Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây kim thất lá tô mách

17

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM




Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Thuốc thử Folin – Merck, Đức.
Tyrosin – Merck, Đức.
Casein – Merck, Đức.
Albumin – Merck, Đức.
Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất
thành 100ml.
Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M: cân chính xác 5.9690g Na
2
HPO
4
.12H
2
O hòa tan
trong nước cất và định mức cho đủ 250ml.
Dung dịch KH
2

PO
4
1/15M: cân chính xác 0.9072g KH
2
PO
4
hòa tan trong
nước cất và định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch
Na
2
HPO
4
1/15M và 23ml dung dịch KH
2
PO
4
1/15M.
Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm
Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml.
Dung dịch NaOH 0.5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml.
Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml.
Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch
HCl 0.2N vừa đủ 500ml.
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml
dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml.
Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu.
18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu.
2.1.2. Thiết bị
Máy quang phổ UV Aglient 8453.
Máy đông khô chân không Christ, Alpha 1- 2 Ldplus
Cùng các thiết bị khác của phòng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia
nhiệt...
2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái
[3, 8, 11, 16, 10, 20]
Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0.3-1 kg
là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa
không sánh sệt, hoạt tính enzyme không cao. Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho
ít nhựa. Để thu enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần
tuổi.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn có độ
ẩm không khí cao). Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc rất khó
thu nhận.
Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao
Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp
Tiến hành
Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây
Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính
quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm, nếu không dịch
nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu
được).
Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút,
sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh không

cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để bảo đảm hoạt tính của papain có trong
nhựa.
19

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh không cho chất bẩn hoặc côn trùng
lẫn vào.
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng nhựa.

Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ
Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày. Lần đầu
tiên có thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa
những đường rạch trước đó.
Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào
da vì dễ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm
từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme.
Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ.
Nhựa tươi không bền vì thế nên đông khô chân không ngay sau khi thu nhận,
nhựa đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu.
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết
[8, 18, 23, 28, 40, 42, 44]
Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain
còn có một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp
chất khác. Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả
thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa,
tạp lớn.
20

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong
cối ở nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g
cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng
để đưa pH dịch chiết tới 5.7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp
nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine. Sau
đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml. Dịch huyền
phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian
lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước
lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước còn lại của quá trình
tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.
[25, 27, 28]
2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9.
Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và
khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có
thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút. Dịch trích ở giai
đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate
Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly
tâm ở 4000rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain.
Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hòa.
2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl
Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo
thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để
thu tủa, bỏ dịch lỏng.
2.2.2.4 Kết tinh
Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở
pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh

lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể
tạo thành, sau đó duy trì ở 4
o
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ
để thu nhận tinh thể.
21

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


2.2.2.5 Tái kết tinh
Hòa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch
có nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời
khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể
tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch
huyền phù được giữ ở 4
o
C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của
enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
2.2.2.6 Đông khô chân không.
Tủa protein thu được đem đông khô chân không để loại bỏ nước. Protein sau
khi đông khô chân không được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu
tiếp theo.
Qui trình thu nhận papain tinh khiết có thể được tóm tắt lại theo sơ đồ
2.2

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô