nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đặt vấn đề
Vitamin là nhóm chất thiết yếu đối với sự sống mà cơ thể con ngời không
thể tự tổng hợp đợc hoặc tổng hợp ở lợng rất ít không đủ đáp ứng với nhu cầu.
Các vitamin cần phải đợc cung cấp từ nguồn ngoại sinh. Vì vậy phối hợp các
vitamin nhằm cung cấp một số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý và bệnh
lý không thể thiếu đợc của cơ thể đã trở thành cách sử dụng thuốc quen thuộc.
Hiện nay trên thị trờng, có một số lợng lớn rất đa dạng và phong phú các
chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin). Việc đảm bảo chất lợng của nhóm
chất này đã trở thành nhu cầu cấp thiết.
Việc phân tích các vitamin tan trong dầu và trong nớc đã đợc thực hiện
thành công bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên đối với
vitamin D thì việc phân tích vẫn là một vấn đề khó khăn. Vitamin D có hoạt
lực sinh học mạnh nên có hàm lợng rất nhỏ, ở mức tạp so với các vitamin khác
trong các chế phẩm hỗn hợp. ở nồng độ phân tích đợc vitamin D thì hàm lợng
của các tá dợc và tạp phân huỷ của các vitamin khác rất nhiều và tơng đơng
với vitamin D. Thực tế chỉ có thể định lợng đợc các chế phẩm vitamin D đơn
có hàm lợng cao còn với các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng vitamin D thấp
thì chỉ có thể định tính.
Vì thế để định lợng đợc các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng thấp đòi hỏi
phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm sạch và làm giàu mẫu. Trong luận văn
này chúng tôi đề cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase
extraction) để làm sạch và làm giàu mẫu trớc khi tiến hành định lợng bằng ph-
ơng pháp HPLC.
Syro Patarvit là một ví dụ về sự phối hợp của các vitamin tan trong dầu
với các vitamin tan trong nớc ở dạng bào chế syro thuốc. Công thức cho 5 ml :
Vitamin B1 2mg
Vitamin B2 1mg
Vitamin B6 1mg
Nicotinamid 5mg
Vitamin A 1.000 UI
Vitamin D3 200UI

Lysine 100mg
Trong tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm chỉ quy định định tính chứ không
định lợng đợc vitamin D. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng
1
dụng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao" với các mục tiêu sau:
Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D
trong syro thuốc.
Xây dựng quy trình HPLC để định lợng vitamin D
áp dụng định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit
Phần 1
Tổng quan
1.1 Vitamin D [1, 2, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16 ]
1.1.1 Công thức cấu tạo
- Vitamin D
2
.

C
27
H
44
O (M= 384,6)
Tên khoa học : ergocalciferol
- Vitamin D
3
.
2

C

27
H
44
O (M= 384,6)
Tên khoa học : Cholecalciferol
1.1.2. Nguồn gốc
Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn từ động vật nh trứng, sữa, thịt
Trong cơ thể vitamin D đợc tổng hợp ở các tế bào dới da nhờ ánh sáng tử
ngoại
Vitamin D còn có nguồn gốc tổng hợp.
1.1.3. Tính chất
Tinh thể hình kim, không màu, không mùi, không tan trong nớc, dễ tan
trong các dung môi hữu cơ nh ethanol, cloroform, ether và các chất béo.
Không bền với nhiệt độ, không khí, ánh sáng.
1.1.4. Tác dụng dợc lý và cơ chế tác dụng
Tham gia vào quá trình tạo xơng: làm tăng hấp thu calci và phosphat ở
ruột, tăng tái hấp thu calci ở ống lợn gần, tham gia vào quá trình calci hoá sụn
tăng trởng. Vì vậy vitamin D rất cần thiết cho sự phát triển bình thờng của trẻ
em.
Điều hoà nồng độ calci trong máu: Nếu các quá trình trên không cung
cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm thì vitamin D (kết hợp với hormon
tuyến cận giáp) sẽ huy động calci từ xơng ra.
Ngoài ra vitamin D còn tham gia biệt hoá tế bào biểu mô và gần đây đang
nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung th.
Vì thế khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm
giảm calci huyết, khi đó calci bị huy động từ xơng nên hậu quả là trẻ em chậm
3
lớn, còi xơng, chậm biết đi, chậm kín thóp. Ngời lớn sẽ bị loãng xơng, xốp x-
ơng.
1.1.5. Chỉ định

Phòng và điều trị còi xơng do thiếu vitamin D
Phòng và điều trị loãng xơng, dễ gãy xơng.
Chống co giật do suy tuyến cận giáp
Hạ calci huyết
Một số bệnh ngoài da nh chứng xơ cứng bì
1.1.6. Vitamin D và các chế phẩm multivitamin
Vitamin D thờng đợc phối hợp với các vitamin tan trong dầu và các
vitamin tan trong nớc. Một số chế phẩm phối hợp đợc liệt kê trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Một số chế phẩm phối hợp của vitamin D
Tên sản
phẩm
Dạng bào
chế
Thành phần Hàm lợng D
(U.I)
Nhà sản
xuất
Enpovid
Nang mềm A, D 400 Cty TNHH
SPM
Vitamin A-D
Nang mềm A, D 500 XNLHD Hậu
Giang
Hydrosol
Hỗn dịch A, D, B1, B2,
E, B6, PP, B5
500 UI/ml
Roche
Patarvit
Syro

B1, B2, B6,
PP, A, D, B12
40 UI/ml
Patar Lab
LTD
Homtamin
Viên nang
mềm
A, D, B1, B2 400 UI Hàn Quốc
1.1.7. Các phơng pháp định lợng vitamin D
- Phơng pháp hóa học [2, 7, 12, 13]
+ Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid.
Đem đo quang ở 500 và 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn.
+ Nhận xét: Quy trình thực hiện rất phức tạp, bao gồm các giai đoạn xà
phòng hóa trong điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách và tinh chế qua các cột sắc
ký bán điều chế sử dụng các chất nhồi là đất tẩy màu dùng cho sắc ký và đất
silic dùng cho sắc ký, sau đó tạo màu và đo quang. Do tiến hành qua nhiều
giai đoạn nên làm giảm độ chính xác.
- Phơng pháp sinh học [2, 7, 12, 13]
4
+ Nguyên tắc: Hoạt lực vitamin D đợc đánh giá thông qua xác định mức
độ vôi hóa xơng trên thỏ hoặc chuột.
+ Nhận xét: Phơng pháp này tiến hành khá phức tạp. Kết quả phụ thuộc
nhiều vào các cá thể và đòi hỏi ngời thử nghiệm phải đợc đào tạo kỹ lỡng.
- Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1, 2, 7, 11, 12, 16]
+ Nguyên tắc: Dựa trên sự phân bố khác nhau của vitamin D giữa pha
động và pha tĩnh so với các thành phần hoạt chất khác.
+ Nhận xét: Đây là phơng pháp hiện đại, ngày càng đợc áp dụng phổ
biến. Tuy nhiên cũng chỉ có thể áp dụng trực tiếp với các chế phẩm đơn hoặc
đa thành phần trong đó vitamin D có hàm lợng cao (>500 UI/1 đơn vị phân

liều) còn với các chế phẩm có hàm lợng D thấp thì đòi hỏi phải có biện pháp
xử lý mẫu phù hợp để làm sạch và làm giàu mẫu.
1.2 Kỹ thuật Chiết pha rắn [5, 14, 15]
Đây là kỹ thuật chiết đợc ứng dụng ngày càng nhiều. Ngày nay, trong
thực hành phân tích, nó đã dần thay thế các phơng pháp chiết lỏng-lỏng cổ
điển.
Phơng pháp chiết pha rắn sử dụng các cột đợc nhồi các chất rắn khác
nhau, có cơ chế tơng tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn
giống nh trong sắc ký lỏng.
Do cơ chế chiết tách trên mà các chất pha rắn đợc sử dụng cũng giống
nh pha tĩnh trong sắc ký lỏng.
1.2.1 Phân loại các kiểu chiết
- Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử dụng ngay các nhóm chức
trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. Về cơ bản, sử dụng điều kiện sắc ký pha
thuận. Chất hấp phụ hay đợc dùng nhất là silicagel, magnesi silicat, nhôm
oxyd.
- Kiểu phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi,
gắn thêm nhóm chức hoá học đóng vai trò chính trong kiểu tơng tác phân
bố, bao gồm các kiểu điều kiện sắc ký sau:
Pha thuận: pha tĩnh phân cực sẽ giữ lại các chất phân cực và cho phép
các chất không phân cực đi qua cột. Thông thờng kiểu này sử dụng các dung
môi ít hoặc không phân cực.
Pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngợc lại kiểu pha thuận.
Pha đảo tạo cặp ion: pha tĩnh không phân cực, mẫu phân cực có chứa
các phân tử cần phân tích ở dạng ion kết hợp với ion trái dấu đợc thêm vào
5
trong mẫu, trở thành phân tử trung hoà đợc lu giữ lại trên cột và rửa giải theo
cơ chế pha đảo.
Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi, gắn với các nhóm
chức có thể ion hoá. Cơ chế tách chiết của kỹ thuật này cũng giống nh sắc ký

trao đổi ion. Các nhóm chức gồm nhóm trao đổi anion mạnh hoặc yếu và
nhóm trao đổi cation mạnh hoặc yếu.
1.2.2. Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu qua 5 bớc
Bớc 1: Chọn loại cột pha rắn.
Có thể sử dụng các cột 1ml, 2ml hoặc 5ml phụ thuộc vào: thể tích mẫu,
mức độ tạp chất, tính phức tạp của nền mẫu, lợng chất phân tích quan tâm,
tính chất dung môi mẫu và tính chất tơng tác giữa chất phân tích với pha rắn.
Bớc 2: Luyện cột.
Luyện cột nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu cần chiết và loại
một số tạp chất còn ở trên cột. Thông thờng sau khi luyện cột phải rửa tiếp cột
bằng một dung môi giống nh dung môi dùng để chuẩn bị mẫu.
Bớc 3: Chuyển mẫu vào cột chiết.
Chuyển chính xác lợng mẫu cần chiết vào cột, sử dụng pipet hoặc
micropipet. Cần lu ý, để tránh tắc cột, cần phải ly tâm hoặc lọc mẫu trớc khi
chiết. Sau khi chuyển toàn bộ mẫu, sử dụng máy hút chân không hoặc áp lực
đẩy.
Bớc 4: Rửa.
Nếu nh hợp chất cần quan tâm lu trên cột, rửa để loại bỏ các chất không
mong muốn, các tạp chất không lu trên cột bằng dung dịch đã dùng để chuẩn
bị mẫu hoặc một dung dịch khác mà nó không rửa giải hợp chất cần quan tâm.
Bớc 5: Rửa giải các hợp chất cần thiết.
Sử dụng lợng nhỏ thể tích dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết
các hợp chất quan tâm và để lại các tạp chất không đợc loại trong quá trình
rửa. Dịch rửa giải đợc thu hồi để tiếp tục phân tích.
1.2.3. Ưu nhợc điểm và ứng dụng của chiết pha rắn.
Chiết pha rắn là một phơng pháp chiết thuận tiện, không đắt, tiết kiệm
thời gian và có thể thay thế cho chiết lỏng-lỏng. Kỹ thuật này đợc dùng để
làm sạch và làm giàu mẫu phân tích. Thêm vào đó, nó giảm đáng kể lợng
dung môi hữu cơ sử dụng.
6

Hình 1.1: Sơ đồ miêu tả kỹ thuật chiết pha rắn trong phân tích
1.3. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [3, 4, 6, 16]
1.3.1. Khái niệm cơ bản
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phơng pháp tách hoá lý dựa
vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và
không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất
lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một
7
chất rắn đã đợc phân chia dới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một
chất mang rắn hay một chất mang đã đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với
các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hoặc rây phân tử.
- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại
sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất
trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã đợc gắn pha liên kết
ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân
tử. Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tơng tác:

Pha tĩnh
Pha động



F
2
1
3
F

F
Chất phân tích
(A+ B+C)
Tổng của 3 tơng tác này sẽ quyết định chất nào đợc rửa giải ra trớc tiên
khi lực lu giữ là nhỏ nhất và ngợc lại.
1.3.2. Các đại lợng đặc trng.
Thời gian lu và thể tích lu
Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ:
8
Hình 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trng
Nếu gọi t
R
là thời gian lu giữ của một chất
Thì : t
R
= t
R
t
0
Trong đó: t
R
là thời gian lu thực (thời gian lu hiệu chỉnh).
t
0
là thời gian chết (thời gian không lu giữ).
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lu có
thể thay thế bằng thể tích lu. Thể tích lu là thể tích pha động thu đợc sau cột
trong khoảng thời gian tơng ứng với thời gian lu.
Hệ số phân bố

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và
pha tĩnh. Sự phân bố này đợc đặc trng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố
đợc tính theo công thức :
M
C
Cs
K =
Trong đó C
S
, C
M
là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở
thời điểm cân bằng.
Thừa số dung lợng
9
Thừa số dung lợng là đại lợng biểu thị khả năng phân bố của chất tan
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lợng chất tan trong
pha tĩnh và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
M
S
M
S
V
V
K
Q
Q
k ì=='
Trong đó Q
S

, Q
M
là lợng chất tan có trong pha tĩnh và pha động
V
S
, V
M
là thể tích pha tĩnh và pha động.
Có thể tính k theo một công thức khác :
O
OR
t
tt
k

='
Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ đợc tách ra khi chúng có các giá trị k khác nhau, hệ số chọn
lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
RA
RB
ORA
ORB
A
B
A
B
t
t
tt

tt
k
k
K
K
'
'
'
'
=


===

ở đây ta quy ớc chất B bị lu giữ mạnh hơn chất A, nh vậy

luôn lớn hơn
1,

càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thờng phân tích trong
điều kiện

trong khoảng 1,5 đến 2.
Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thờng đợc biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo các công thức :
2
16

ì=
W
t
N
R
hoặc
2
2/1
54,5








ì
W
t
R
Trong đó W : Là chiều rộng pic ở đáy pic

2/1
W

: Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Chiều cao của đĩa lý thuyết đợc tính theo công thức :
N
L
H =
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất
định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với
mỗi chất phân tích.
Độ phân giải (R
S
)
10
Độ phân giải là đại lợng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho . Độ phân giải của hai pic cạnh nhau đợc tính
theo 1 trong 3 công thức sau:
( )
BA
RARB
S
WW
tt
R
+
ì
=
2
hoặc
( )
)(2/1)(2/1
18,1

BA
RABR
WW
tt
+
ì
hoặc
ì



1
4'1
'
N
k
k
B
B
ì
+
Hệ số đối xứng (T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:
A
W
T
x
2
=
Trong đó W

x
là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
A là khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đờng cong
phía trớc, ở tại 1/20 chiều cao pic.
1.3.3. Hệ thống HPLC
Theo thứ tự từ đầu đến cuối của hệ thống máy HPLC có các bộ phận
chính sau
Bình chứa dung môi
Bơm cao áp : đẩy pha động qua cột sắc ký
Bộ phận tiêm mẫu : tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định
Cột tách (pha tĩnh)
Detector
Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính
1.3.4. Pha tĩnh
* Khái niệm: Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách
một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp, kích thớc hạt rất nhỏ,
đờng kính cỡ hạt từ 3 10
m
à
, diện tích bề mặt hạt thờng từ 50 500 m
2
/g.
* Phân loại
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, ngời ta
chia nó thành nhiều loại nh hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. T-
ơng ứng với loại chất nhồi nh thế ngời ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ
thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, ngời ta chia nó thành
hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là
chất lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).

11
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký
pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, ngời ta chia nó
thành hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài).
* Điều kiện đối với một pha tĩnh
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trờng sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc
- Tính chất bề mặt phải ổn định
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tơng đối đồng nhất.
1.3.5. Pha động
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất
linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp
nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó cũng có
thể là dung dịch các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói
chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có đợc
hiệu quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký
của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lu giữ các chất mẫu và
hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hởng đến :
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lu giữ của chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký
Điều kiện đối với một pha động
- Phải trơ đối với pha tĩnh
- Hoà tan đợc chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian
- Có độ tinh khiết cao
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp với loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích
12
- Có tính kinh tế và không quá hiếm
Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động
- Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
1.3.6. Cách đánh giá pic
Đánh giá diện tích pic : Diện tích pic của một chất tơng ứng với tổng l-
ợng chất đó.
Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là
một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá.
1.3.7. Phơng pháp định lợng và cách tính kết quả trong HPLC.
Tất cả các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là:
Nồng độ của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó. Có 4 phơng
pháp định lợng đợc sử dụng trong sắc ký:
* Phơng pháp ngoại chuẩn.
* Phơng pháp nội chuẩn.
* Phơng pháp thêm.
* Phơng pháp phần trăm diện tích píc (hoặc phần trăm chiều cao pic).
13
Phần 2
Thực nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và phơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu và thiết bị
Đối tợng:

Mẫu syro Patarvit
Nhà sản xuất: Patar Lab Ltd., Part (Thái Lan)
Số lô: 406146
Hạn dùng: 06-2006
Công thức: trong mỗi 5 ml syro chứa:
Vitamin B1 2mg
Vitamin B2 1mg
Vitamin B6 1mg
Nicotinamid 5mg
Vitamin A 1.000 UI
Vitamin D 200UI
Lysine 100mg
Hoá chất:
- Chất đối chiếu vitamin D (dầu 1000.000 UI/g)
- Chất đối chiếu vitamin A (dầu 1000.000 UI/g)
- Chất đối chiếu vitamin B1, B2, B6, PP
- Methanol tinh khiết sắc ký
- Acetonitril tinh khiết sắc ký
- Nớc cất
- Hexan
Dụng cụ-thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : HP 1100, gắn với máy vi tính và máy
in
- Cột Lichrosorb RP18(250 x 4 mm, 5 và 10àm )
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với đờng kính lỗ màng lọc 0,45
- Máy lắc siêu âm
- Cân phân tích Mettler AB 204
- Cột SPE C18 (200 mg x 2 ml)
- Bộ thiết bị chiết pha rắn
14

- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức chính xác 50 ml; 25 ml; 20 ml;10
ml; ống đong, pipet chính xác, cốc có mỏ và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
2.1.2. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu
Nội dung:
- Khảo sát và xây dựng quy trình chiết
+ Lựa chọn dung môi để rửa sạch tạp và dung môi để rửa giải
+ Khảo sát thể tích dung môi để rửa sạch tạp mà vẫn không làm mất
vitamin D
+ Khảo sát thể tích dung môi rửa giải để rửa giải hết vitamin D
+ Khảo sát lợng dung môi để rửa sạch các vitamin còn lại trong cột để
phục hồi cột.
- Xây dựng quy trình HPLC để phân tích Vitamin D
Để xây dựng chơng trình sắc ký thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát :
+ Kiểu sắc ký áp dụng
+ Cột tách sử dụng
+ Các điều kiện về pha động (thành phần, tỉ lệ, tốc độ dòng)
+ Bớc sóng
- Đánh giá chơng trình sắc ký vừa xây dựng
+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
+ Khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin D
+ Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lợng
- áp dụng định lợng vitamin D trong syro Patarvit.
+ Sử dụng quy trình chiết và quy trình sắc ký đã xây dựng ở trên để định
lợng vitamin D trong syro Patarvit
+ Khảo sát tính chính xác của kết quả phân tích.
+ Khảo sát tính đúng của kết quả phân tích.
Phơng pháp nghiên cứu:
Phơng pháp nhiên cứu sử dụng trong khoá luận là sắc ký lỏng hiệu năng
cao và chiết pha rắn (SPE). Tiến hành thực nghiệm để xây dựng quy trình
chiết tối u và chơng trình sắc ký phù hợp nhất. Sau đó thông qua xử lý thống

kê các kết quả khảo sát để đánh giá chơng trình sắc ký và phơng pháp đã xây
dựng.
Một số đặc trng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả.
15
Các số liệu thực nghiệm đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê thông qua
các đặc trng sau:
- Giá trị trung bình:

=
=
n
i
i
x
n
x
1
1

- Độ lệch chuẩn:
( )
1
1
2


=

=
n

xx
S
n
i
i

- Sai số chuẩn:
( )
n
S
S
x
=

- Sai số tơng đối:
( )
100
x
St
x
% =
2.2. Kết quả thực nghiệm
2.2.1. Khảo sát quá trình chiết:
Xử lý cột (luyện cột) : lần lợt cho qua cột 3ml methanol, 3ml nớc, 5ml
methanol- nớc (50:50).
Khảo sát điều kiện chiết:
- Pha dung dịch mẫu: tiến hành pha một dung dịch chuẩn có công thức
cho mỗi 5 ml nh sau:
Vitamin B1 2 mg
Vitamin B2 1 mg

Vitamin B6 1 mg
Nicotinamid 5 mg
Vitamin A 1.000 UI
Vitamin D 1.000 UI
Cân chính xác khoảng 20mg B1, 10mg B2, 10mg B6, 10mg dầu Vitamin D
(1000.000 UI/g), 10mg dầu Vitamin A (1000.000 UI/g). Cho vào bình định
mức 50 ml, hoà tan bằng methanol tuyệt đối rồi thêm methanol đến vạch.
Hút 1ml dung dịch trên cho qua cột SPE đã đợc xử lý
- Pha dung dịch vitamin D chuẩn.
- Pha dung dịch vitamin A chuẩn
16
Khảo sát điều kiện rửa:
Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký. Vậy phải chọn
loại dung môi và thể tích dung môi phù hợp để rửa hết các vitamin tan trong
nớc (B1, B2, B6, PP) trong khi không rửa trôi vitamin D.
Trong mẫu có một lợng lớn các vitamin tan trong nớc gồm B1, B2, B6,
PP. Để rửa sạch các vitamin này ta lựa chọn nớc, sau đó là methanol-nớc.Tiến
hành khảo sát thể tích nớc và methanol- nớc để loại hết các vitamin tan trong
nớc mà không mất vitamin D:
Rửa cột bằng 10ml nớc tinh khiết chia làm 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2
ml. Hứng 5 phân đoạn này vào 5 cốc đánh số từ 1 đến 5, sau đó đem sắc ký.
Kết quả: các vitamin B1, B2, B6, PP đã đợc rửa sạch khỏi cột trong 4ml đầu
(cốc số 1 và 2-). Các vitamin A, D không bị rửa ra trong 10ml nớc. Kết quả đ-
ợc trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.1, 2.2, 2.3
Bảng 2.1: Kết quả rửa cột bằng nớc:
Ml nớc
thứ
Vitamin B1,
B2, B6, PP
Vitamin A Vitamin D

1-2 + - -
3-4 + - -
5-6 - - -
7-8 - - -
9-10 - - -
Tiếp theo rửa cột bằng 5ml hỗn hợp methanolnớc, chia làm 5 phân
đoạn, mỗi phân đoạn 1ml, hứng vào 5 cốc khác nhau, sau đó đem sắc ký ở
các bớc sóng cực đại của A và D. Kết quả: vitamin A và D không bị rửa ra
bằng 5ml methanol-nớc và không còn các vitamin tan trong nớc trên cột.
Bảng 2.2: Rửa cột bằng methanol- nớc
Thể tích methanol-nớc Vitamin A Vitamin D
5ml - -
Kết luận: Sau khi rửa bằng 10ml nớc và 5ml methanol-nớc, các vitamin
B1, B2, B6, PP đã bị rửa sạch, vitamin D không bị mất mát và vitamin A vẫn
còn trên cột.
-Khảo sát điều kiện rửa giải:
17
Trên cột còn vitamin A và D. Phải chọn đợc dung môi và thể tích thích
hợp để rửa giải đợc hết vitamin D mà không bị lẫn vitamin A trong đó. Chúng
tôi lần lợt khảo sát về thể tích rửa giải với methanol và acetonitril. Tiến hành
rửa giải với từng ml dung môi, hứng vào các cốc khác nhau, sau đó đem sắc
ký lần lợt ở hai bớc sóng 265nm (cực đại hấp thu của vitamin D) và 330nm
(cực đại hấp thu của vitamin A) để xác định thể tích rửa giải để rửa hết
vitamin D. Kết quả đợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Khảo sát điều kiện rửa giải .

Kết
luận:
Từ kết quả trên chúng tôi chọn methanol làm dung môi rửa giải và thể
tích dùng là 3 ml. Với 3 ml methanol, toàn bộ lợng vitamin D đã đợc rửa giải

trong khi đó vitamin A vẫn còn trong cột. Nh vậy chúng tôi đã chiết riêng đợc
vitamin D từ hỗn hợp ban đầu. Dịch rửa giải sẽ đợc cô cạn để làm giàu mẫu
nếu cần thiết.
Rửa sạch vitamin A để phục hồi cột: rửa cột bằng 5 ml n-hexan, sau đó
rửa liên tục bằng 10 ml methanol.
Tóm lại: Từ những số liệu trên, chúng tôi đa ra quy trình chiết cụ thể cho
mẫu chứa vitamin D và hỗn hợp các vitamin khác:
- Xử lý cột
- Cho mẫu qua cột
- Rửa cột bằng 10 ml nớc
- Rửa cột bằng 5 ml hỗn hợp methanol- nớc (50:50)
- Rửa giải bằng 3 ml methanol
- Rửa phục hồi cột bằng 5 ml n-hexan và 10 ml methanol
Mililit
thứ
Methanol Acetonitril
D A D A
1
2
3
4
5
6
L1 L2 L3 L1,2,3 L1 L2 L3 L1,2,3
+
+
+
-
-
-

+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-

+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
18
H×nh 2.1. S¾c ký ®å mÉu syro Patarvit cha qua chiÕt
H×nh 2.2. S¾c ký ®å mÉu röa b»ng 2 ml methanol-níc ®Çu
19
H
×nh 2.3. S¾c ký ®å mÉu röa b»ng 2 ml methanol-níc thø n¨m
H×nh 2.4: S¾c ký ®å mÉu chuÈn vitamin D (100 UI.ml), Cét C18 (250 mm x
4 mm, 10
µ
m), tèc ®é 1,5 ml/phót
20
Hình 2.5: Sắc ký đồ mẫu thử vitamin D (100 UI.ml), Cột C18 (250 mm x 4
mm, 10
à
m), tốc độ 1,5 ml/phút
2.2.2. Khảo sát hiệu suất chiết:
- Pha dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10 mg dầu vitamin D
(1.000.000 UI/g) tơng ứng với 10.000 UI, cho vào bình định mức 50.0 ml, hoà

tan bằng methanol tuyệt đối đến vừa đủ thể tích. Hút chính xác 5ml cho vào
bình định mức 10ml rồi thêm methanol vừa đến vạch. Ta có dung dịch chuẩn
với nồng độ vitamin D: 100 UI/ml
- Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn cho qua cột SPE đã đợc chuẩn bị
rồi chiết theo quy trình đã đa ra ở trên ta đợc 3 ml dịch rửa giải. Cô cạn dung
môi bằng khí nitơ ở 40-60 C
o
. Hoà tan cắn trong 1 ml methanol ta đợc mẫu
thử.
Đem cả mẫu chuẩn và mẫu thử tiêm sắc ký. Hiệu xuất chiết đợc tính dựa
vào diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử. Làm 3 lần nh trên rồi lấy kết quả
trung bình.
Bảng 2.6: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết.
Mẫu chuẩn Mẫu thử
Lần Diện tích pic Hiệu suất
21
Nồng độ: 100 UI/ml
Diện tích pic: 135,15
1
2
3
132,1
131,4
129,8
97,7%
97,0%
96,8%
TB 97,2%
2.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký
- Viamin D là chất không phân cực, qua tham khảo một số tài liệu chúng

tôi chọn kiểu sắc ký pha đảo.
- Lựa chọn pha động: qua tham khảo tài liệu và bằng thực nghiệm chúng
tôi lựa chọn pha động là methanol- ethyl acetat- nớc tỷ lệ (90: 7: 3).
- Lựa chọn cột : trong các loại cột pha đảo, chúng tôi chọn cột C18-loại
cột dùng phổ biến ở nớc ta.
- Lựa chọn bớc sóng: chúng tôi lựa chọn bớc sóng 265 nm là cực đại hấp
thu của vitamin D.
- Lựa chọn tốc độ dòng: qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng:
1,5 ml/phút là phù hợp nhất để thu đợc pic có thời gian lu vừa phải
Tóm lại:
Sau quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn đợc các điều kiện sắc
ký để định lợng vitamin D nh sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 5 và 10àm)
- Detector UV đặt ở bớc sóng 265 nm.
- Pha động: methanol- ethyl acetat- nớc (90: 7: 3).
- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút.
- Thể tích mẫu tiêm: 20àm.
- Nhiệt độ phòng.
2.2.4. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách sử dụng dung dịch
chuẩn, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc
ký dựa trên các giá trị sai số tơng đối về thời gian lu, diện tích pic, số đĩa lý
thuyết và độ cân xứng của píc.
- Pha dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg dầu vitamin D
(1.000.000 UI/g) cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol vừa
đến vạch. Hút chính xác 5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 10 ml rồi
22
thêm methanol đến vạch. Ta đợc dung dịch chuẩn có nồng độ 100 UI/ml. Lọc
qua màng lọc 0,45 àm.

Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên trong điều kiện
đã chọn, ghi lại các giá trị về thời gian lu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số
đối xứng.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống đợc trình bày trong các
bảng 2.5, 2.6, 2.7.
Bảng 2.5: Giá trị trung bình của một số đại lợng đặc trng
Số đĩa lý thuyết Hệ số cân xứng
2870 0,81
23
Bảng 2.6: Giá trị thời gian lu của vitamin D
Lần tiêm Thời gian lu
(phút)
Số liệu thống kê
1 4,873
x
= 4,802
S
= 0,027
%
= 0,39%
n=6
=0,05
2 4,864
3 4,798
4 4,832
5 4,784
6 4,855

Bảng 2.7: Diện tích pic của vitamin D
Lần tiêm Diện tích pic Số liệu thống kê

1
2
3
4
5
6
135,6
137,1
136,8
135,8
136,0
137,2
x
= 136,417
S
= 0,699
%
= 0,53%
n=6
=0,05
Nhận xét: Từ kết quả cho thấy:
- Sai số tơng đối của giá trị thời gian lu và diện tích pic rất nhỏ. Giá trị
các đại lợng đặc trng nh số đĩa lý thuyết, hệ số cân xứng đều trong giới hạn
cho phép. Điều đó chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao.
2.2.5. Khảo sát độ tuyến tính của phơng pháp.
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với
diện tích pic của vitamin D trên chuẩn vitamin D. Pha một dãy các dung dịch
chuẩn vitamin D có nồng độ biến thiên từ: 40-240 UI/ml
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1g dầu vitamin D (1000.000 UI/g)
cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol đến vạch ta đợc dung

dịch chuẩn gốc nồng độ 2000 UI/ml.
Từ dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng methanol để đợc các dung
dịch chuẩn có nồng độ vitamin D từ 40-240 UI/ml
24
Tiến hành chạy sắc ký lần lợt các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký
đã chọn ở trên. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin D đợc trình bày ở
bảng 2.8
Bảng 2.8:Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của vitamin D
Nồng độ vitamin D
(UI/ml)
Diện tích pic
Khoảng nồng độ khảo sát:
40 240 UI
Phơng trình hồi quy:
y = 1,359x - 0.8982
Hệ số tơng quan: r = 0.9996
40
80
120
160
240
52,8
108,7
162,2
216,5
325,1
Hình 2.6: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích píc của vitamin D
- Nhận xét:

Trong khoảng biến thiên nồng độ từ 40-240 UI/ml, diện tích pic thu đợc
trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ vitamin D với hệ số tơng quan rất gần 1
(0,9996) chứng tỏ sự tơng quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện
tích pic
2.2.5. Định lợng vitamin D trong syro Patarvit.
Mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1000.000 UI/g) cho vào
bình định mức 50 ml. Hoà tan bằng methanol vừa đến vạch. Hút chính xác 5
25