Đồ án: "“Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” pdf

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Đồ án: “Ứng dụng của enzyme
protease trong sản xuất bia”
MỤC LỤC
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 1 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Mở đầu Trang 1
Chương 1: Tổng quan về enzyme protease Trang 2
1. Tổng quan về enzyme protease Trang 2
1.1. Giới thiệu chung Trang 2
1.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Trang 3
1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease Trang 5
2. Nguồn thu nhận protease Trang 6

3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật Trang 7
3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt lực
cao Trang 7
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme protease
Trang 8
3.2.1. Nguồn cacbon Trang 8
3.2.2. Nguồn Nitơ Trang 8
3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh
trưởng Trang 9
3.3. Nuôi cấy thu nhận phế phẩm enzyme protease bằng phương
pháp bề mặtTrang 9
3.4. Thu nhận enzyme Trang 11

3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm
enzyme Trang 11
4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc
Asp.oryzae Trang 14
4.1. Quy trình thu nhận
Trang 14
4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết
bị Trang 15
4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae Trang 15
4.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy Trang 15
4.2.3. Thu nhận sản phẩm Trang 16
4.2.4. Đề xuất thiết bị Trang 18

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 2 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
5. Tình hình nghiên cứu enzyme
protease Trang 20
5.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong
nước Trang 20
5.2. Vấn đề sản xuất enzyme protease trên thế
giới Trang 22
Chương 2: Đối tượng nghiên cứu và thiết bị Trang 2

LỜI MỞ ĐẦU
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 3 Lớp: 08s2

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ
biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế
biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và
bảo vệ môi trường.
Enzyme protease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng
rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da,
trong công nghiệp sữa và phomat. Đặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease
đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu

suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt
tiêu nguyên nhân làm đục bia.
Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con
người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc
cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong
phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người.
Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme
trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng
dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng
của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng.
Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 4 Lớp: 08s2

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
1. Tổng quan về enzyme Protease [2]
1.1. Giới thiệu chung
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân
nhóm phụ:
- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của
mạch polypeptit.
- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của
mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.

- Dipeptidhydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.
- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật
(gan, dạ dày bê ) [10]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng
sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu
đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất,
vận chuyển protein qua màng [3]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như
các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự
phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN [2]. So với Protease động vật và thực vật,
Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh

vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu
trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể
đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 5 Lớp: 08s2
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai

1.2. Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5]
Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết

quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng
có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động
thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid.
Một số tác giả khác chia
Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt
động ph của chúng bao gồm:
Protease-acid, Protease trung tính,
Protease kiềm.
Trong bốn Protease kể trên,
các Protease-xerin và Protease-thiol
có khả năng phân giải liên kết este

và liên kết amide của các dẫn xuất
acid của aa. Ngược lại các Protease
kim loại, Protease acid thường
không có hoạt tính esterase của các
dẫn suất của aa. Nhiều Protease
ngoại bào của vi sinh vật đã được
nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế
tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này
tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1
Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật
Nhóm Nguồn E Chất kìm Đặc điểm pH tối

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 6 Lớp: 08s2
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin
(1 Protease xerin tiêu biểu)
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
hãm TTHĐ thích
P-Xerin Bac.subtilis
Bac.pumilus
Str.griseus
Str.fradiae
Art hrobacter B22
Asp.oryzae
Asp.flavus

Asp.sojae
E.coli
DFP
+
Xerin Kiềm
P-tiol Streplococcus
Clostridium histoly-ticum
Indoaxeta-mit
Ps.cloromer-
curbenzoat
-SH 7,5
7,0

P-kim
loại
Bac.subtilus
Bac.subtilus NRRL B3411
Bac. Subtilisamy
Losaccarilicis
Bac. Megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium

EDTA
++
1,10octa-
fenantrolin
Kim loại
hóa trị hai
Trung
tính
P-Acid Asp.niger
Asp.Awamori
Sailoi,penicillium
Janthinellum

Rhizopus chinensis
Mucor pucillus
Endothia parasilica
Dizoaxetil
Dlnorlox-
inmetil este
COOH Acid
1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5]
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 7 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho
từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về

TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung
như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số
trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21
0
A, có thể phân
biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với
mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất.
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của
các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho
thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng

20
0
A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối
diện nhau trong khe ấy.
- Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính
mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các
cầu disulphide.
Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các
enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một
cơ chế chung như sau:
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất,
P

1
: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P
2
: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
2. Nguồn thu nhận Protease [3]
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia
xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là
nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính:
Động vật, thực vật và vi sinh vật.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn
enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp

nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3].
Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác
và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng
hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng
enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu
quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 8 Lớp: 08s2
E + S enzyme – S enzyme – S + P
1
enzyme + P
2
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ
thuật sản xuất được liệt kê như sau:
 Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu
được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được
một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
 Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận
hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
 Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công

nghiệp: Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong
khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy
mô công nghiệp được.
 Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ
tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn
về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố
dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì
thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn
khác.
 Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác
nhau [5].

 Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này
có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease
ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.
 Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm
mốc, xạ khuẩn.
3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật
3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người
ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột
biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo
thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme

nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau:
- Phương pháp gây đột biến.
- Phương pháp biến nạp.
- Phương pháp tiếp hợp gene.
- Phương pháp tải.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 9 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease
Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần
môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp
enzyme của vi sinh vật.
Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh

trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào
hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm
ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác
dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme
đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi
trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ:
Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
3.2.1. Nguồn cacbon [1],[9]
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc
tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.

Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon
thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn
cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae có thể theo thứ
tự:
fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
enzyme Protease.
3.2.2. Nguồn nitơ [1].
Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger,
A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit
cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao

khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm
vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và
hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22 - 74%. Còn trường hợp dùng các
nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp
Protease nói chung.
Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp
protease VSV.
3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1]
- Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg
2+
có tác

dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.
- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 10 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
+Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 30
0
C. Trị số pH ban đầu của môi
trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự
tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ
số đó bởi vi sinh vật.
+ Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy
ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi

trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc
thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở
nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
+ Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định
lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất.
3.3. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề
mặt [3]
Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để
nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp
nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn,
các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng,

làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp
trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương đã được nấu chín trộn hạt
cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là
trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia
phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được
thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH
4
)
2
SO

4
, (NH
4
)
2
CO),
photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết
ngô, nước lọc bã rượu.
- Ưu, nhược điểm
+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm
giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển,

nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch
enzyme.
+ Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và
dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang
trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày.
+ Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự
động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng
đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn
nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy
chìm để nuôi cấy vi khuẩn.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 11 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai

3.4. Thu nhận enzyme (E)
3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3]
Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào
(intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi
trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi
sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.
- Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào
và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này,
bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển
chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như
nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng

hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào,
người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu
âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate và
chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế
bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước
cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
+ Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết
đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và
tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5
0
C). Các thao tác phải

nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl
2
,
CaCl
2
. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
- Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử
lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước
hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
- Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có
phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau:
phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi

trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi
hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di,
phương pháp lọc gel.
- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác
nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh
trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng
thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản
phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực
vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong
công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân
bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 12 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ
pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme.
- Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào,
màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học
hoặc hóa học.
Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng
phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào
thu nhiều cách như:
+ Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi.
+ Để tế bào tự phân hủy.

+ Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng
muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ.
+ Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp.
- Thẩm tích [8]
Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ
không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa,
dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối
tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực… người ta thường dùng phương pháp
thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết
E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần
được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất
hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau.

- Làm đặc [8]
Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau
khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều.
Làm đặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách
thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán
thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn
qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm).
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 13 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [8],
[18]
4.1. Quy trình thu nhận

Hình 1.5. Quy trình thu nhận enzyme protease
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 14 Lớp: 08s2
Thu nhận sinh khối
(enzyme thô)
Chế phẩm enzyme
thô đem tinh chế
Nghiền mịn
Trích ly
Chế phẩm ezyme
thô đem sử dụng
Khoáng hỗn hợp

Nguyên liệu dinh dưỡng (bột
bắp, cao nấm men, pepton)
Hấp thanh trùng
Làm nguội đến 30
0
C
Nước
Đỗ lên khay
Giống Asp.oryzae
Nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng
0,5-2%

Dùng trong
chăn nuôi
Lọc
Kết tủa enzyme
Thu nhận kết tủa
Sấy
Tinh chế
Bã
Chế phẩm ezyme
Kỹ thuật
Thu nhận chế
phẩm enzyme tinh

khiết
Sấy
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết bị
4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomycetes. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất
mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi
thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào).
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa

sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi
sẽ mọc thành mốc mới.
4.2.2. Kỹ thuyật nuôi cấy
Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài
2 - 3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này
được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng
nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ
thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 32
0
C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá

đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi
trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi
ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ. Điều
này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường
cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu
nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc
biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá

30
0
C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ. Enzyme protease được
tổng hợp mạnh. Lượng O
2
trong không khí giảm và CO
2
sẽ tăng dần, do đó trong
giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong
khoảng 29 - 30
0

C là tốt nhất.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 - 20 giờ. Quá trình trao đổi chất
yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi
trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20 - 25 thể tích
không khí/thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 30
0
C, trong giai
đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzyme protease tạo ra sẽ
giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym
rất cần thiết.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 15 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai

4.2.3. Thu nhận sản phẩm
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme protease,
chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không
cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến
hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành
như sau:

Nghiền mịn
Toàn bộ khối lượng enzyme thô protease được đem đi nghiền nhỏ. Mục
đích của qúa trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát

ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào
khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi
trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng
hơn.
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền như cát
thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia
vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh
và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100
0
C để loại bỏ
nước và tiêu diệt vi sinh vật.
 Trích ly

Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường
dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô,
người ta cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu
riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy
tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó có chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm
sao tách enzyme ra khỏi vật chất này.
 Kết tủa enzyme protease
Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân
gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat

amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây
tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme
thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất
làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện
tượng biến tính.
Các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc
thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70% W).
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 16 Lớp: 08s2
Hình 1.6. Nồi hấp khử trùng.
môi trường
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai

Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo
quản người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 40
0
C cho đến khi độ ẩm cuối cùng
đạt 5 - 8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn
hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài
enzyme ta quan tâm.
4.2.4. Đề xuất thiết bị

Nồi hấp khử trùng môi trùng
Mục đích của quá trình thanh trùng là tiêu

diệt hoàn toàn vi sinh vật tạp nhiểm còn tại trong
môi trường dinh dưỡng, ngoài quá trình gia nhiệt
sẽ làm cho môi trường dinh dưỡng chuyển hóa vi
sinh vật dễ dàng đồng hóa chất dinh dưỡng trong
môi trường nuôi cấy.
Ta tiến hành thanh trùng trong thời gian
45 - 60 phút, áp suất 1at, nhiệt độ 118 – 125
0
C.
 Máy nghiền búa
Loại thiết bị này được dùng để nghiên cứu
các chủng nấm mốc.

Sản phẩm ban đầu có kích thước các tiểu phần nhỏ đến 50 mm qua đoạn
ống ở trên nắp của thiết bị, được cho vào tâm rôto một cách liên tục, dưới tác
động của lực ly tâm sản phẩm qua khoảng giữa các búa bị va đập nhiều lần và bị
vỡ ra.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 17 Lớp: 08s2
Hình 1.7.Thiết bị nghiền búa
Hình 1.8. Máy trích ly kiểu
vít tải
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
 Máy trích ly
Để trích ly
enzyme, acid amin và

các chất khác từ vật liệu
rắn trong điều kiện sản
xuất lớn, người ta ứng
dụng trích ly tác động
liên tục.
Bộ nạp liệu kiểu vít tải
chuyển pha rắn của canh
trường nấm mốc vào
phần trên của cột
nạpliệu. Canh trường
nấm mốc từ cột nạp liệu
qua cột chuyển nằm

ngang vào cột nâng và
sau khi vắt thì thải ra
ngoài.
Nước dâng lên trong cột nạp liệu được bảo hòa liên tục và sau khi qua bộ
lọc thì đưa ra ngoài. Thời gian trích ly 40 - 60 phút ở 25
0
C.
 Máy sấy phun sương
Hình 1.9. Máy sấy phun sương LPG Hình 1.10. Thiết bị sấy phun hình đáy bằng
Không khí đi qua bộ lọc và bộ gia nhiệt được đưa vào bộ phân phối không
khí ở trên đỉnh thiết bị; khí nóng được đưa vào buồng sấy đều theo hình xoáy
trôn ốc. Nguyên liệu dạng lỏng từ máng nguyên liệu đi qua bộ lọc được bơm lên

bộ phun sương ở trên đỉnh của buồng sấy làm nguyên liệu trở thành dạng hạt
sương cực nhỏ, khi tiếp xúc với khí nóng, lượng nước có trong nguyên liệu
nhanh chóng bay hơi, nguyên liệu dạng lỏng được sấy khô thành thành phẩm
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 18 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
trong thời gian cực ngắn. Thành phẩm được phần đáy của buồng sấy và bộ phân
li gió xoáy đùn ra ngoài, phần khí thừa còn lại được quạt gió hút và đẩy ra ngoài.
 Thiết bị lọc
Máy lọc chân không dạng thùng quay: Loại này được ứng dụng để tách
sinh khối vi sinh vật khỏi dung dịch canh trường.
Chất lỏng canh trường chảy vào nhánh trên của băng tải và khi chuyển dịch trên
các phòng chân không, phần chiết qua lỗ lọc vào các khoang, còn các tiểu phần

rắn của huyền phù bị giữ lại trên bề mặt của băng tải.
Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị lọc chân không dạng thùng quay tác động liên tục
5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease
5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò
xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về
enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực
nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu
nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác
nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của
enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [3]. Và gần đây nhất là những
sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như:

+ Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu
hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại
học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột
cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát
quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius
bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất
là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung
môi 1/1; pH 9,5; nhiệt độ 35
0
C; thời gian chiết 10 phút. [12].
+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter
sp. QN6 sinh tổng hợp Protease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị

Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện
thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển
Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [13].
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 19 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm
Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP
Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine
Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn
quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết
enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat
nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động

trên cơ chất casein là 55
0
C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [14],[4].
+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột
đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang.
Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt
cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy
phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ
thịt cá mối và thủy phân ở 50
0
C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các

năm 1993 - 1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện
Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân
protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [5]
5.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới
Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu
tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin
từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu
hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [9].
Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được
xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên
cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain,

tripxin, kimotripxin, subtilizin… [9].
Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm
1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân
giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu
Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô
sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [9].
Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sữa
(Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế
biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al.,
2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số
thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,

globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong
những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa
dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng
(Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 20 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các
enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử
dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [11].
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực
vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều

thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng
doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số
lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển
nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản
xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn
Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng
Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan,
Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên
cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất
Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào
khoảng 5% - 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên

các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy
mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4], [1].
Enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học,
nghiên cứu khoa học.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 21 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THIẾT BỊ
I. Đối tượng nghiên cứu
1.Giới thiệu nguyên liệu [6]
Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia là malt đại mạch, hoa houblon,
nước và sử dụng nguyên liệu thay thế là ngô, gạo.
1.1. Malt đại mạch

