kết quả thủy phân protein với xúc tác acid

30

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già
xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô. Kết
quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau.
Loại quả
Khối lượng
quả (g)
Khối lượng nhựa
lấy (g)
Tỉ lệ nhựa
thô trên
quả (%)
Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21
Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26
Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18
Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non
và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tôi
nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100
ngày tuổi.
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI
Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50
o
C bằng các phương
pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khô nhựa đu đủ
Phương pháp làm khô Hình thức cảm quan
Phơi nắng 1-2 nắng Vón cục,vàng nâu
Sấy nóng, có quạt gió 24 giờ Vón cục, vàng nhạt
Đông khô chân không 8 giờ Vẩy mỏng, óng ánh và trắng sáng
Nhận xét:
Chất lượng papain thô thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác
nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm
chất lượng càng kém.
31

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để làm khô nhựa tươi nhưng phương
pháp đông khô chân không là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất
lượng nhựa. Do đó, toàn bộ nhựa tươi được đông khô chân không để loại nước và
nhựa sau đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp
theo.
Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tôi tiến hành đông khô trong 8 giờ và
thu được 5 gam chế phẩm đông khô.
3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ
Nhựa tươi sau khi đã đông khô chân không, chúng tôi tiến hành sơ chế bằng
dung môi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ
chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di
của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:


Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung
môi etanol

32

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


1 – thang protein chuẩn
2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol
Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do
đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch
protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của
nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy
nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hoàn toàn phù hợp với các
nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành
trong giai đoạn trưởng thành của trái.
Tinh chế:
Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày
trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain.
Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b:


Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ
nhựa đu đủ đông khô.
1- Thang protein chuẩn
2- Chế phẩm Merck
3 - papain
33

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 750nm của các ống nghiệm có
nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1)
Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bƣớc sóng 750nm
Mẫu 01 02 03 04 05
Nồng độ Albumin
(mg/ml)
50 100 150 200 250
Độ hấp thu quang OD
(AU)
0.0432 0.0648 0.1192 0.135 0.1942
Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD
(AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường
chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004

Hình 3.2. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang
vào nồng độ albumin.
Cách tính
Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa
mẫu protein. Từ đó suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml)
Hàm lượng protein M (có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức):
34

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


m
nx
M
*001.0*


(mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 720nm của các ống nghiệm có
lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2)
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sóng 720nm
Mẫu 02 03 04 05 06
Lượng tyrosin tương ứng (M)
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Độ hấp thu quang OD(AU)
0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ
đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu
quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y =
0.4454x + 0.016.
Đường chuẩn Anson
y = 0.4454x + 0.016
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45

0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Lượng Tyrosin (mM)
Mật độ quang (AU)

Hình 3.3. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang
vào nồng độ tyrosin.
35

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Cách tính
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong
điều kiện chuẩn (35.5
o
C, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản
phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở
bước sóng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn.
Hñ P
=
Tyrosin*V*L
t*m*v
(UI)

với
Hđ P: hoạt tính protein (UI)
V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml).
v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng mẫu enzyme.
M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ.
Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein
thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định
mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp
Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:
Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường
chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x –
0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x. Sau đó, áp
dụng công thức

m
nx
M
*001.0*

(mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
36

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g).
Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác

nhau.
247.71
199.14
184.86
179.14
174.86
162.00
0
50
100
150
200
250
300
pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh
Các giai đoạn tinh chế
Lượng protein (mg/g)

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lƣợng protein sau mỗi giai
đoạn tinh chế.
Nhận xét:
Từ bảng số liệu và biểu đồ trên ta nhận thấy rằng, trong quá trình tinh chế
enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hàm lượng protein trong mẫu giảm dần.
Điều này có thể được giải thích như sau: lượng protein ban đầu cao là do trong nhựa
khô chưa tinh chế ngoài papain còn có nhiều protein khác, sau mỗi giai đoạn tinh
chế thì protein tạp được loại bỏ dần làm cho hàm lượng protein cũng giảm theo.
Các phân đoạn ∆OD M (mg/g) Phụ lục
Phân đoạn pH 5.7 0.173
247.71 3
Phân đoạn pH 9.0 0.139

199.14 4
Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129
184.86 5
Phân đoạn bằng NaCl 0.125
179.14 6
Phân đoạn kết tinh 0.123
174.86 7
Phân đoạn tái kết tinh 0.113
162.00 8
37

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH
CHẾ
Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được
sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính
protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:
Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung
dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng
và các dung dịch khác như sau
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5
o
C

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc
từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc
mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sóng 720nm từ đó dựa vào đồ thị
chuẩn để suy ra được M Tyrosin.
Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson. Kết quả được
trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau:
Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt
tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin. Từ giá
trị của x ta tính được hoạt tính protease theo công thức:
Hñ P
=
Tyrosin*V*L
t*m*v
(UI)

với
38

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Hđ P: hoạt tính protein (UI)
V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml).
v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng mẫu enzyme.

