Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng

Mục lục
MỤC LỤC
Mục lục...........................................................................................................................i
Danh mục bảng.............................................................................................................iii
Danh mục hình..............................................................................................................iv
Lời mở đầu.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN...................................................................2
1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu.............................................................................2
1.2 Enzyme...............................................................................................................3
1.2.1 Phân loại......................................................................................................3
1.3 Enzyme Bromelain.............................................................................................3
1.3.1 Cấu tạo hóa học...........................................................................................4
1.3.2 Cấu trúc không gian....................................................................................4
1.3.3 Tính chất vật lý...........................................................................................5
1.3.4 Hoạt tính của Bromelain.............................................................................5
a. Hoạt tính phân giải........................................................................................5
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelain............................................6
CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN........................8
.........................................................................................................................................
2.1 Ứng dụng trong y dược......................................................................................8
.........................................................................................................................................
2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang..............................................................8
2.1.2 Bromelain làm liền sẹo...............................................................................9
2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp........................................................9
2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch...............................................................9
2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn.....................................................................9
2.1.6 Bromelain và HIV.......................................................................................9
2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm..........................................................10
2.2.1 Bromelain làm mềm thịt ..........................................................................10
2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa........................................10
2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản...........................................................10

2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may..............................................................10
2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da.............................................................10
2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease.....................................10
2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng...............................................................11
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME
BROMELAIN..............................................................................................................13
3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain................................................13
3.1.1 Phương pháp siêu lọc................................................................................13
a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc..............................................13
b. Các kiểu siêu lọc.........................................................................................14
c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc.................................................15
3.1.2 Phương pháp kết tủa.................................................................................15
3.1.3 Phương pháp hấp phụ...............................................................................18
3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain ..............................................18
i
Mục lục
3.2.1 Phương pháp thẫm tích.............................................................................18
3.2.2 Phương pháp lọc Sephatex G-50...............................................................18
3.2.3 Phương pháp sắc kí...................................................................................19
Kết luận........................................................................................................................20
Tài liệu tham khảo.......................................................................................................21

ii
Danh mục bảng
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelain thân....................................................5
Bảng 1.2 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain......................................................6
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide của Bromelain ..............6

iii

Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain ..................................................4
Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800mcu/g)....................12
Hình 2.2 Dược phẩm chức hàm lượng Bromelin cao..................................................12
Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin....................12
Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc giúp bệnh Gút.............................................12
Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo........................................................................12
Hình 2.6 Dứa enzyme: Complex – 800 GDU .............................................................12
Hình 3.1 Lọc cross - flow............................................................................................13
Hình 3.2 Kiểu một bước..............................................................................................14
Hình 3.3 Kiểu lô...........................................................................................................14
Hình 3.4 Kiểu thể tích không đổi.................................................................................15
Hình 3.5 Quy trình thu nhận enzyme Bromelain.........................................................17
Hình 3.6 Cấu tạo của kaolin .......................................................................................18
iv
Lời mở đầu
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sản
phẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme. Việc
sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc biệt
có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành
sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an toàn
sinh học, không gây bệnh đối với người. Một trong những enzyme quan trọng trong
cuộc sống đó là enzyme Bromelain nó được ứng dụng trong công nghiệp, thực phẩm
và quan trọng nhất là trong y dược.
Với những đặc điểm và tầm quan trọng của enzyme Bromelain Đề tài “Tìm hiểu
về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” được thực hiện nhằm ly trích và
giúp hiểu được tầm quan trọng của enzyme Bromelain trong cuộc sống.

1
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu
Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam
Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng
này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại.
Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu
hết ở các nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như
là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta,
dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước
khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía
Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…
miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng
Nam…
Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó
có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish.
- Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng
80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm
Đồng. Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém vàng,
nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen.
- Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa
trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở
phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt
lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất
lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi.
- Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở
Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả

vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm
này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không
được phát triển.
2
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
1.2 Enzyme
- Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao
đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một
chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất
protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các
phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều
hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.
- Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác
nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh
học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
- Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình
sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các
lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong
công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất
dược phẩm.
1.2.1 Phân loại
- Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên
gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:
Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử.
Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) nào
đó từ chất này sang chất khác.
Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có
sự tham gia của nước).
Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi
hợp chất mà không có sự tham gia của nước.

Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng phân
này sang dạng đồng phân khác.
Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP
và các chất tương tự.
1.3 Enzyme Bromelain
- Bromelain là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả
chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ
giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968
-1970.
3
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
- Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ
họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì
bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
- Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain
là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để
chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide
[5]
.
- Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải
protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của
bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro
[1]
.
1.3.1 Cấu tạo hoá học
- Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose,
2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose
[1]
.

- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu –
NH
2
là alanine
[1]
.
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH OH
2
CH OH
2
CH OH
2
OH
OH
NHCONH
3

NHCONH
3
NHCOCH
2
C
N
CH
CH
2
Fructose
Maltose
Maltose
Maltose
Xylo se
Glucofamine
Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain
1.3.2 Cấu trúc không gian
- Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
- Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp -
- Gly – Cys – Lys -
4
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
- Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có
cách sắp xếp phức tạp.
- Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử còn có các ion Zn
2+

có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian
của enzyme.
1.3.3 Tính chất vật lí
- Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme
bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân
Tính chất Ký hiệu Số liệu
Hằng số sa lắng S (s) 2.73
Hằng số khuếch tán D (cm
2
/ s) 7.77 x 10
-7
Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743
Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039
Tỷ số ma sát f / f
o
1.26
Điểm đẳng điện pI 9.55
Sự hấp thu A
1%
cm
ở 280nm 20.1
Trọng lượng phân tử
32.000
*
32.100
**
35.500
***
*

: Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán
**
: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***
: Tính bằng phương pháp Archibald
1.3.4 Hoạt tính của bromelain
a. Hoạt tính phân giải
- Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở
bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung
[1]
.
- Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain.
Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain
Cơ chất
Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín
5
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
Casein 7.4 4.0 3.0

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong
quả xanh và quả chín.
- Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain.
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain
Cơ chất
Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelian quả chín
BAA 3.7 9.1 7.2
- Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn
bromelain thân và quả chín.

b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
- Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,
một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh
khiết...
- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác
của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố
khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất
hoạt hóa…
 Ảnh hưởng của pH : pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác
của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ,
thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi
thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH
4
)
2
SO
4
thì enzyme có hoạt
tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một
phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt
độ 63
º
C. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào
cơ chất.
 Ảnh hưởng bởi cơ chất : trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính
khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh
hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như
papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE
(Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn

papain.
6