1.1.1. Vai trò của malt trong sản xuất bia
Trong công nghiệp sản xuất bia malt là nguồn nguyên liệu chủ yếu được
dùng để sản xuất bia vì vậy nó có vai trò rất quan trọng trong công nghiệp sản
xuất bia. Thành phần của malt là những nhân tố quyết định đến chất lượng của
bia thành phẩm sau này, chúng giúp cho bia có hương vị đặc trưng, có vị đắng
dịu hài hòa tạo cảm giác thú vị cho người sử dụng.
Trong thành phần của malt có chứa một lượng Enzyme khá phong phú.
Trong những điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH thì các Enzyme này hoạt động
mạnh phân cắt các hợp chất hữu cơ có phân tử lớn thành những hợp chất có
phân tử lượng thấp. Mặc khác trong thành phần của malt có chứa nhiều tinh bột,
các đường đơn, protein, các sắc tố tạo màu, mùi, vị làm cho bia có hương vị đặc
trưng.

Malt đại mạch vừa là tác nhân đường hoá, vừa là nguyên liệu đặc trưng
dùng sản xuất bia, bia sản xuất từ malt đại mạch có mùi vị và tính chất công
nghệ hơn hẳn so với bia được sản xuất từ malt của các loại hạt hoà thảo khác.
Một số đặc tính của malt
Malt là một loại ngũ cốc được sản xuất từ lúa đại mạch. Malt đại mạch
gieo trồng là loại thực vật xếp vào họ hordeum gồm: hordeum sativum, hordeum
murium, hordeum jubatum…
Tùy theo mục đích sử dụng mà malt đại mạch được chia thành 2 nhóm:
đại mạch mùa đông (gieo hạt mùa đông, thu hoạch mùa hè) và đại mạch mùa
xuân (gieo hạt mùa xuân, thu hoạch mùa thu). Thường chu kỳ sinh trưởng của
đại mạch 100 – 120 ngày.
Trong công nghiệp thì người ta thường dùng dại mạch để chế biến bia là

giống đại mạch 2 hàng (hordeum distichum). Dấu hiệu đặc trưng của đại mạch
Trong nông nghiệp người ta dùng đại mạch làm thức ăn gia súc chăn nuôi
hoặc hai hàng là hình dáng rất cân đối tùy thuộc vào tư thế và đặc điểm của
bông.
Đại mạch hai hàng được chia thành ba nhóm nhỏ: đại mạch bông cúi,
bông đứng và bông xòe. Đại mạch bông cúi có đặc điểm là trục bông rất dẻo, gié
của hạt dài, sau khi trổ hoa và làm đòng thì bông bắt đầu cúi xuống. Đại mạch
bông đứng có đặc điểm là cây to cứng, bông dày hạt. Loại này được trồng nhiều
ở một số nước Tây Âu. Đại mạch bông xòe thì có gié rất ngắn, có hạt dường như
được tính vuông góc với trục bông chủ yếu trồng nhiều ở Anh, Ailen và Bắc Mỹ
chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm,…thường dùng đại mạch đa hàng
(hordeum polystychum).

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 22 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Giống đại mạch đa hàng này được chia làm hai nhóm: đại mạch bốn hàng
(H.hexatichum) và đại mạch sáu hàng (H. tetratichum) thông thường giống đại
mạch bốn hàng cũng được dùng để sản xuất bia nhưng không được phổ biến.
Hình 1.12. Đại mạch hai hàng
Hình 1.13. Đại mạch nhiều hàng
1.1.2. Thành phần cấu tạo của malt
Hạt của malt đại mạch có ba bộ phận chính: vỏ, nội nhũ và phôi.

Vỏ
Vỏ hạt chiếm tỉ lệ khá lớn nhưng không có giá trị dinh dưỡng. Đối với

công nghệ sản xuất bia vỏ hạt gây ảnh hưởng hai mặt: mặt bất lợi là trong vỏ có
chứa các chất màu,các chất đắng và các chất chát nếu các chất này hòa tan vào
dịch đường sẽ làm giảm chất lượng của sản phẩm. Mặt lợi của lớp vỏ là đóng
vai trò xây dựng màng lọc trong quá trình tách bả khỏi khối cháo.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 23 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Vỏ hạt đại mạch từ ngoài vào trong chia làm ba lớp: vỏ trấu, vỏ quả, vỏ
hạt. Phần này chiếm từ 8 - 15% trọng lượng hạt.
Vỏ trấu là cấu tử chiếm nhiều nhất trọng lượng của vỏ, nó được hình
thành từ đài hoa. Đài hoa dưới hình thành nên vỏ trấu phía ngoài (phía lưng) và
kết thúc bằng sợi râu, còn đài hoa hình thành nên vỏ trấu phía trong (phía bụng)
của hạt…Đài hoa là công cụ để bảo vệ các cơ quan bên trong của hạt trong quá

trình hình thành và chuyển hóa của nó.
Thành phần hóa học của vỏ trấu chủ yếu là xellulose kết chặt lại nhờ chất
khoáng và linhin. Dưới lớp vỏ trấu là lớp vỏ quả được cấu tạo từ lớp tế bào, cứ
một lớp xếp ngang thì tiếp đến là một lớp xếp dọc. Với cấu trúc như vậy lớp vỏ
quả sẽ rất dai và bền vững.
Dưới lớp vỏ quả là lớp vỏ hạt bai gồm hai lớp tế bào, tế bào của lớp ngoài
có thành rất dày, lớp trong thì trong suốt. Lớp vỏ hạt có vai trò như một màng
bán thấm: chỉ cho nước thấm vào bên trong hạt đồng thời giữ các chất hòa tan
trong hạt không cho thấm ra ngoài.
Lớp vỏ quả và lớp vỏ hạt liên kết chặt với nhau, mối liên kết đó chắt hơn
rất nhiều so với sự liên kết giữa chúng với lớp vỏ trấu.
 Nội nhũ hạt:

Nội nhũ hạt là thành phần lớn nhất đồng thời là phần có giá trị nhất của
hạt, chiếm từ 45 – 68% trọng lượng hạt. Phần này của hạt đại mạch giữ vai trò
quyết định đến chất lượng của đại mạch trong sản xuất bia. Ngoài cùng của nội
nhũ tiếp giáp với lớp vỏ hạt là lớp aloron. Lớp aloron này rất giàu protein, chất
béo, đường xelluloza, pentoza, vitamin và chất tro. Dưới lớp aloran mới đến
phần nội nhũ thật của hạt.
Cấu trúc của nội nhũ gồm các tế bào lớn có thành mỏng chứa đầy các hạt
tinh bột, một ít protein, xelluloza, chất béo, tro và đường. Các hạt tinh bột trong
nội nhũ malt có dạng hình tròn có kích thước rất lớn 20 - 30 mm hoặc rất bé từ
2 – 10 mm có rất ít những hạt có kích thước trung bình, trọng lượng riêng của
hạt tinh bột khá cao 1,5 – 1,6 vì vậy chúng lắng xuống nhanh, tinh bột không tan
trong nước kể cả những dung môi hữu cơ trung tính, có nhiệt độ hồ hóa là . 75 –

80
0
C.
Ngoài thành phần là tinh bột còn có chứa một số tạp chất khác như nito
0,5 – 1,5%; tro 0,2 – 0,7%; axit béo 0,6%.
Cấu tạo tinh bột gồm hai dạng polysacharide: amylo và amypectin.
- Amylo: chiếm từ 17 -24% trọng lượng tinh bột là một polyme ở dạng
xoắn – thẳng gồm 60 – 600 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu oxy & - 1,4
glucozit.
- Amylopectin: chiếm từ 76 – 83% trọng lượng tinh bột, là một polyme ở
dạng xoắn –nhánh gồm khoảng 2000 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu
oxy - 1,4 glucozit ở mạch chính và - 1,6 glucozit ở mạch nhánh.

Tinh bột sẽ chịu tác động xúc tác của hệ enzyme amylaza, hiệu quả xúc
tác này sẽ tùy thuộc vào nhiệt độ và pH.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 24 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai

Phôi
Phôi là cơ quan sống, hô hấp của hạt. Phôi thường chiếm 2,5 – 5% trọng
lượng hạt. Trong phôi có từ 37 - 50% chất khô là thành phần nito, khoảng 7%
chất béo, 5 – 6% đường saccaroza, 7 – 7,5% pentoza, 6 – 6,5% chất tro và một ít
thành phần khác.
Vai trò của phôi có tầm quan trọng đặc biệt không những đối với sự sống
lưu truyền của cây mà ngay cả trong công nghiệp sản xuất bia. Quá trình chế

biến hạt đại mạch để trở thành hạt malt được đặt nền tảng trên sự nảy mầm của
hạt, tức là sự phát triển của phôi.
Trong giai đoạn này quá trình sinh học chủ yếu xảy ra là sự hoạt hóa và
tích lũy hoạt lực của enzyme trong hạt. Nhờ quá trình này mà một chất dinh
dưỡng cao phân tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân tử. Một phần các chất
thấp phân tử này được chuyển về phôi để nuôi cây non, phần còn lại tồn tại
trong hạt để sau này biến thành chất hòa tan của dịch đường.
Phôi nằm ở phía dưới gần đế của hạt bao gồm phôi lá , phôi rễ và nằm
giữa chúng là phôi thân. Tiếp giáp giữa phôi và nội nhũ là lớp ngù. Ngù là một
lớp màng bán thấm: nó chỉ cho phép các chất hòa tan từ nội nhũ thấm qua để
chuyển về phôi và nước từ phía phôi đi vào nội nhũ.
1.1.3. Thành phần hoá học của malt

Thành phần hóa học của malt đại mạch rất phức tạp. Nó phụ thuộc vào
giống đại mạch, điều kiện đất đai, khí hậu, kĩ thuật canh tác và điều kiện bảo
quản.Thành phần hóa học của malt là nhân tố quyết định chất lượng của đại
mạch để xem xét loại đại mạch đó có đủ tiêu chuẩn để sản xuất bia hay không.

Nước
Thủy phần của đại mạch có ảnh hưởng lớn đến quá trình vận chuyển và
bảo quản hạt. Hàm ẩm cao sẽ kích thích quá trình hô hấp và tự bốc nóng của hạt.
Hai quá trình này là nhân tố quan trọng làm hao tổn chất khô. Thủy phần cao
quá mức cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển.
Đặc biệt nguy hiểm là các loại vi khuẩn hoại sinh gây thối rữa cho hạt.
Đại mạch có thủy phần cao sẽ làm tăng chi phí vận tải một cách vô ích. Người ta

xác định được hàm ẩm của đại mạch tăng 1% thì hiệu suất thu hồi chiết giảm
0.76%, hàm ẩm tối đa cho phép của đại mạch khi đưa vào bảo quản là 13%.

Gluxit
Gluxit được chia làm bốn nhóm: mono, disacharide, trisacharide và
polysacharide.
Monosaccharide trong đại mạch bao gồm glucoza, fructoza và xitaza.
Trong thành phần của disaccharide thì chủ yếu là saccharoza và maltoza
còn thành phần của trisaccharude là đường rasinoza.
Polysaccaride là hợp phần chiếm nhiều nhất trong thành phần gluxit của
hạt đại mạch. Chúng bao gồm tinh bột, xelluloza, hemixelluloza, pentoza,
amylan và các hợp chất hợp kẹo. Ba cấu từ có ý nghĩa quan trọng nhất trong

công nghệ sản xuất bia.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 25 Lớp: 08s2