t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
5
ứNG DụNG DUNG MôI CO
2
SIêU TớI HạN
đIềU CHế
LIPOSOM CHứA ARBUTIN Sử DụNG TRONG
Mỹ PHẩM NANO
Hoàng Văn Lương*
Vũ Bình Dương
*
Nguyễn Văn Long
*
Đào Văn Đôn
*
TãM T¾T
Liposom chứa arbutin được điều chế theo phương
pháp bốc hơi đảo pha và sử dụng dung môi CO
2
siêu
tới hạn. Kết quả đã tìm được điều kiện phù hợp cho
quá trình tạo liposom là: nhiệt độ 60
0
C, áp suất 200
bar. Liposom thu được theo phương pháp này có
kích thước, hiệu suất liposom hóa và hàm lượng
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
6
arbutin cao hơn so với phương pháp truyền thống
của Bangham.
* Từ khóa: Liposom; Arbutin, Siêu tới hạn; Mỹ
phẩm nano.
STUDy OF APPLYING SUPERCRITICAL
CARBON DIOXIED PREPARES ARBUTIN
LIPOSOME USED IN NANOCOSMETICS
Hoang Van Luong
Vu Binh Duong
Nguyen Van Long
Dao Van Don
SuMMARY
Preparation of liposome containing arbutin was
made successfully by the supercritical reverse phase
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
7
evaporation method without organic solvent. The
most suitable critical conditions for making
liposome were found that: the pressure was 200bar;
temprature was 60
0
C. The particles of liposome and
liposomzation capicity followed this method was
better than Bangham’s method.
* Key words: Liposome; Arbutin; Supercritical;
Nanocosmetics.
§Æt vÊn ®Ò
Arbutin là chất chiết
xuất từ một số loài thực
vật, đặc biệt có hàm
lượng cao trong cây
Bearberry
(Arctostaphylos uva-
ursi). Các nghiên cứu về
tác dụng dược lý cho
thấy: arbutin làm mất sắc
tố trên da do tác dụng ức
chế enzym tyrosinase tạo
thành hắc tố da. Vì vậy
nó được sử dụng phổ
biển làm chất trắng da
trong mỹ phẩm. Muốn
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
8
tạo được tác dụng,
arbutin phải thấm
qua được lớp biểu bì và
phân bố giữa lớp tế bào
biểu bì tạo hắc tố (nằm
giữa lớp biểu bì và hạ bì)
với nồng độ đủ lớn gây
ra tác dụng ức chế
tyrosinase. Tuy nhiên, do
bản chất của arbutin
(hình 1) là chất dễ tan
trong nước, nên khả năng
thấm qua lớp biểu bì rất
hạn chế. Để khắc phục
hiện tượng này, các nhà
khoa học đã nghiên cứu
bào chế liposom chứa
arbutin giúp thay đổi tính
thÊm, cải thiện khả năng
xuyên thấm, nhằm làm
tăng hiệu quả gây trắng
da.
* Häc viÖn Qu©n y
Ph¶n biÖn khoa häc: PGS. TS. NguyÔn V¨n Minh
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
9
Hình 1: Cấu trúc hóa
học của arbutin.
Trên thế giới đã có
nhiều phương pháp bào
chế liposom như phương
pháp của Bamhang dùng
dung môi hữu cơ để hòa
tan phospholid, sau đó
phân tán dưîc chất và bốc
hơi dung môi. Tuy nhiên,
phương pháp này hiệu
suất tạo được liposom
thấp. Ngoài ra còn tồn dư
các dung môi hữu cơ độc
hại trong sản phẩm.
Phương pháp sử dụng
chất lỏng CO
2
siêu tới
hạn làm dung môi trong
chế tạo liposom có nhiều
ưu điểm như: hiệu suất
cao, kích thước tiểu phân
nhỏ, không độc hại, rẻ
tiền [2]. Vì vậy trong
nghiên cứu này, chúng
tôi ứng dụng dung môi
CO
2
siêu tới hạn để bào
chế liposom chứa arbutin
tạp chí y - d-ợc học quân sự số 4-2009
10
theo phng phỏp bc
hi o pha (the
supercritical reverse
phase evaporation
method - SCRPE) vi
mc tiờu:
- Ch to c liposom
cha arbutin cú kớch
thc tiểu phõn nano.
- Kho sỏt nh hng
ca ỏp sut siờu ti hn
n hiu qu liposom
húa arbutin.
Nguyên vật liệu và
ph-ơng pháp nghiên cứu
1. Nguyờn vt liu.
- Lecitin ca Sigma t
tiờu chun USP 30,
arbutin (Merck - c);
cloroform, ethanol (Wako
- Nht Bn) v cỏc húa
cht khỏc.
- Thit b chit sut
siờu ti hn Thai.cor
2000 (M), cú b phn
c bit bc hi dung
mụi CO2; mỏy o kớch
thc tiu phõn nano
NICOMP 370 (Santar
Barbara - M); h thng
sc kớ lng cao ỏp Water
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
11
(Mỹ); hệ thống sắc kí cột
gel Sephadex G25.
2. Phương pháp
nghiên cứu.
2.1. Phương pháp bào
chế liposom:
- Chế tạo liposom theo
phương pháp SCRPE:
cân 10 gam lecitin phân
tán trong 1 ml cồn, cho
vào bình. Cân và hòa tan
500 mg arbutin trong 200
ml nước cất, cho vào
bình có khuấy từ đã có
sẵn hỗn dịch lecitin. Cấp
dòng CO
2
siêu tới hạn
vào trong bình, duy trì
nhiệt độ 60
0
C, áp suất
bình khảo sát là 150,
200, 250; 300; 350, 400
bar trong thời gian 30
phút. Bốc hơi dung môi
CO
2
bằng cách mở van
xả với tốc độ 1 ml/phút
cho tới khi áp suất trong
bình về 0 bar. Hỗn dịch
liposom được lọc lần
lượt qua các màng lọc có
kích thước 3; 1,2; 0,6;
0,4 và 0,22 µm. Dịch lọc
liposom bảo quản ở 4
0
C.
- Chế tạo liposome theo
phương pháp của
Bangham. Cân và hòa
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
12
tan hoàn toàn lecitin
trong cloroform trong
bình kín, bốc hơi dung
môi dưới điều kiện áp
suất giảm cho tới khi thu
được màng lecitin mỏng.
Cân và hòa tan arbutin
trong nước, sau đó phân
tán vào màng mỏng
lecitin, hỗn dịch làm
nóng tới 60
0
C trong 10
phút. Sau đó lắc mạnh
hỗn hợp trên máy lắc
trong 5 phút tới khi thu
được hỗn dịch chứa
liposom, lọc qua màng
lọc có kích thước khác
nhau từ 3 - 0,2 µm.
2.2. Phương pháp
phân tích kích thước tiểu
phân:
Pha loãng mẫu liposom
400 lần với nước cất. Sau
đó chuyển vào tế bào đo
của hệ thống máy xác
định kích thước tiểu phân
nano NICOMP 370. Kết
quả xác định kích thưíc
tiểu phân được xử l í trên
máy tính. Mỗi mẫu làm
lặp lại 6 lần.
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
13
2.3. Phương pháp xác
định hiệu suất liposom
hóa:
Bơm 100 µl mẫu
liposom vào cột gel
sephadex để tách lấy các
arbutin tự do và liposom
đã chứa arbutin. Cứ sau 5
phút lựa chọn 1 phân
đoạn. Đo kh¶ năng hấp
thụ tử ngoại của các phân
đoạn ở bước sóng 280
nm cho tới khi không
còn các pic trên sắc kí
đồ, chứng tỏ arbutin và
liposom đã ra hết khỏi
cột. Gộp chung các phân
đoạn cùng chứa liposom
hoặc arbutin với nhau.
Hòa tan trong dung dịch
trion X100 0,5%. Định
lượng arbutin bằng sắc k í
lỏng hiệu năng cao với
pha động sử dụng là
methanol: nước = 15 :
85, thể tích bơm mẫu
20µl, tốc độ dòng
1ml/phút, detector UV ở
bước sóng 280 nm. Phần
trăm arbutin được
liposom hóa tính theo
công thức sau:
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
14
C
lipo
x V
lipo
E (%) =
x 100
(C
lipo
x V
lipo
) + (C
tdo
x
V
tdo
)
Trong đó: C
lipo
; C
tdo
là
nồng độ arbutin trong
liposom và ở dạng tự do.
KÕt qu¶ nghiªn cøu
1. Kết quả nghiên cứu
tạo liposom.
