Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam

Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -17- CBHD: TS. Trần Lê Quan
3. NGHIÊN CỨU
3.1 Giới thiệu chung
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của
phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam, được thu hái ở vùng núi Phanxipang (thuộc
dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006 do công ty TNHH Tuệ Linh (Cầu
Giấy, Hà Nội) cung cấp, đã được nhận danh bởi GS.NGND Vũ Văn Chuyên. Mẫu
cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp đun hoàn
lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô. Cao metanol đem hòa tan vào
nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, n-
butanol thu được các cao tương ứng.
Trên cao butanol, thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường với
nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau chúng tôi đã cô lập được sáu hợp chất,
ký hiệu BM1, BM2, BM3, BM4, BM5, BM6.
3.2 Biện luận và kết quả
Bằng các phương pháp phổ nghiệm như
1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT-NMR,
COSY, NOESY, HSQC, HMBC, và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS, cấu trúc
các hợp chất đã được xác định là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (ombuosid, BM1), 7,4′-
dimetylkaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (BM2),
7,4′-dimetylquercetin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][α-L-
rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (BM3), (20S)-3β,20,21-trihydroxy-3-
O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→3)]-α-L-

arabinopyranosyldammar-24-en-21-O-β-D-glucopyranosid (BM4), (20S)-
3β,20,21,25-tetrahydroxy-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-
glucopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosyldammaran-21-O-β-D-glucopyranosid
(BM5) và (20S)-3β,20,21ξ,23ξ,25-pentahydroxy-21,24ξ-cyclodammaran-3-O-[α-
L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosid


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -18- CBHD: TS. Trần Lê Quan
(BM6). Trong đó, BM4 là chất lần đầu tiên cô lập được từ cây giảo cổ lam. Riêng
BM2, BM3, BM5 và BM6 là bốn chất mới lần đầu tiên được công bố trên thế giới.
Các hợp chất BM1-3 đã được thử nghiệm độc tính tế bào đối với một số tế bào ung
thư như ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi NCI-H460.
3.2.1 Hợp chất BM1

Hợp chất BM1 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung
môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước
(8:2:0.2) cho vết tròn có R
f
0.3, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng
xuất hiện vết tròn màu vàng cam.
Phổ
1
H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δ
H

7.73 (1H, dd, J 1.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δ
H
7.05 (1H, d, J

8.5, H-5′) và δ
H
7.53 (1H , d, J 1.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các
proton ở δ
H
6.37 (1H, d, J 1.5, H-6) và δ
H
6.68 (1H, d, J 1.5, H-8), cho thấy BM1 có
hai vòng thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế.
Ngoài ra còn có sự hiện diện của hai nhóm -OCH
3
ở δ
H
3.86 (6H, s) và một nhóm -
OH kiềm nối ở δ
H
12.54 (1H, s), các mũi cộng hưởng của hai proton anomer ở δ
H

4.39 (1H, br.s, H-1′″), δ
H
5.40 (1H, d, J 7, H-1″) và sự hiện diện nhóm metyl của
một đơn vị đường deoxymannose ở δ
H
0.98 (3H, d, J 6, H
3
-6′″).
Phổ
13
C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của

29 carbon, trong đó có mười carbon tứ cấp, 15 carbon metin, một carbon metylen và
ba carbon metyl. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon
carbonyl ở δ
C
177.5 (C-4), 14 carbon vòng thơm và 14 carbon sp
3
. Vậy BM1 là một
flavonoid glycosid có hai đơn vị đường và hai nhóm thế -OCH
3
.
Trên phổ HMBC, proton ở δ
H
6.37 (H-6) và δ
H
6.68 (H-8) ghép cặp
meta với nhau và đều cho tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn oxygen ở δ
C



Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -19- CBHD: TS. Trần Lê Quan
165.1 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δ
C
105.0
nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10. Hai proton này cũng lần lượt cho tương
quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δ
C
156.4 và 160.9 nên hai carbon này

lần lượt là C-9 và C-5.
Proton ở δ
H
7.54 (H-2′) và δ
H
7.73 (H-6′) đều cho tương quan với
carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δ
C
122.4 và hai carbon vòng thơm
gắn oxygen ở δ
C
156.7 và δ
C
150.1; đồng thời proton ở δ
H
7.04 (H-5′) cho tương
quan với carbon ở δ
C
150.1 mà không cho tương quan với carbon ở δ
C
156.7 nên ba
carbon này lần lượt phải là C-1′ (122.4), C-2 (156.7) và C-4′ (150.1). Bên cạnh đó,
tương quan HMBC giữa H-2′ và H-5′ với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δ
C
145.9 khẳng định đây chính là C-3′.

Đặc biệt, tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δ
H
3.86 (6H, s) cho
tương quan HMBC lần lượt với C-7 và C-4′ cho thấy hai nhóm -OCH

3
lần lượt gắn
trên các vị trí này.
Sử dụng phổ COSY, HSQC cho phép xác định hai đơn vị đường
chính là β-D-glucose và α-L-rhamnose. Ngoài ra, phổ HMBC có các tín hiệu cộng
hưởng cho thấy có sự tương quan của H-1″ ở δ
H
5.4 (d, J 7.0) với C-3 (δ
C
133.8), H-
1′″ ở δ
H
4.39 (s) tương quan với C-6″ (δ
C
66.9). Như vậy đường D-glucose sẽ gắn
trên khung flavonol tại vị trí C-3 và đường L-rhamnose sẽ gắn trên đường glucose
tại vị trí C-6″


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -20- CBHD: TS. Trần Lê Quan
O
OCH
3
OOH
H
3
CO
O

OH
HO
O
O
O
HO
HO
OH
OH
OH
H
H
1'''
6''
1''
3
H
H
H
H
H
2
1'
2'
3'
4'
5'
6'
9
10

5
6
7
8
Töông quan HMBC

Từ những dữ liệu trên kết luận BM1 là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[α-
L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid, còn có tên gọi khác là ombuosid,
một dẫn xuất dimetylrutin của rutin. Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây
giảo cổ lam
[6], [25]


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -21- CBHD: TS. Trần Lê Quan
Bảng 1: Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR và HMBC của hợp chất BM1
Vị trí Loại C
δ
H
δ
C

Tương quan HMBC
(
1

H →
13
C)
2 =C(OR)- 156.7
3 =C(OR)- 133.8
4 >C=O 177.5
5 =C(OH)- 160.9
6 =CH- 6.37 (d, J 1.5) 97.9 C-5, C-7, C-8, C-10
7 =C(OR)- 165.1
8 =CH- 6.68 (d, J 1.5 ) 92.2 C-7, C-9, C-6, C-10
9 =C(OR)- 156.4
10 >C= 105.0
1′
>C= 122.4
2′
=CH- 7.54 (d, J 1.5) 115.8
C-3′, C-2, C-4′, C-6′
3′
=C(OH)- 145.9
C-2′, C-4′, C-1′, C-5′
4′
=C(OR)- 150.1
5′
=CH- 7.04 (d, J 8.5 ) 111.3
C-4′, C-6′, C-1′, C-3′
6′
=CH- 7.73 (dd, J 1.5; 8.5) 121.5
C-5′, C-2, C-2′, C-4′
7-OCH
3

3.86 (s) *56.1 C-7
4′-OCH
3

3.86 (s) *55.6
C-4′
5-OH 12.54 (s)
Glu
1″ >CH(OR)(OR′)
5.40 (d, J 7.0) 101.2 C-3
2″
>CH(OH)- 3.23 (m) 74.0
3″
>CH(OH)- 3.24 (m) 76.4
4″
>CH(OH)- 3.09 (m) 69.8
5″
>CH(OR)- 3.25 (m) 75.8
6″
–CH
2
-OR
3.71 (d, J 11.0);
3.33 (m)
66.9
Rha
1′″
>CH(OR)(OR′)
4.39 (s) 100.7
C-6″

2′″
>CH(OH)- 3.41 (br.s) 70.6
3′″
>CH(OH)- 3.33 (m) 70.4
4′″
>CH(OH)- 3.06 (m) 71.8
5′″
>CH(OR)- 3.27 (m) 68.2
6′″
–CH
3
0.97 (d, J 6.0) 17.7
* Hai tín hiệu có thể hoán đổi cho nhau


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -22- CBHD: TS. Trần Lê Quan
3.2.2 Hợp chất BM2
Hợp chất BM2 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung
môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước
(8:2:0.2) cho vết tròn có R
f
0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng
xuất hiện vết tròn màu vàng cam.
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả
phân tử [M+H]
+
ở m/z 623.1970 (lý thuyết 623.1976) cho thấy BM3 có CTPT
C

29
H
34
O
15
.
Phổ của BM2 cho thấy có nhiều điểm tương tự phổ của BM1. Phổ
13
C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cũng cho các mũi cộng hưởng với sự hiện diện
của 29 carbon với 15 tín hiệu của khung flavonol, hai tín hiệu nhóm thế metyl gắn
với oxygen ở δ
C
55.1 và δ
C
55.4, hai tín hiệu carbon metin gắn với oxygen vùng
trường thấp ở δ
C
100.8 và δ
C
101.3, chín tín hiệu carbon metin của các đơn vị đường
và với sự hiện diện nhóm metyl của đường α-L-rhamnose ở δ
C
17.7 chứng tỏ BM2
là một flavonol glycosid có hai đơn vị đường L-rhamnose và D-glucose với hai
nhóm thế -OCH
3
tương tự như BM1.
Phổ
1
H-NMR cho các mũi cộng hưởng của hai proton hương phương

ở δ
H
8.12 (2H, d, J 8.5, H-2′ và H-6′) ghép cặp ortho với hai proton ở δ
H
7.07 (2H,
d, J 9.0, H-3′ và H-5′); và proton ở δ
H
6.39 (1H, d, J 2.0, H-6) ghép cặp meta với
proton ở δ
H
6.72 (1H, d, J 2.0, H-8) cho thấy BM2 có vòng thơm A mang bốn nhóm
thế và vòng thơm B mang hai nhóm thế. Phổ proton xác nhận sự hiện diện của hai
nhóm -OCH
3
ở δ
H
3.86 (6H, s), một nhóm -OH kiềm nối ở δ
H
12.50 (1H, s), hai
proton anomer ở δ
H
4.39 (1H, br.s, H-1′″), δ
H
5.37 (1H, d, J 7.5, H-1″) và sự hiện
diện nhóm metyl của đường α-L-rhamnose ở δ
H
0.97 (3H, d, J 6, H
3
-6′″). Những dữ
liệu này cho thấy aglycon của BM2 có cấu trúc kaempferol.

Phổ HMBC cho thấy có sự tương quan của H-1″ ở δ
H
5.37 (d, J 7.5)
với C-3 (δ
C
133.8), H-1′″ ở δ
H
4.39 (s) tương quan với C-6″ (δ
C
66.8) xác nhận đơn
vị đường D-glucose gắn với C-3 của aglycon và đơn vị đường L-rhamnose gắn với


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -23- CBHD: TS. Trần Lê Quan
đường D-glucose ở vị trí C-6″. Tương quan HMBC giữa proton của -OH kiềm nối
với δ
C
160.9 khẳng định đây là C-5. Đồng thời, proton ở δ
H
6.39 cho tương quan với
C-5 nên đây chính là H-6. Ngoài ra, proton của hai nhóm -OCH
3
cho tương quan
HMBC với C-4′ (δ
C
161.3), C-7 (δ
C
165.2) xác định vị trí của hai nhóm thế này.

Từ những dữ liệu trên chứng tỏ BM2 là 7,4′-dimetylkaempferol-3-O-
[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid. Theo tra cứu trên SciFinder
vào tháng 01 năm 2010, BM2 là một cấu trúc chưa từng được công bố trên thế giới.



Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -24- CBHD: TS. Trần Lê Quan
Bảng 2: Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR và HMBC của hợp chất BM2
Vị trí Loại C
δ
H
δ
C

Tương quan HMBC
(
1
H →
13
C)
2 =C(OR)- 156.8

3 =C(OR)- 133.8
4 >C=O 177.6
5 =C(OH)- 160.9
6 =CH- 6.39 (d, J 2.0) 98.0 C-5, C-7, C-8, C-10
7 =C(OR)- 165.2
8 =CH- 6.72 (d, J 2.0) 92.4 C-7, C-9, C-6, C-10
9 =C(OR)- 156.5
10 >C= 105.1
1′
>C= 122.3
2′
=CH- 8.12 (d, J 8.5) 130.8
C-3′, C-2, C-4′, C-6′
3′
=CH- 7.07 (d, J 9.0) 113.7
C-2′, C-4′, C-1′, C-5′
4′
=C(OR)- 161.3
5′
=CH- 7.07 (d, J 9.0) 113.7
C-4′, C-6′, C-1′, C-3′
6′
=CH- 8.12 (d, J 8.5) 130.8
C-5′, C-2, C-2′, C-4′
7-OCH
3
3.86 (s) *55.4 C-7
4′-OCH
3

3.86 (s) *55.1
C-4′
5-OH 12.50 (s)
Glu

1″ >CH(OR)(OR′)
5.37 (d, J 7.5) 101.3 C-3
2″
>CH(OH)- 3.17 (m) 74.1
3″
>CH(OH)- 3.22 (m) 76.3
4″
>CH(OH)- 3.10 (m) 69.8
5″
>CH(OR)- 3.26 (m) 75.7
6″
–CH2(OR) 3.70 (d, J 10.5);
3.33 (m)
66.8
Rha
1″′ >CH(OR)(OR′)
4.39 (br.s) 100.8
C-6″
2″′
>CH(OH)- 3.43 (m) 70.3
3″′
>CH(OH)- 3.29 (m) 70.6
4″′
>CH(OH)- 3.09 (m) 71.8
5″′

>CH(OR)- 3.26 (m) 68.2
6″′
–CH3 0.97 (d, J 6) 17.7
* Hai tín hiệu có thể hoán đổi cho nhau


Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -25- CBHD: TS. Trần Lê Quan
3.2.3 Hợp chất BM3

Hợp chất BM3 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan tốt trong
dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly
cloroform:metanol:nước (10:4:1) cho vết tròn có R
f
0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng
acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam.
Khối phổ phân giải cao (–)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả
phân tử [M–H]
–
ở m/z 783.2353 (lý thuyết 783.2348) cho thấy BM3 có CTPT
C
35
H
44
O
20
.
Phổ
13

C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng với
sự hiện diện của 35 carbon, trong đó 15 tín hiệu carbon khung flavonol tương tự
như BM1 và BM2, ba tín hiệu carbon metin gắn oxygen vùng trường thấp ở δ
C

100.6, δ
C
102.3, δ
C
102.4, một tín hiệu carbon metylen và 12 tín hiệu carbon metin
vùng đường với hai nhóm metyl của đường α-L-rhamnose cùng ở δ
C
18.3 chứng tỏ
BM3 có ba đơn vị đường là D-glucose và hai đường L-rhamnose. Ngoài ra, BM3
cũng có hai nhóm thế -OCH
3
ở δ
C
55.7 và δ
C
55.8.
Phổ
1
H-NMR của BM3 xác nhận các mũi cộng hưởng của proton
hương phương ở δ
H
8.35 (1H, dd, J 8.5; 2.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta
với proton ở δ
H
7.19 (1H, d, J 8.5, H-5′) và δ

H
8.20 (1H, d, J 2.5, H-2′); proton ở δ
H

6.48 (1H, d, J 2.5, H-8) ghép cặp meta với proton ở δ
H
6.44 (1H, d, J 2.5, H-6). Phổ
1
H-NMR của BM3 còn xác nhận sự hiện diện của hai nhóm -OCH
3
ở δ
H
3.68 (3H,
s, 7-OCH
3
) và 3.77 (3H, s, 4′-OCH
3
). Những dữ kiện này cho thấy algycon của
BM3 có cấu trúc của dimetylquercetin tương tự như BM1. Ngoài ra, phổ
1
H-NMR
của BM3 còn cho các mũi cộng hưởng của ba proton anomer ở δ
H
6.38 (1H, d, J
8.0, H-1″), δ
H
6.40 (1H, br.s, H-1″′), δ
H
5.19 (1H, br.s, H-1″″) và hai mũi metyl của

Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -26- CBHD: TS. Trần Lê Quan
đường α-L-rhamnose ở δ
H
1.62 (3H, d, J 6.5, H
3
-6″′) và δ
H
1.39 (3H, d, J 5.5, H
3
-
6″″).

Phổ COSY và HSQC xác nhận ba đơn vị đường tương ứng là D-
glucose và hai đường L-rhamnose. Phổ HMBC của BM3 còn cho thấy ba proton
anomer của các đơn vị đường ở δ
H
6.38 (H-1″), δ
H
6.40 (H-1″′), δ
H
5.19 (H-1″″) lần
lượt cho tương quan với δ
C
134.8 (C-3), δ
C
78.5 (C-2″) và δ
C

68.0 (C-6″). Như vậy,
đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-3 của aglycon và hai đơn vị đường L-
rhamnose gắn trên đơn vị D-glucose này lần lượt tại các vị trí C-2″ và C-6″.
Từ những dữ liệu trên kết luận BM3 là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[α-
L-rhamnopyranosyl(1→2)][α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid.
Theo tra cứu trên SciFinder vào tháng 01 năm 2010, BM3 là một cấu trúc chưa từng
được công bố trên thế giới.