Báo cáo nông nghiệp: " ứng dụng một số kỹ thuật trong chẩn đoán và phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn nái" doc

Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 1: 62 - 67 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI
62
ứng dụng một số kỹ thuật trong chẩn đoán v phân lập virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp trên lợn nái
Application of Some Techniques to Diagnose and Isolate Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus from Sows
Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An
Trng i hc Nụng nghip H Ni
a ch email tỏc gi liờn lc:
TểM TT
RK thut bnh lý v húa min dch t chc ó c s dng phỏt hin virus cú trong 5 ln nỏi
b nghi mc hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-
PRRS). Sau ú, cỏc mu bnh phm gm: phi, hch phi, t cung t cỏc ln nỏi ú ó c s
dng phõn lp virus trờn dũng t bo Marc 145. Cỏc chng virus PRRS gõy bnh cho ln nỏi Vit
Nam phỏt trin tt trờn mụi tr
ng t bo Marc 145 v gõy nờn bnh tớch t bo, bnh tớch t bo xut
hin sau 48 gi gõy nhim.
RT khúa: Hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (PRRS), ln nỏi, phõn lp, virus.
SUMMARY
RPathological and immunohistochemical techniques were applied to detect target virus from 5 sows
infected with PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). After that, samples of lung,
pulmonary lymphnode and uterus of the above sows were used for isolation of PRRS virus in Marc 145
cell line. It was found that the virus causing PRRS in sows in Viet Nam could be isolated and grew well in
Marc 145 cell line with cito pathogenic effect (CPE) observed 48h after inoculation in all samples.
RKey words: Isolation, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS), sows, virus.
R1. ĐặT VấN Đề
RHiện nay, ngnh chăn nuôi nớc ta đang
ngy cng đợc chú trọng phát triển v giữ
một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc
dân, trong đó, chăn nuôi lợn đã trở thnh
nguồn thu nhập chủ yếu đối với nhiều hộ

nông dân. Cùng với sự phát triển của ngnh
chăn nuôi, vấn đề dịch bệnh luôn song hnh
v gây nhiều tổn thất cho ngời chăn nuôi,
đặc biệt, chăn nuôi lợn nái đóng vai trò quan
trọng trong việc cung cấp nguồn con giống
nhng thờng xuyên bị đe dọa bởi dịch bệnh.
Hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp
(PRRS) l bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của
loi lợn. Theo Nguyễn Hữu Nam v Nguyễn
Thị Lan (2007), PRRS l bệnh phức tạp với
các đặc trng l lợn nái sinh sản bị sảy thai,
chết thai, thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu.
Chủng virus PRRS châu Âu đã đợc phân
lập đầu tiên ở H Lan (Wenswooet v cs.,
1991) v chủng PRRS Bắc Mỹ đợc tìm thấy
ở Mỹ (Benfield v cs., 1992). ở Việt Nam,
những nghiên cứu về virus PRRS (PRRSV)
nói chung còn rất ít. Theo Nguyễn Bá Hiên
v Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), đích tấn công
của virus l các đại thực bo, đây l tế bo
duy nhất có điểm cảm thụ (yếu tố cảm thụ)
phù hợp với cấu trúc hạt virus. Vì vậy virus
hấp thụ v thực hiện quá trình nhân lên chỉ
trong tế bo ny v phá huỷ nó. Tế bo Marc
l đại thực b
o phế nang của lợn thích hợp
cho sự nhân lên của virus (Murakami v cs.,
1994; Shimizu v cs., 1994).
ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp
63

Vì vậy, môi trờng tế bo Marc 145 đã
đợc sử dụng để tiến hnh phân lập virus
PRRS trên từ các lợn nái mắc bệnh đợc
chẩn đoán bằng các kỹ thuật bệnh lý v hoá
miễn dịch nhằm cung cấp thông tin cho các
nghiên cứu sâu hơn về PRRSV góp phần vo
việc sản xuất kít chẩn đoán v chế vacxin
phòng bệnh.
2. NGUYÊN LIệU - PHƯƠNG PHáP
NGHIÊN CứU
2.1. Nguyên liệu
- Các lợn nái nghi mắc PRRS (đợc mổ
khám v lấy mẫu ở các phủ tạng nh phổi,
hạch phổi, tim, gan, lách ).
- Tế bo Marc 145 đợc nuôi cấy trên các
đĩa lồng.
- Hoá chất, dụng cụ sử dụng trong kỹ
thuật lm tiêu bản bệnh lý, kỹ thuật hoá mô
miễn dịch v kỹ thuật nuôi cấy tế bo.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
- Sử dụng các phơng pháp thí nghiệm
thờng quy trong phòng thí nghiệm bệnh lý
nh phơng pháp mổ khám, phơng pháp
lm tiêu bản bệnh lý v các kỹ thuật mới
nh phơng pháp hóa mô miễn dịch, phơng
pháp phân lập virus.
+ Phơng pháp hóa mô miễn dịch
(Immunohistochemistry - IHC): cho phép
chẩn đoán chính xác lợn mắc PRRS. Mẫu
bệnh phẩm sau khi đợc cắt thnh tiêu bản

bệnh lý sẽ đợc lm sạch parafin. Tiến hnh
hoạt hoá enzym bằng cách ngâm ngập tiêu
bản trong dung dịch PBS (Phosphat buffer
saline) 1X v hấp ớt ở 121
P
0
P
C trong 5 phút.
Khử peroxydase nội sinh dùng H
B
2
BOB
2
B trong
dung môi Methanol (tỉ lệ 1:9). Gắn kháng
thể (KT), nhỏ KT kháng PRRSV chuẩn lên
tiêu bản, ủ tiêu bản ở tủ ấm 37
P
0
P
C trong 1 giờ
hoặc 4
P
0
P
C qua đêm. Rửa tiêu bản bằng dung
dịch PBS (lặp lại 3 lần). Gắn kháng kháng
thể (KKT) có gắn enzyme (Dako-Japan) lên
tiêu bản, ủ ở 37
P

0
P
C trong 1 giờ v rửa lại tiêu
bản. Gắn cơ chất, ngâm tiêu bản trong dung
dịch DAB (3,3'-diaminobenzidine) khoảng 3-
8 phút. Tiến hnh nhuộm nhân tế bo bằng
Hematoxylin, lm sạch v gắn baume
Canada, quan sát kết quả trên kính hiển vi
quang học.
+ Phơng pháp phân lập virus gồm 3 bớc:
Bớc 1 chuẩn bị tế bo phân lập: Tế bo
Marc 145 đợc đa vo nuôi cấy trong môi
trờng v điều kiện thích hợp, môi trờng
DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum)
lm ấm trong tủ 37
P
o
P
C trong 30 phút trớc
khi lấy tế bo mọc vừa kín đáy đĩa lồng thì
tiến hnh gây nhiễm virus.
Bớc 2 chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu
bệnh phẩm đợc nghiền nát bằng chy v cối
vô trùng sau đó đợc đồng nhất trong dung
dịch DMEM. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn
dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc đợc lấy để
gây nhiễm vo tế bo Marc 145.
Bớc 3 gây nhiễm virus v quan sát kết
quả: Từ các đĩa lồng tế bo đã chuẩn bị ở

bớc 1 hút bỏ môi trờng nuôi cấy v bổ
sung 100 l mẫu đã chuẩn bị ở bớc 2. Tế
bo gây nhiễm virus đợc ủ ở 37
P
0
P
C với 5%
CO
B
2
Btrong 30 phút. Bổ sung 1,5 ml môi
trờng DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose
Phosphate Broth) vo đĩa lồng v để ở 37
P
0
P
C
với 5% CO
B
2
B.B

BHng ngy theo dõi sự phá huỷ
tế bo bằng kính hiển vi soi nổi v thu lại
virus khi tế bo bị phá hủy đạt 80% - 90%
diện tích đáy của đĩa lồng .
3. KếT QUả
3.1. Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của
lợn nái mắc PRRS
Trên cơ sở thu thập các mẫu bệnh phẩm

từ những lợn nái ở các địa phơng khác nhau
có các dấu hiệu đặc trng của PRRS nh: phát
ban, khó thở, có nhử mắt, tím tai, sảy thai,
viêm vú mất sữa, nghiên cứu ny đã chọn 5
lợn nái có bệnh tích điển hình để nghiên cứu
tiếp. Các biến đổi bệnh lý của lợn nái mắc
PRRS tập trung chủ yếu ở phổi, hạch lâm ba
(HLB) v tử cung (Bảng 1 v 2; các hình 1, 2,
3, 4). Bên cạnh đó, các bệnh tích ở lách, thận
v một số cơ quan khác l không đặc trng v
phụ thuộc vo tình trạng, diễn biến của bệnh
cũng nh sự kế phát của các bệnh khác.
Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An
64
RBảng 1. Bệnh tích đại thể chủ yếu của 05 lợn nái mắc PRRS
C quan
STT Tờn
Phi viờm HLB sng
Thn xut
huyt
Lỏch nhi
huyt
C tim
nhóo
T cung
viờm
1 Nỏi mang thai 1-N1 +++ ++ - - - +++
2 Nỏi mang thai 2-N2 ++++ +++ +++ - ++ ++++
3 Nỏi nuụi con 1-N3 ++++ +++ +++ ++ +++ ++
4 Nỏi nuụi con 2-N4 +++ ++ ++ ++ - ++

5 Nỏi nuụi con 3-N5 +++ ++ - - - ++
Ghi chỳ: ++++ Rt nng +++ Nng ++Trung bỡnh +Nh - Khụng biu hin
RBảng 2. Bệnh tích vi thể chủ yếu của 05 lợn nái mắc PRRS
C quan
TT Tờn
Phi HLB Lỏch Thn T cung
1 N1
- Xut huyt
- Vỏch ph nang t nỏt
- Xut huyt - Xut huyt
- K thn xut
huyt
- Thõm nhim
t bo viờm
2 N2
- Xut huyt
- T bo viờm ph nang
- S lng lõm
ba cu gim
- Xut huyt
- Vỏch t nỏt
- Cu thn viờm
- Tng sinh t
bo x
3 N3
- Ph nang cú dch viờm
v i thc bo
- Nang lõm ba
teo
- Tu trng teo li,

vỏch t nỏt
- Cu thn viờm,
lũng ng rng cú
tr trong
- Niờm mc t
cung t nỏt
4 N4 - Ph qun ph viờm - Xut huyt
- Thoỏi hoỏ v
ho
i t
- Xoang bao man
gión rng
- Thõm nhim t
bo viờm
5 N5
- K phi tng sinh t bo
x
- Xut huyt - Xut huyt
- T bo thn b
thoỏi hoỏ, hoi t
- Khụng cú bin
i vi th


Hình 1. Phổi viêm Hình 2. Thận xuất huyết

Hình 3. Hạch lâm ba xuất huyết (HE x40) Hình 4. Dịch phù trong lòng phế nang (HE x40)


ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp
65
3.2. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch
Từ các lợn nái nghi mắc PRRS đợc lựa
chọn, nghiên cứu ny tiến hnh nhuộm hoá
miễn dịch tổ chức với các mẫu phổi, hạch
phổi v tử cung của 5 lợn trên để chẩn đoán
xác định sự có mặt của virus PRRS lm cơ sở
cho việc phân lập virus (Bảng 3).
Trên các block phổi, hạch phổi v tử cung
của các lợn nái nghiên cứu đợc lựa chọn lm
hóa miễn dịch đều cho kết quả dơng tính với
PRRSV biểu hiện l những đám tổ chức bắt
mu vng nâu trên tiêu bản vi thể của tổ
chức phổi, hạch phổi, tử cung của lợn bệnh.
Sở dĩ phổi, hạch phổi v tử cung đợc lựa
chọn thực hiện kỹ thuật hoá mô miễn dịch vì
những biến đổi bệnh lý của lợn nái mắc PRRS
đợc quan sát thấy tập trung chủ yếu ở phổi,
hạch phổi v tử cung. Virus PRRS có đặc
điểm l rất thích hợp với đại thực bo, đặc
biệt l đại thực bo vùng phổi. Đây l tế bo
duy nhất có điểm cảm thụ phù hợp với cấu

trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ v thực
hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bo ny
v phá huỷ nó (Hình 5 v 6).
3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi
trờng tế bo Marc145
5 lợn có các biểu hiện lâm sng đặc trng
của PRRS sau khi đợc tiến hnh mổ khám,
lấy mẫu, bảo quản, lm tiêu bản vi thể v lm
hoá miễn dịch xác định sự có mặt của virus,
nghiên cứu đã tiến hnh phân lập virus trên
môi trờng tế bo Marc 145 (Bảng 4).
Bệnh tích tế bo của virus PRRS đợc
biểu hiện l các tế bo co cụm lại với nhau,
chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy v khi tế bo
bị virus phá hủy hon ton thì bong khỏi đáy
bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh
tích ny bằng mắt thờng. Tuy nhiên, thể
CPE ny cũng rất dễ nhầm lẫn với những tế



bo bị chết theo cơ chế Apoptosis nếu không
quan sát kỹ. Để quan sát chính xác hơn cũng
có thể dùng kính hiển vi điện tử quét để
quan sát sự thay đổi hình thái tế bo.
Trong tổng số 13 mẫu tiến hnh phân
lập virus của 5 lợn nái mắc PRRS, 10 mẫu có
bệnh tích tế bo ở mức độ khác nhau, 3 mẫu
không có bệnh tích tế bo. Nh vậy, sự có
mặt của virus ở các cơ quan, bộ phận của lợn

bệnh l không giống nhau. Điều ny cũng
giải thích nguyên nhân tại sao khi tiến hnh
nhuộm hóa miễn dịch các mẫu block cho kết
quả dơng tính m khi phân lập virus lại âm
tính. Nh vậy, sự tập trung virus ở các cơ
quan v ở mỗi thời điểm bệnh l khác nhau.
Trong các mẫu bệnh phẩm phân lập thì
bệnh tích tế bo xuất hiện sớm nhất sau 48h
phân lập v sau 84h tế bo bị phá hủy hon
ton. Mẫu phổi cho khả năng phân lập virus
rất cao. Điều ny giải thích cho những biến
đổi đại thể chủ yếu ở lợn mắc PRRS l hiện
tợng viêm phổi do virus tập trung ở phổi với
số lợng lớn v phá hủy nghiêm trọng chức
năng của phổi vì đích tấn công của virus l
các đại thực bo phế nang, tại đây chúng
nhân lên v phá hủy các tế bo ny gây nên
bệnh tích đặc trng ở phổi v một lợng lớn tế
bo đại thực bo trong nang phổi bị virus xâm
nhiễm nên dễ dng quan sát CPE khi phân
lập virus từ phổi. Kết quả của nghiên cứu n
y
cũng phù hợp với nghiên cứu của Murakami
v cs. (1994), Shimizu v cs. (1994). Sau khi
tiến hnh phân lập đợc virus PRRS, nghiên
cứu thực hiện phản ứng hóa miễn dịch tế bo
với kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS để
khẳng định bệnh tích tế bo thu đợc l do
virus PRRS gây nên v kết quả của các mẫu
virus thu đợc đều cho kết quả hoá miễn dịch

tế bo dơng tính với virus PRRS (Hình 7 v 8).
RBảng 3. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch
Phi Hch phi T cung
STT Kớ hiu
Block 1 Block 2 Block 1 Block 2 Block 1 Block 2
1 N1 + + + + + +
2 N2 + + - + + +
3 N3 + + + + - -
4 N4 - + + + - -
5 N5 - + - + - -
+ Cú virus - Khụng cú virus
Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Tiêu Quang An
66

H×nh 5. Virus tËp trung ë phæi H×nh 6. Virus tËp trung ë h¹ch phæi
RB¶ng 4. KÕt qu¶ ph©n lËp virus PRRS trªn m«i tr−êng tÕ bμo Marc 145
CPE (Cytopathology effect)
STT Kí hiệu Bệnh phẩm
36h* 48h 60h 72h 84h
Phổi - 10%** 70% 100%
Hạch phổi - 5% 60% 80% 100%
1 N1
Tử cung - - - - -
Phổi - 10% 75% 100%
Hạch phổi - - - - -
2 N2
Tử cung - 5% 60% 80% 100%
Phổi - 15% 90% 100%
3 N3
Hạch phổi - - - - -

Phổi - 15% 85% 100%
Hạch phổi - 10% 75% 100% 4 N4
Tử cung - 5% 40% 85% 100%
Phổi - 5% 50% 80% 100%
5 N5
Hạch phổi - 15% 85% 100%
Chú thích : - Không có bệnh tích
* : số giờ sau gây nhiễm ** : bệnh tích tế bào so với tổng số diện tích đáy bình

H×nh 7 . TÕ bμo Marc 145 b×nh th−êng H×nh 8. CPE tõ mÉu lîn m¾c PRRS
ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp
67
4. KếT LUậN
Kỹ thuật bệnh lý v hoá mô miễn dịch
cho phép chẩn đoán chính xác 05 lợn nái mắc
hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp. Đã
phân lập đợc virus PRRS từ các mẫu bệnh
phẩm của lợn nái thu thập đợc. Tế bo
Marc 145 l tế bo thích hợp để phân lập
virus PRRS, virus nhân lên nhanh trong tế
bo v gây bệnh tích điển hình. Bệnh tích tế
bo đợc biểu hiện l các tế bo co cụm lại
với nhau chồi lên khỏi đáy bình. Tế bo Marc
145 bị PRRSV phá huỷ trung bình sau 48h
gây nhiễm, đạt mức độ cao nhất sau 72h v
bị phá huỷ muộn nhất l 84h.
TI LIệU THAM KHảO
Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007).
Một số hiểu biết về virus gây hội chứng
rối loạn hô hấp v sinh sản của lợn, Hội

thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản
v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng Đại
học Nông nghiệp H Nội.
Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007).
Hội chứng rối loạn hô hấp v sinh sản,
Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh
sản v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng
Đại học Nông nghiệp H Nội.
Benfield D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L.,
Goyal S.M., Bobinson D., Christianson T.T.,
Morrison R.B., Gorcyca D., Chladek D.,
(1992). Characterization of swine infertility


and respiratory syndrome (SIRS) virus
(isolate ATCC VR2332). Journal of
Veterinary Diagnostic Investigation 4, pp.
127133.
Lunney J.K., Benfield D.A., Rowland R.R.,
(
T2010)T. HTPorcine reproductive and
respiratory syndrome virus: An update on
an emerging and re-emerging viral
disease of swine.
TH TJournal of Virus
Research 7, pp. 286
TT. Oct 14.T
Murakami Y, Kato A. (1994). Isolation and
serological characterization of Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome

(PRRS) virus from pigs with reproductive
and respiratory disoders in Japan, J Vet
Med Sci 56, pp. 891- 894.
Shimuzi M, Yamada S. (1994). Isolation of
Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome (PRRS) virus from Heko
Hekeo disease of pigs. J Vet Med Sci 56,
pp. 389 - 391.
Wensvoort G., Terpstra C., Pol JMA, (1991).
Mystery swine disease in the
Netherlands: the isolation of Lelystad
virus, The Veterinary Quarterly, vol. 13,
No. 3, pp. 121-130, Jul.
Yi J, Liu, C.,
HTMolecular characterization of
porcine circovirus 2 isolated from diseased
pigs co-infected with porcine reproductive
and respiratory syndrome virus.
TH TVirol JTT.
2010, 14 :286.
T