Theo phương pháp
SCRPE, quá trình tạo
liposom trải qua 4 bước
sau: trước hết tạo dung
dịch đồng nhất của
lecitin và cồn trong CO
2
siêu tới hạn (a), sau đó
phân tán dung dịch
arbutin vào trong dung
dịch lecitin tạo thành nhũ
tương ở trạng thái siêu
tới hạn CO
2
/N (b), ở điều
kiện có khuấy trộn các
lecitin sẽ sắp xếp đầu
không phân cực hướng ra
hai bên và đầu phân cực
hướng vào trong, trong
qu¸ trình đó bao lấy các
tiểu phân arbutin vào
phần phân cực của lớp
phospholipid (c), khi
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
15
giảm áp suất và nhiệt độ
CO
2
chuyển từ trạng thái
siêu tới hạn sang trạng
thái khí, lúc đó các
liposom được hình thành
liên tục tạo thành hỗn
dịch trong nước (hình 2).
Hình 2: Quá trình tạo liposom theo phương pháp
SCRPE.
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
16
2. Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng của áp
suất đến khả năng tạo liposome.
Bảng 1: Kích thước và hiệu suất tạo liposom ở các
điều kiện áp suất khác nhau.
Áp
su
Êt
(ba
r)
kÝch
th-íc
tiÓu
ph©n
(KTT
P)
lipos
om
(nm)
hiÖu
suÊt
lipos
om
hãa
(%)
hµm
l-îng
arbuti
n
trong
liposo
m
(µg/m
g)
1
5
0
187,5
±
24,1
12,3
± 3,6
12,3
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
17
2
0
0
121,2
±
21,7
21,6
± 2,4
28,2
2
5
0
117,6
±
34,8
15,6
± 1,5
25,5
3
0
0
115,8
±
25,4
16,7
± 2,7
27.4
3
5
0
134,1
±
27,3
15,2
± 3,1
11,9
4
5
0
127,2
±
34,5
16,5
± 1,4
14,5
p
p
2,1
; P
2-1;
P
2-1;
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
18
p
2-5
<0,05
p
2-3
;
p
2-4
>
0,05
p
2-3
<
0,05
P
3-4;
p
3-5
>
0,05
p
2-3
<
0,05
P
3-4;
p
3-5
>
0,05
* Ở các điều kiện áp suất khác nhau, kích thước
liposom và hiệu suất liposom hóa cũng khác nhau.
Khi áp suất càng tăng, kích thước tiểu phân càng
giảm. Tuy nhiên, nếu áp suất tăng trên 350 bar thì
kích thước tiểu phân giảm nhưng không đáng kế (p >
0,05). Ở khoảng áp suất 200 - 250 bar, kích thước tiểu
phân đạt nhỏ nhất là 117 - 121 nm.
Hiệu suất liposom hóa ở các mức áp suất khác nhau
cũng cho kết quả không giống nhau. Khi áp suất tăng
cao, hiệu suất liposom hóa có xu thế giảm. Tuy
nhiên, nếu tiếp tục tăng áp suất trên 250 bar thi tỷ lệ
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
19
liposom hóa sẽ ổn định khoảng 15%. Hiệu suất
liposom hóa cao nhất ở áp suất 200 bar đạt 21,6%.
3. Kết quả so sánh tạo thành liposom giữa 2
phương pháp.
Điều chế liposom theo phương pháp SCRPE ở
60
0
C; 200 bar và phương pháp của Bamhang.
Bảng 2: Kết quả so sánh KTTP liposom theo hai
phương pháp.
MÌ
Ph-¬ng
ph¸p
SCRPE
(nm)
Ph-¬ng
ph¸p
Bamhang
(nm)
1 125,2 ±
21,7
189,8 ±
25,4
2 131,6 ± 197,1 ±
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
20
16,7 27,3
3 121,2 ±
21,7
207,2 ±
24,5
4 117,6 ±
14,8
195,8 ±
29,4
5 126,3 ±
17,1
214,1 ±
27,3
6 114,8 ±
34,5
221,2 ±
14,5
X +
SD
121,8 ±
6,25
207,4 ±
11.89
P
1-2
< 0,05
* Kích thước tiểu phân liposom điều chế theo
phương pháp SCRPE nhỏ hơn so với phương pháp
Bangham. Sự khác biệt này có nghĩa thống kê (p <
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
21
0,05). Khi kích thước tiểu phân nhỏ, liposom sẽ bền
vững hơn các liposom có kích thước lớn.
Bảng 3: Kết quả so sánh hiệu suất liposom hóa theo
hai phương pháp.
Ph-¬ng
ph¸p
SCRPE
Ph-¬ng
ph¸p
Bamhan
g
M
Î
Hiệ
u
suất
(%)
Hà
m
lượ
ng
arb
utin
tron
g
Hi
ệu
suấ
t
(%
)
Hà
m
lượ
ng
arb
utin
tron
g
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
22
lipo
som
(µg/
mg)
lipo
so
m
(µg
/mg
)
(1)
(2) (3)
(4)
1 22,
3
28,
5
6,7
17,
2
2 21,
6
31,
2
5,2
15,
9
3 25,
6
29,
3
4,5
18,
5
4 22,
3
26,
4
6,7
19,
2
5 21, 27, 5,2
16,
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
23
6 8 7
6 25,
6
28,
3
4,5
15,
2
X
+
SD
22,7
±
1,8
28,7
±
1,6
5,4
±
1,0
17,1
±
1,5
P
1-3
<
0,05
P
2-4
<
0,05
* Hiệu suất arbutin được liposom hóa trong phương
pháp SCRPE đạt 22,7%, trong khi phương pháp của
Bangham chỉ đạt 5,4%. Hàm lượng arbutin trong
liposom điều chế theo phương pháp SCRPE đạt cao
hơn so với phương pháp Bangham (p < 0,05).
4. Độ ổn định của liposom.
tạp chí y - d-ợc học quân sự số 4-2009
24
Liposom sau khi c iu ch, bo qun nhit
phũng, theo dừi n nh trong vũng 30 ngy.
Quan sỏt s tỏch lp ca liposom.
Bảng 4: Kết quả độ ổn định của liposom điều
chế theo 2 ph-ơng pháp
độ ổn định
mẫu
Sau
khi
i
u
ch
Sau
6
gi
Sau
14
ngy
Sau
30
ngy
Phng
phỏp
Bangham
- + ++ ++
Phng
phỏp
- - - +
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
25
SCRPE
Ghi chó: (-): kh«ng t¸ch líp; (+) t¸ch líp kh«ng râ
rµng; (++) t¸ch líp râ rµng.
* Sau 6 giờ, liposom điều chế theo phương pháp
của Bangham đã tách lớp, trong khi đó liposom sản
xuất theo phương pháp SCRPE sau 30 ngày mới thấy
có hiện tượng tách lớp, nhưng mức độ chưa rõ ràng.
Nguyên nhân do liposom sản xuất theo phương pháp
của Bangham có kích thước tiểu phân lớn hơn, tỉ
trọng cao nên tốc độ lắng nhanh hơn so với liposom
điều chế theo phương pháp SCRPE.
BÀN LUẬN
Arbutin chế tạo dưới dạng liposom ®Ó cải thiện
tính thấm qua da và phát huy tốt hơn hiệu quả gây
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
26
trắng da. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng
phương pháp bốc hơi dung môi siêu tới hạn đảo pha
điều chế liposom, phương pháp nµy có ưu điểm là
không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại. Kết quả cho
thấy liposom sản xuất theo phương pháp này có kích
thước nhỏ và hiệu suất dược chất được liposom hóa
cao hơn so với phương pháp truyền thống. Vì vậy, độ
ổn định của liposom cũng kéo dài hơn. Trong phương
pháp SCRPE các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: nhiệt
độ, áp suất tới hạn và tỷ trọng của CO
2
. Kết quả khảo
sát cho thấy áp suất thích hợp nhất cho điều chế
liposom là 200 bar.
KẾT LUẬN
Đã điều chế được liposom chứa arbutin từ lecitin
bằng phương pháp SCRPE. Liposom có kích thước
khoảng 120 nm với hiệu suất liposom hoá đạt khoảng
23%. Áp suất phù hợp cho quá trình liposom hóa là
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
27
200 bar. Hàm lượng arbutin trong liposom là 28,2%.
Liposom bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 30 ngày mới
xuất hiện hiÖn tượng sa lắng.
Tµi liÖu tham kh¶o
1. Võ Xuân Minh. Các dạng bào chế hiện đại, Nhà
xuất bản Y học, 2005, tr. 172-186.
2. Katsuto Otake, Takeshi Shimomura, Toshihiro
Goto,Tomohiro Imura. Preparation of liposomes
using an improved supercritical reverse phase
evaporation method. Langmuir 2006, 22, pp. 2543-
2550.
3. Shengie Bian, Min Koo Choi, Hongxia Lin, Sunl
Jae Chung. Deformable liposomes for topical skin
delivery of arbutin. J Korea Pharm Sici, 2006, Vol
36, N
0
5, pp. 299-304.
4. Ai Heu Wen, Min Koo Choi, Dea Duk Kim.
Formulation of liposome for topical delivery of
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009
28
arbutin. Arch Pharm Res, 2006, Vol 29, N
o
12, pp.
1187-1192.