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế
Các phân đoạn ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)
Tỉ lệ hoạt
tính sau mỗi
giai đoạn
tinh chế (%)
Phụ lục
Nhựa khô ban đầu 0.308 0.012 70.353 9
Phân đoạn pH 5.7 0.264 0.063 66.46 94.47 10
Phân đoạn pH 9.0 0.150 0.035 57.39 81.57 11
Phân đoạn tủa với ammonium
sulfat
0.372
0.185
49.30 70.08 12
Phân đoạn bằng NaCl 0.240 0.074 45.60 64.81 13
Phân đoạn kết tinh 0.115 0.055 36.36 51.68 14
Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15
39

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


66.46
57.39
49.30
45.60
36.36
36.78

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh
Các giai đoạn tinh chế
Hoạt tính protease (UI)
Series1

Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn
tinh chế.
Qua bảng số liệu và đồ thị, ta nhận thấy rằng trong quá trình tinh chế enzyme
bằng phương pháp tủa muối thì hoạt tính protein trong mẫu giảm dần. Nguyên nhân
có thể là do ban đầu nhựa khô ngoài chứa enzyme papain ra còn chứa những
enzyme khác có chức năng bảo vệ papain nên hoạt tính cao, sau khi qua những giai
đoạn tinh chế tiếp theo đã loại bỏ hầu hết những protein tạp chỉ còn lại papain tinh
khiết nên dẫn đến hoạt tính protein cũng giảm theo. Sau phân đoạn kết tinh, sản
phẩm đem đi kết tinh lại thì độ tinh sạch của sản phẩm cao hơn dẫn đến hoạt tính
protein tăng lên đôi chút.
3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ
PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN
Nhằm đánh giá tính ổn định của mỗi chế phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát
sự biến đổi hàm lượng protein của mỗi chế phẩm theo thời gian.
Cân chính xác 0.10 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác

nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch
định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Các chế phẩm này được
bảo quản ở 4
o
C để dùng dần. Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành
xác định lượng protein cho mỗi lần thí nghiệm Thời gian tiến hành thí nghiệm là 5
ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 (phụ lục 16 -19):
40

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian
Ngày
∆OD Hàm lượng protein (mg/g)
M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3
1 0.155 0.112 0.115 0.110
222.00 160.57 164.86 157.71
2 0.136 0.141 0.101 0.109
199.14 202.00 144.86 156.29
3 0.142 0.124 0.162 0.131
203.43 177.71 232.00 187.71
4 0.135 0.116 0.133 0.122
193.43 166.29 190.57 174.86
5 0.125 0.106 0.133 0.116
179.14 147.71 190.57 169.14

100
130
160

190
220
250
1 2 3 4 5
Ngày khảo sát
Lượng protein (mg/g)
M0
M1
M2
M3

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng protein theo
thời gian
Trong đó:
M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô
M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau
khi đông khô.
M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông
khô.
41

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau
khi đông khô.
Nhận xét:
Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm
hầu như không thay đổi nhiều theo thời gian chúng tôi khảo sát. Chế phẩm M0 có
hàm lượng protein cao nhất còn M1 có hàm lượng protein nhỏ nhất. Như vậy

phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu
nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các
phương pháp. Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm
M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất. Còn
hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có
trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm
lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1.
3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO
THỜI GIAN.
Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát
sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian.
Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau
khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức,
sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Chế phẩm được bảo quản ở 4
o
C để
dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày.
Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease
theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể
hiện trong bảng 3.8:







42

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian


Ngày
∆OD P(UI/ml)
M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3
1
0.296
0.212 0.144 0.116
70.353 49.286 32.187 25.146
2
0.197
0.158 0.192 0.124
65.081 51.010 63.224 38.797
3
0.125
0.107 0.081 0.080
54.728 45.766 32.690 32.187
4
0.265
0.071 0.064 0.087
44.702 9.879 8.621 12.753
5
0.264
0.059 0.044 0.033
26.749 4.634 3.018 1.832
Kết quả này được biểu diễn bằng đồ thị như hình 3.7

0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5
Thời gian (ngày)
Hoạt tính (UI/ml)
M0
M1
M2
M3

Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian
Trong đó:
M
0
: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô
M
1
: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau
khi đông khô.
M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông
khô.
M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau
khi đông khô.

43

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Nhận xét:
Nhựa đu đủ là hỗn hợp các protease có tính thủy phân mạnh, trong đó papain
là một trong những enzyme có hoạt tính mạnh và chiếm hàm lượng cao nhất, thủy
phân protein tới oligopeptide. Papain ở dạng tự nhiên, nhóm –SH tự do bị bao vây,
có tính ổn định cao hơn papain dạng hoạt động trong dung dịch.
Không chỉ là proteza có tính chất đặc hiệu cơ chất rộng, papain còn có khả
năng tự thủy phân do một phân tử papain xúc tác cho sự thủy phân một phân tử
khác. Do trong thời gian tiến hành thí nghiệm, dung dich enzyme chịu ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố khách quan như chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố oxy trong không khí
và sự tự thủy phân của papain, nên hoạt tính của các chế phẩm sẽ giảm dần theo
thời gian.
Theo kết quả ở bảng, hoạt tính của các chế phẩm giảm dần mỗi ngày. Sạu 5
ngày chúng tôi khảo sát thì hoạt tính của các chế phẩm giảm đi rất nhiều so với
ngày đầu tiên (M0 còn 47.91%, M1: 9.4%, M2: 9.37 %, M3:7.29 %). Chế phẩm M0
giữ hoạt tính tốt hơn là do trong nhựa đu đủ còn có một số chất khác đã góp phần
bảo vệ papain. Các phương pháp kết tủa thu nhận papain đã loại bỏ một số chất có
trong nhựa nên độ bền của những chế phẩm còn lại kém hơn so với M0.
Trên hình biểu diễn sự biến động hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian
đã cho chúng ta thấy rằng hoạt tính của chế phẩm M1 có hoạt tính cao hơn hẳn các
chế phẩm khác. Lý do có thể là do phương pháp tủa muối không có ảnh hưởng đến
hoạt tính enzyme, phương pháp này chỉ loại đi nhiều proteaza tạp, còn lại phần lớn
là papain. Cồn và aceton cũng là một dung môi hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kết
tủa proteaza nhưng phương pháp này có nhược điểm làm giảm hoat tính proteolytic,
nhiều khi dẫn đến mất hoạt tính hoàn toàn.
Từ những số liệu thực nghiệm cho ta có thể đánh giá rằng chế phẩm papain

được tách bằng muối có hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung
môi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động.

44

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PAPAIN.
3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH
Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5
đến 9.0. Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu
quang ở bước sóng 720nm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20)
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH
pH ∆OD1 ∆OD2 ∆OD P(UI/ml)
7.0 0.355 0.087 O.268 72.34
7.5 0.295 0.030 0.265 71.65
8.0 0.232 0.067 0.228 60.80
8.5 0.275 0.064 0.211 56.01
9.0 0.271 0.072 0.200 52.77

50.00
55.00
60.00
65.00
70.00
75.00
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
pH

Hoạt tính P (UI/ml)

Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi
theo pH
Nhận xét:
45

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Khi tăng dần giá trị pH lên thì đồng thời hoạt tính protein cũng tăng lên sau
đó giảm xuống rất nhanh, đều này chứng tỏ rằng pH đóng một vai trò rất quan trọng
cho sự tồn tại của enzyme trong môi trường do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa
của các enzyme và phần nào quyết định dạng tồn tại và hoạt tính của chúng. Và khi
pH = 7 – 7.5 thì hoạt tính protein trong nhựa khô đạt giá trị cao nhất so với các giá
trị còn lại.
3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ
Cân 0.0224 g nhựa khô hòa tan trong 100ml nước cất. Sau đó tiến hành thí
nghiệm xác định hoạt tính protein trong nhựa khô theo phương pháp Anson ở các
khoảng nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ t = 40
O
C đến 90
o
C (với ∆t = 5
O
C), pH dung
dịch đệm được giữ cố định ở pH = 7.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10:
Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi
theo nhiệt độ
t

O
C ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)
45
0.1053 0.0646 17.728
50
0.1108 0.0652 21.276
55
0.1619 0.0559 25.844
60
0.2731 0.0659 54.957
65
0.2525 0.0718 59.178
70
0.4136 0.0702 70.560
75
0.1678 0.0415 23.758
80
0.1993 0.0532 28.059
85
0.1697 0.0559 21.075
90
0.1366 0.0486 15.524

46

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


0
10

20
30
40
50
60
70
80
45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
Nhiệt độ (
o
C)
Hoạt tính P (UI/ml)

Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ
Nhận xét:
Khi nhiệt độ thay đổi thì hoạt tính cũng thay đổi đáng kể theo nhiệt độ, tăng
dần khi nhiệt độ tăng và đạt giá trị cực đại khi lên tới 70
O
C và sau đó lại giảm dần.
Nguyên nhân có thể là do khi ta tăng nhiệt độ thì các protein trong nhựa khô
sẽ thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của chúng chuyển từ dạng bất hoạt hay ở dạng có
hoạt tính kém do quá trình phân hủy hay oxy hóa thành dạng hoạt hóa nên dẫn đến
hoạt tính tăng cao, nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao thì nó lại chuyển thành dạng bất
hoạt có khi bất hoạt hoàn toàn do cấu trúc tâm hoạt động đã bị thay đổi.
Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy rằng: hoạt tính của enzyme
papain sau các giai đoạn tinh chế giảm dần đồng thời với lượng protein cũng giảm
dần. Do đó, chúng tôi sử dụng nhựa đu đủ đã đông khô để làm xúc tác cho phản ứng
thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng mà không tiến hành tinh chế.
3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO
THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN.

Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện
nhiệt độ phản ứng là 70
O
C và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác
khác nhau. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng,
thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc. Hút
47

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


10ml dịch lọc đem xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen. Kết quả được
trình bày trong bảng 3.11 – 3.13:
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
0.25% so với cơ chất.
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
0.50% so với cơ chất.
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
1.00% so với cơ chất.
Sự biến thiên hàm lượng đạm formol ở các hàm lượng xúc tác khác nhau
được biểu diễn qua đồ thị hình 3.10

Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Hàm lượng đạm
formol trung bình của
dịch thủy phân (g/l)
1.1 1.4 1.8 2.0 2.2 2.4 2.5 2.9 3.1 3.4 3.5 3.6 3.6
Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Hàm lượng đạm
formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)
1.9 2.9 3.2 3.5 3.8 4.1 4.2 4.6 4.9 6.1 7.2 8.6 8.6
Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Hàm lượng đạm
formol trung bình của
dịch thủy phân (g/l)
1.4 2.8 3.5 4.9 6.3 7.0 7.7 8.3 8.4 8.8 9.1 9.2 9.2
48

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Thời gian phản ứng (giờ)
Hàm lƣợng đạm formol (g/l)
Nổng độ xúc tác 0.25%
Nồng độ xúc tác 0.50%
Nồng độ xúc tác 1.00%

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng đạm formol
theo thời gian phản ứng.
Bảng 3.14: Biến thiên hàm lƣợng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác
nhau






Nhận xét:
Hàm lượng đạm amin = hàm lượng đạm formol – hàm lượng đạm amoniac.
Qua kết quả khảo sát trên, hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân dao
động từ 0.06 – 0.07g/l. Như vậy hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân rất
thấp so với các chỉ tiêu cho phép của nước chấm và xem như không đáng kể. Do đó
trong các khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme so với cơ chất cũng như các điều
Nồng độ enzyme (%) 0.25 0.50 1.00
Hàm lượng đạm
amoniac trung bình
của dịch thủy phân
(g/l)
0.06 0.07 0.07
49

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


kiện ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân chúng tôi không xét đến hàm lượng đạm
amoniac của dịch thủy phân.

Sau 24 giờ phản ứng, hàm lượng đạm formol đạt tối đa là 9.2 và nếu cứ tiếp
tục phản ứng thủy phân thì hàm lượng đạm formol không tăng lên nữa điều này
chứng tỏ phản ứng đã kết thúc. Do đó chúng tôi đã ngưng tất cả các phản ứng khảo
sát sau 24 giờ.
3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI
XÚC TÁC PAPAIN THÔ.
Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu
đậu phộng sau khi đã loại béo với tỉ lệ bánh dầu đậu phộng và đệm phosphate là
1:10. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ của xúc tác đến phản ứng
thủy phân theo thời gian.
Hàm lượng protein trong đậu phộng (bao gồm cả protein tan và không tan)
được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng xác định bằng phương pháp Kjeldalh.
Kết quả thu được như sau:
V = 17.5 (ml)
P (hàm lượng protein ban đầu) = hàm lượng Nitơ tổng * 5.91
= 17.5*5.91*1.4 = 145.4 (mg/g)
Hàm lượng protein trong 5g mẫu cho phản ứng
M
đậu phộng
= 145.4*5 = 725.2 (mg/g)
Hàm lượng protein tan có trong nhựa đu đủ đông khô được xác định theo
phương pháp Lowry là:
M = ((0.4545 + 0.0004)/0.0007) = 649.85 (mg/g).
Hàm lượng protein tan có trong mẫu đậu phộng được xác định theo phương
pháp Lowry là:
M = ((0.2525 + 0.0004)/0.0007) = 361.25 (mg/g)
Chúng tôi đã tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu
phộng ở những điều kiện khác nhau và thu được các kết quả như sau: