
Phân đoạn II
Flavonoid toàn phần
chiết với CHCl
3
Dƣợc liệu
Bã dƣợc liệu
thu hồi dung môi
chiết với EtOAc

thu hồi dung môi

12


Hình 7. Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi



Hình 8. Qui trình (IV) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi

Theo GS. Nguyễn Văn Đàn, flavonoid có thể đƣợc chiết xuất bằng nƣớc vôi trong [42].

Vì nƣớc vôi có tính kiềm, flavonoid có tính acid nên có thể flavonoid có thể tan trong môi
trƣờng kiềm, sau đó trung hòa lại bằng acid sẽ đƣợc flavonoid không tan, lọc lấy tủa đƣợc
flavonoid thô. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để chiết xuất các flavonoid có tính acid mạnh,
có độ phân cực lớn nhƣ rutin từ hoa hòe, polyphenol trong chè

Dƣợc liệu
chiết với cồn
Dƣợc liệu
Cao lỏng

thu hồi dung môi
Phân đoạn Ether
Tủa flavonoid thô
lắc với ether dầu hỏa

Cao lỏng
Tạp chất
để lạnh dịch lọc
nƣớc sôi, loại tạp, lọc

thu hồi dung môi
Dƣợc liệu
chiết với nƣớc nóng
Dƣợc liệu
Cao lỏng

lọc, đun cách thủy
Tủa pectin
Tủa flavonoid thô
thêm EtOH, lọc

Cao lỏng
Tạp chất
để lạnh dịch lọc
loại tạp bằng than hoạt, lọc

thu hồi dung môi

13
6. VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT
Trƣớc hết có thể thấy rằng nguồn nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus ở Việt Nam là rất
sẵn có, phong phú, sản lƣợng nhiều, quanh năm, ở các vùng trong cả nƣớc. Tuy nhiên, việc tận
dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất thuốc thì mới chỉ có trong y học cổ truyền, chƣa có
ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Phần rất lớn nguồn nguyên liệu bị vứt bỏ. Nếu tận dụng
đƣợc, chúng ta có thể sản xuất trong nƣớc mà không phải nhập khẩu thuốc hay nguyên liệu
làm thuốc nữa.
Thực tế thì vẫn còn ít nghiên cứu về qui trình chiết xuất các citroflavonoid ở Việt Nam.
Các qui trình đã đƣợc nêu trong phần tổng quan là các qui trình đƣợc áp dụng trong nghiên cứu
cơ bản ở mô hình phòng thí nghiệm, đƣợc xây dựng thông qua các nghiên cứu cơ bản phục vụ
luận văn tốt nghiệp, luận án tốt nghiệp. Không thể áp dụng trực tiếp đƣợc các qui trình cho qui
mô công nghiệp. Nếu muốn có qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp thì phải có nghiên cứu
đầy đủ, từ nguồn nguyên liệu, lựa chọn hoạt chất, lựa chọn nguyên liệu, qui trình chiết xuất,
hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng các citroflavonoid trong sản phẩm, hiệu quả kinh tế…
Vấn đề cần giải quyết ở đây là qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô
công nghiệp để có thể áp dụng cho sản xuất lớn. Trong đề tài này, chúng tôi đặt mục tiêu chiết
xuất citroflavonoid ở qui mô pilot (≥ 100 kg/mẻ). Nó đòi hỏi chúng ta phải đầu tƣ nghiên cứu
phát triển từ các qui trình đã nêu trên đây. Các vấn đề cần giải quyết là lựa chọn dung môi,
nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dƣợc liệu, dung môi, phƣơng pháp loại tạp chất. Vấn đề kiểm soát chất
lƣợng của sản phẩm cũng rất quan trọng vì mục tiêu là có sản phẩm cho sản xuất thành phẩm
phòng, chữa bệnh. Do đó, việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào, tiêu chuẩn hóa và độ ổn

định của sản phẩm cũng là các nội dung cần giải quyết của đề tài.





















14

PHẦN II. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại Việt Nam và các hoạt chất
flavonoid của chúng.

2. NGUYÊN LIỆU
2.1. Nguyên liệu cho chiết xuất
Sau khi khảo sát các loài trên về nguồn liệu, hàm lƣợng citroflavonoid, chiết xuất
citroflavonoid ở qui mô nhỏ, vỏ quả của một (hoặc vài) loài Citrus sẽ đƣợc lựa chọn cho
nghiên cứu về xây dựng qui trình công nghệ ở qui mô pilot.
2.2. Dung môi, hóa chất
Các dung môi hóa chất dùng cho nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm và chiết xuất ở
qui mô pilot là các dung môi công nghiệp. Cồn đƣợc sử dụng là cồn công nghiệp ethanol 96%
đạt tiêu chuẩn VN III (cục đo lƣờng tiêu chuẩn VN), đƣợc mua của các công ty phân phối
trong nƣớc. Nƣớc dùng cho chiết xuất đạt tiêu chuẩn về độ sạch trong sinh hoạt (nƣớc máy).
Các dung môi, hóa chất, nguyên liệu dùng cho xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đạt tiêu chuẩn
phân tích, kiểm nghiệm đƣợc mua của hãng Merck: các dung môi cho HPLC (acetone,
acetonitril, n-butanol, chloroform, ethanol, ethyl acetate, n-hexane, n-propanol, các loại hệ
đệm), silica gel cho sắc ký lớp mỏng pha thuận (silica gel F
254
) và pha đảo (RP-18 F
254
) cột sắc
ký HPLC pha đảo, các hóa chất khác).
Các dung môi, hóa chất sử dụng cho thử tác dụng sinh học, kit định lƣợng, hoá chất xét
nghiệm, và làm tiêu bản mô bệnh học đều đạt tiêu chuẩn cho thử tác dụng sinh học và đƣợc
mua của các hãng hóa chất có uy tín Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức), Hospitex Diagnostics
(Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo).
2.3. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng Swiss thuần chủng, trƣởng thành, 18-22 g, đƣợc mua của Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ƣơng (Bộ Y tế).
Thỏ chủng Newzealand white, cả hai giống (đực và cái), khoẻ mạnh, lông trắng, trọng
lƣợng 1,8 – 2,5 kg do Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp. Động vật thực
nghiệm đƣợc nuôi 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức

ăn chuẩn riêng cho từng loại (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN cung cấp) tại phòng thí
nghiệm của bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
Động vật thí nghiệm sau khi mua về đƣợc nuôi tại phòng nuôi động vật của Viện Dƣợc
liệu 5-7 ngày trƣớc khi tiến hành làm thí nghiệm. Điều kiện của phòng nuôi động vật đạt tiêu
chuẩn thí nghiệm sinh học. Phòng đƣợc bật điện sáng 10-12 giờ/ngày (từ 8 giờ sáng đến 6-8
giờ tối).


15
3. THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1. Thiết bị sử dụng cho điều tra, khảo sát các loài Citrus
- Dao, kéo, túi, giầy, báo, dây buộc
- Phim ảnh, máy ảnh
- Hóa chất, dung môi xử lý mẫu
- Các mẫu tiêu bản gốc (tại Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu)
- Các tài liệu về phân loại thực vật của Việt Nam và thế giới.
3.2. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu qui mô phòng thí nghiệm
- Bếp cách thủy các cỡ: cho bình chiết từ 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 lít, 2 lít, 3 lít đến 10
lít, 20 lít
- Máy cất quay thu hồi dung môi các cỡ: dung tích bình cất từ 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1
lít, 2 lít, 3 lít đến 10 lít, 20 lít
- Thiết bị chiết Sohxlet các cỡ: dung tích từ 250ml, 500ml đến 5 lít
- Thiết bị chiết cách dầu: dung tích bình chiết 30 lít
- Cột sắc ký các loại
- Máy xay dƣợc liệu
- Tủ sấy thƣờng dung tích 100 lít (Binder – FD 115)
- Tủ sấy chân không dung tích 20 lít
- Các loại cân phân tích
- Máy đo độ ẩm (Precisa HA60)
- Máy ly tâm

- Máy đo quang phổ tử ngoại UV-VIS (Varian)
- Máy đo quang phổ hồng ngoại IR
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (Bruker 500 MHz, Viện Hóa học, VAST)
- Máy đo phổ khối MS (Agilent, Viện Hóa sinh biển)
- Máy định lƣợng sinh hoá bán tự động Scout- Italya
- Máy phân tích máu tự động SYSMEX KX21- Mỹ.
3.4. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ở qui mô pilot
Dây chuyền chiết xuất dƣợc liệu sẵn có tại Viện Dƣợc liệu, gồm có :
- Nồi hơi dầu công suất 500 kg hơi/ giờ
- Máy xay dƣợc liệu
- Máy xay bột thuốc
- Kho lạnh để bảo quản sản phẩm chiết xuất
- Cột sắc ký 15cm×60cm
- Dây chuyền chiết xuất Công suất đạt 100−170 kg dƣợc liệu/mẻ
+ 02 Bình chiết có dung tích 1000 lít
+ 01 Bình trung gian để đựng dung môi 1000 lít
+ 01 Bình cô dịch chiết dung tích 1000 lít
+ 01 Bơm đảo dịch chiết
+ 01 Bơm chân không

16
+ Hệ thống sinh hàn bằng máy làm lạnh
+ 01 Tủ sấy chân không dung tích 3 m
3
.
3.5. Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm
- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật)
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Shimadzu, Nhật)
- Máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC, Camag, Đức)
- Máy đo độ hấp thụ quang phổ tử ngoại (UV-VIS, Shimadzu, Nhật)

- Máy đo độ ẩm (Precisa HA60)
- Bộ chiết Soxhlet
- Tủ sấy
- Kính hiển vi điện tử có gắn máy chụp ảnh
- Phần mềm Excel (Microsoft Office).
3.5. Thiết bị sử dụng cho thử tác dụng sinh học
- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động (Scout, Italy)
- Máy phân tích máu tự động (SYSMEX KX21, Japan)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich- Germany)
- Máy đo quang UV-VIS (Shimazdu, Japan)
- Máy cắt vi phẫu, tiêu bản
- Máy Screen master (Hospitex Diagnostics, Italy)
- Kính hiển vi điện tử có chức năng chụp ảnh (Canon, Japan).
4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1. Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu các loài thuộc chi Citrus
- Điều tra, thu thập thông tin theo phƣơng pháp phỏng vấn trực tiếp (theo phiếu điều tra).
- Điều tra, thu thập mẫu theo Quy trình điều tra dƣợc liệu của Bộ Y tế [43], có sửa đổi và
bổ sung [44].
- Xử lý, bảo quản tiêu bản và mẫu vật theo Phƣơng pháp của Pháp và Vƣờn Thực vật
Missouri, Hoa Kỳ [44].
- Xác định tên khoa học bằng phƣơng pháp so sánh hình thái thực vật, đối chiếu với khóa
phân loại trong các bộ Thực vật chí hiện có của các nƣớc [44].
4.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng các citroflavonoid
- Xây dựng phƣơng pháp định tính các citroflavonoid trong dƣợc liệu bằng sắc ký lớp
mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [45].
- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng citroflavonoid toàn phần bằng phép đo quang (UV-
VIS) và bằng HPLC [45].
- Việc xây dựng phƣơng pháp dựa trên các nghiên cứu khảo sát:
+ Xây dựng qui trình xử lý mẫu, chiết xuất và tinh chế mẫu trƣớc khi đo UV hoặc
bơm vào máy HPLC

+ Lựa chọn điều kiện sắc ký
+ Khảo sát khoảng tuyến tính của phép định lƣợng

17
+ Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp
+ Khảo sát độ đúng của phƣơng pháp.
- Các hoạt chất có tác dụng chính phân lập ở trên đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu để
định tính và định lƣợng:
+ Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần
+ Hàm lƣợng hesperidin
+ Hàm lƣợng naringin.
4.3. Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm [42], [46], [47]
- Xây dựng quy trình chiết xuất dựa trên các khảo sát về dung môi dùng để chiết xuất,
kích thƣớc dƣợc liệu phù hợp, tỷ lệ giữa dƣợc liệu và dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian
chiết, năng lƣợng cần đủ
- Loại tạp chất (chất béo, muối hữu cơ, ion vô cơ, đƣờng tự do, protein ) bằng phƣơng
pháp và dung môi phù hợp.
- Chọn phƣơng pháp loại dung môi và sấy phù hợp để khống chế nhiệt độ và thời gian
hoạt chất tiếp xúc với nhiệt.
- Quy mô mẻ chiết: 1 kg dƣợc liệu/mẻ.
- Tiêu chí đánh giá qui trình: hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng citroflavonoid trong sản
phẩm chiết xuất, tính khả thi của qui trình (dùng dung môi ít độc, rẻ tiền, quy trình đơn
giản dễ áp dụng cho sản xuất quy mô lớn).
- Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng
citroflavonoid trong sản phẩm dựa trên ít nhất 06 mẻ chiết.
4.4. Triển khai các quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot [48]
- Áp dụng qui trình chiết xuất đã xây dựng ở quy mô phòng thí nghiệm với khối lƣợng
mẻ chiết lớn hơn (≥ 100 kg/mẻ) trên dây chuyền thiết bị quy mô pilot.
- Điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp để đạt hiệu quả chiết xuất cao, tiết kiệm đƣợc
dung môi và năng lƣợng.

- Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng
citroflavonoid trong sản phẩm dựa trên ít nhất 06 mẻ chiết.
4.5. Phân lập các hoạt chất flavonoid chính làm chất đối chiếu [42], [46], [47]
- Chiết xuất phân đoạn chứa citroflavonoid từ dƣợc liệu bằng các dung môi có độ phân
cực khác nhau.
- Phân lập các flavonoid bằng các phƣơng pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột pha
thƣờng (silica gel), sắc ký cột pha đảo (YMC, RP-18, ODS), cột Sephadex LH-20, cột
trao đổi ion (diaion HP-20).
- Tinh chế các flavonoid phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp kết tinh lại, bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC), hoặc phƣơng pháp thích hợp khác.
- Khẳng định công thức hóa học của các chất chiết đƣợc dựa trên các tính chất hóa-lý
(trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực []
D
) và các phổ tử ngoại (UV),
hồng ngoại (IR), cộng hƣởng từ hạt nhân (
1
H,
13
C NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

18
hai chiều (HMBC, HMQC, COSY, NOESY), phổ khối (MS), và các phƣơng pháp hóa
học nếu cần.
4.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus và sản phẩm bột
citroflavonoid [45]
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus dựa trên các chỉ tiêu chung
đƣợc qui định tại dƣợc điển Việt Nam IV gồm: mô tả cảm quan, soi bột, vi phẫu, độ ẩm
dƣợc liệu, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính, định lƣợng.
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid gồm mô tả chế phẩm, độ
ẩm, tro toàn phần, định tính bằng sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) theo qui

định tại dƣợc điển Việt Nam IV, định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp
(HPLC).
4.7. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học của bột citroflavonoid
4.7.1. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm
Tác dụng loại bỏ các gốc tự do DPPH (viết tắt của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl),
hydroxyl radical (OH
●
), superoxyde (O
2
−●
) bằng phƣơng pháp đo quang (UV-VIS). Các bƣớc
tiến hành đƣợc mô tả cụ thể dƣới đây.
a) Thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH
Tác dụng loại bỏ gốc tự do DPPH (gốc tự do tổng hợp hóa học) đƣợc thử theo phƣơng
pháp đã mô tả trƣớc đây [48]. Cụ thể, gốc tự do DPPH đƣợc hòa trong ethanol ở nồng độ 100
M ngay trƣớc khi thí nghiệm. Sau đó dung dịch DPPH đƣợc cho vào các giếng của một đĩa 96
giếng, mỗi giếng 195 l. Tiếp đến cho vào mỗi giếng 5 l dung dịch mẫu thử. Mỗi mẫu thử
đƣợc thử trong 4 giếng trên 1 đĩa. Để hỗn hợp thu đƣợc trong phòng kín 30 phút rồi đem đo
quang ở bƣớc sóng 520 nm. Song song làm mẫu đối chứng âm không có mẫu thử, có 200 l
dung dịch DPPH (A
o
) và mẫu đối chứng dƣơng (quercetin, catechin, vitamin E) làm giống mẫu
thử. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Khả năng dọn gốc tự do DPPH đƣợc tính toán theo công thức:
I
DPPH
(%) = [(A
o
– A
m

)/A
o
]×100
Trong đó: I
DPPH
(%): Khả năng dọn gốc tự do DPPH của mẫu thử; A
o
: Độ hấp thụ ánh
sáng (OD) của dung dịch DPPH (không chứa dịch chiết); A
mt
: Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của
mẫu thử (mẫu thử trong dung dịch DPPH).
b) Thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do superoxide anion (O
2
−●
)
Cho vào ống nghiệm hỗn hợp gồm có: 5 l dung dịch mẫu thử, 470 l dung dịch đệm
phosphat (Na
2
HPO
4
, 20 mM, pH 7,8), 10 l dung dịch xanthin (5 mM), 10 l dung dịch NBT
(5 mM), và cuối cùng cho 5 l dung dịch enzym XO. Trộn đều hỗn hợp trong khoảng 1 phút
rồi để yên trong 5 phút tiếp theo ở điều kiện thƣờng. Dung dịch thu đƣợc đem đo mật độ quang
(A
m
) ở bƣớc sóng 560 nm (có thể chọn 550 nm). Tiến hành đo mật độ quang của mẫu cùng với
mẫu trắng để so sánh (không có chất thử và không cho enzym XO), dung dịch chỉ có chất thử
(A
mt

, 10 l dung dịch mẫu trong 490 l dung dịch đệm), dung dịch phản ứng không cho mẫu
(Ao), và mẫu đối chứng dƣơng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí
nghiệm.

19
Hoạt tính ức chế của mẫu thử đƣợc tính theo công thức:
I
XO
(%) = [(A
c
– A
m
)/A
c
]×100
Trong đó: I
XO
(%): khả năng dọn gốc tự do superoxide anion, A
c
: Độ hấp thụ (OD) của
mẫu chứng, A
m
: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử [49].
c) Thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do superoxide anion (OH
●
)
Cho vào ống nghiệm hỗn hợp gồm có: 450 l dung dịch đệm phosphat (Na
2
HPO
4

, nồng
độ 20 mM, pH 7,4), 10 l dung dịch đƣờng deoxyribose (nồng độ 140 mM), 10 l dung dịch
Fe
3+

(FeCl
3
, 5 mM), 10 l dung dịch acid ascobic (5 mM), 10 l dung dịch H
2
O
2
(500 mM), và
10 l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ cần thử. Trộn hỗn hợp trong khoảng 1 phút rồi để yên
trong 30 phút ở bóng tối, nhiệt độ thƣờng. Dung dịch sau khi phản ứng đƣợc cho thêm 250 l
dung dịch TCA 20% và 250 l dung dịch TBA 1%, sau đó đem đung sôi cách thủy trong
khoảng 15 phút. Hỗn hợp thu đƣợc để nguội đến nhiệt độ thƣờng rồi đem đo mật độ quang
(A
m
) ở bƣớc sóng 532 nm (có thể chọn ánh sáng có bƣớc sóng trong khoảng 530-535 nm). Tiến
hành đo mật độ quang của mẫu cùng với mẫu trắng để so sánh (không có chất thử và không cho
Fe
3+
), dung dịch chất thử trong dung dịch đệm (A
m
,

10 l dung dịch mẫu thử, 490 l dung dịch
đệm), dung dịch phản ứng không cho mẫu thử (A
o
, 480 l dung dịch đệm phosphat, 10 l dung

dịch đƣờng deoxyribose, 10 l dung dịch Fe
3+
), và mẫu đối chứng dƣơng. Lặp lại thí nghiệm 3
lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Khả năng dọn gốc tự do OH
•
của mẫu thử (cho cả chất đối chiếu dƣơng) đƣợc tính theo
công thức:
I
OH
(%) = [(A
c
– A
m
)/(A
c
)]×100
Trong đó: I
OH
(%): Khả năng dọn gốc tự do OH
•
; A
c
: Độ hấp thụ (OD) của mẫu chứng;
A
m
: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử [50].
d) Xác định tác dụng chống oxy hóa lipid
Chuột thí nghiệm
Chuột Swiss thuần chủng, trƣởng thành, cả đực vào cái, nặng 18-22 g. Chuột đƣợc mua

ở Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng (Bộ Y tế), đƣợc nuôi trong nhà nuôi động vật của Viện
Dƣợc liệu 1 tuần trƣớc khi thí nghiệm. Trong thời gian này, chuột đƣợc cho uống nƣớc và ăn
thức ăn bình thƣờng.
Tách lipid từ não chuột
Trƣớc khi thí nghiệm 24 giờ, chuột chỉ đƣợc uống nƣớc mà không đƣợc ăn thức ăn. Để
lấy não chuột, giết chuột bằng ete rồi dùng dao mổ đầu, bóc xƣơng sọ để lấy não, rửa sạch máu
bằng dung dịch NaCl 0,9% lạnh (<4
0
C). Thu não của toàn bộ chuột đem nghiền thành đồng thể
với dung dịch đệm Na
2
HPO4 (20 mM, pH 7,4, nhiệt độ của dung dịch < 4
o
C) theo tỷ lệ 1:9.
Sau khi nghiền kỹ, não đồng thể đƣợc đem ly tâm ở 9000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ
4
o
C. Lấy phần hỗn dịch phía trên có chứa lipid để làm thí nghiệm tiếp theo. Hỗn dịch này có
thể bảo quản ở -80
o
C đến khi làm thí nghiệm, thời gian bảo quản kéo dài đƣợc 1 năm. Ngay
trƣớc khi dùng làm thí nghiệm, hỗn dịch chứa lipid não chuột đƣợc làm lạnh đến 4
o
C, trộn đều,