Dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ppsx

78
Chương 4
Dinh dưỡng, sinh trưởng
và phát triển của vi sinh vật

I. Dinh dưỡng
Trong quá trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất
không ngừng với môi trường chung quanh. Tế bào vi sinh vật tuy rất nhỏ,
nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm trao đổi chất
qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn.
Các chất dinh dưỡng vào tế bào qua màng và được chuyển hoá để tạo
thành những chất riêng biệt cần thiết cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá
trình đồng hoá các tế bào mới có thể sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối,
đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất.
Sự biến đổi các chất dinh dưỡng bao gồm nhiều phản ứng hoá sinh
khác nhau nhờ hệ enzyme theo con đường trao đổi chất, hoặc tạo ra những
chất là thành phần của tế bào (quá trình đồng hoá) hoặc tạo ra năng lượng
sinh học cần thiết cho hoạt động sống (quá trình dị hoá). Những chất dinh
dưỡng là những hợp chất phân tử nhỏ có thể đi qua màng vào bên trong tế
bào vi sinh vật và tham gia vào hai loại phản ứng sinh hoá:
- Biến đổi dị hoá làm xuất hiện những sản phẩm có cấu trúc đơn
giản hơn. Những biến đổi dị hoá này cung cấp cho vi sinh vật năng lượng
chuyển hoá ở dạng ATP hoặc những hợp chất giàu năng lượng khác. Một
số những sản phẩm dị hoá được thải đi, một số khác làm vật liệu hoặc làm
tiền chất cho các phản ứng đồng hoá.
- Biến đổi đồng hoá, đảm bảo sự tổng hợp của thành phần mới có
cấu trúc phức tạp hơn và phân tử lượng cao hơn. Quá trình này thường
được gọi là đồng hoá hoặc sinh tổng hợp.
Điều kiện chủ yếu để sinh tổng hợp các thành phần tế bào vi sinh vật
là cung cấp một lượng thích hợp của những hợp chất có phân tử lượng

nhỏ, như các acid hữu cơ hoặc amino acid, có thể làm nguyên liệu hay tiền
chất cho các phản ứng đồng hoá hay phản ứng sinh tổng hợp. Khi trong
môi trường có những hợp chất - vật liệu đó thì vi sinh vật sẽ trực tiếp sử
dụng. Nhưng không phải bao giờ trong môi trường cũng có sẵn những hợp
chất - vật liệu cần cho quá trình sinh tổng hợp. Muốn có tế bào vi sinh vật
bắt buộc phải tự sản xuất lấy bằng cách tự biến đổi những thành phần của
môi trường nuôi cấy. Ở những vi sinh vật dị dưỡng sống bằng chất hữu cơ,

79
một số tiền chất được hình thành trong các phản ứng dị hoá, nó sản sinh ra
ATP cùng một số lớn các hợp chất khác nhau của carbon.
Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật chủ yếu lấy ở môi trường xung
quanh. Các môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ năng
lượng, các vật liệu xây dựng tế bào và đảm bảo cho hiệu suất sinh tổng
hợp cao. Thành phần môi trường gồm có các nguồn ăn carbon, nitơ, chất
khoáng, các nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Việc
lựa chọn các nguồn dinh dưỡng và nồng độ của chúng trong môi trường
phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng từng loài vi sinh vật và điều
kiện nuôi cấy chúng.

II. Môi trường dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng
1. Môi trường dinh dưỡng
1.1. Nguồn thức ăn carbon
Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất
vô cơ (CO
2
, NaHCO
3
, CaCO
3

) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và
khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào
thành phần hóa học, tính chất sinh lí của nguồn thức ăn và đặc điểm sinh lí
của từng loại vi sinh vật. Hầu như không có hợp chất carbon nào mà
không bị hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải.
Không ít vi sinh vật có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền
vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí tự nhiên.
Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối
lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết
ra các enzyme thủy phân (amylase, cellulase, pectinase, protease, lipase )
để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, amino acid,
acid béo ).
Người ta thường sử dụng đường để làm nguồn thức ăn carbon khi
nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Để nuôi cấy các loại vi sinh
vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau. Với vi
khuẩn, xạ khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường còn đối với nấm men,
nấm sợi thường dùng 3 - 10% đường.
Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hóa được các loại đường ở dạng đồng
phân D. Nhưng phần lớn các đồng phân của đường đơn trong tự nhiên đều
là thuộc loại D. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (peptone, nước thịt,
nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá
đậu ) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh

80
vật. Với vi sinh vật dị dưỡng, nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng,
nguồn dinh dưỡng và năng lượng.
1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ (N)
Ý nghĩa chủ yếu của các chất dinh dưỡng chứa nitơ đối với vi sinh
vật là cung cấp N để tạo thành các nhóm amin (-NH
2

) và nhóm imin
(=NH) trong phân tử amino acid, các nucleotide, purine và pirimidine,
trong nhiều vitamin
Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NO
3
-
và NH
4
+
. Muối
nitrate là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và
xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Sau
khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO
3
-
các ion kim loại còn lại (K
+
, Na
+
,
Mg
2+
) sẽ làm kiềm hóa môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta
thường sử dụng muối NH
4
NO
3
để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh
vật. Tuy nhiên gốc NH
4

+
thường được hấp thụ nhanh hơn gốc NO
3
-
.
Vi sinh vật còn có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các
thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn carbon vừa là nguồn nitơ
cung cấp cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp
các protein cao phân tử. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh
protease thủy phân protein thành các hợp chất phân tử thấp có khả năng
xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng
để nuôi cấy vi sinh vật là peptone (là chế phẩm thủy phân không triệt để
của một nguồn protein nào đó) chúng khác nhau về lượng chứa các loại
polypeptide và lượng chứa amino acid tự do.
Ngoài ra phân tử N
2
tự do cũng được một nhóm nhỏ vi sinh vật sử
dụng gọi là nhóm vi sinh vật cố định nitơ (nitrogen fixing
microorrganisms). Chúng có hệ enzyme nitrogenase có thể bẻ gãy nối ba
của nitơ phân tử ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường.
1.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Khi sử dụng các môi trường thiên nhiên để nuôi cấy vi sinh vật
thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Trong nguyên liệu
dùng để pha chế các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết
thanh, peptone, giá đậu ) thường có chứa đủ các nguyên tố khoáng cần
thiết đối với vi sinh vật. Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp
(dùng nguyên liệu là hóa chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố
khoáng cần thiết.
Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp
với liều lượng lớn được gọi là các nguyên tố đại lượng. Còn những

81
nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với những liều lượng rất nhỏ
được gọi là các nguyên tố vi lượng.
Phosphorus (P) bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các
nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật (nhiều khi P chiếm đến 50% so
với tổng số chất khoáng). P có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần
quan trọng của tế bào (acid nucleic, phosphoprotein, phospholipid, ADP,
ATP, UDP, UTP, CDP, CTP, NAD, NADP, flavin ; một số vitamin như
thiamine, biotin ). Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng P người ta thường sử
dụng các loại muối phosphate vô cơ. Việc bổ sung phosphate vào các môi
trường dinh dưỡng ngoài tác dụng cung cấp P còn có tác dụng tạo ra tính
đệm của môi trường.
Lưu huỳnh (S) cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế
bào vi sinh vật. S có mặt trong một số amino acid (cysteine, cystine,
methionine), một số vitamin (biotin, thiamine ) cysteine, cystine và một
tripeptide là glutation không chỉ tham gia vào cấu trúc protein mà còn có
vai trò quan trọng trong các quá trình ôxy hóa khử. Các hợp chất hữu cơ
có chứa S ở dạng ôxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh
vật. Trong khi đó các muối sulphate vô cơ với nguyên tử S ở trạng thái
ôxy hóa lại được cơ thể vi sinh vật đồng hóa rất tốt. Một số vi sinh vật có
thể dùng cả thiosulphate làm nguồn thức ăn S. Một số vi sinh vật khác lại
đòi hỏi các thức ăn chứa S ở dạng khử (H
2
S, cystine, cysteine ).
Fe là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một
số enzyme loại porphiryl chứa sắt (như cytochrome, cytochrome -
oxydase, peroxydase, catalase ). Một số vi sinh vật tự dưỡng quang năng
còn sử dụng Fe để tổng hợp ra các sắc tố quang hợp có cấu trúc porphiryl
(chlorophyll, bacteriochlorophyll).

Mg là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi cung cấp với lượng khá
cao. Mg mang tính chất một cofactor, chúng tham gia nhiều phản ứng
enzyme có liên quan đến qúa trình phosphoryl hóa. Mg
2+
có thể hoạt hóa
các enzyme như hexokinase, ATP - ase, carboxylase, các enzyme trao đổi
protein, các enzyme ôxy hóa khử của chu trình Krebs Mg còn có vai trò
quan trọng trong việc liên kết các tiểu phần ribosome với nhau.
Ca mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các chất
hữu cơ nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh
vi của tế bào. Ca đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần
quan trọng của tế bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các
nucleotide với nhau, giữa ARN và protein trong ribosome). Ca rất cần
thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều
bào quan như ribosome, ti thể, nhân

82
Zn cũng là một cofactor tham gia vào nhiều quá trình enzyme. Zn có
tác dụng đáng kể trong việc hoạt hóa các enzyme như carbonanhydrase,
enolase, pyrophosphatase, phosphatase kiềm
Cũng có một số nguyên tố hóa học chúng ta chưa hiểu rõ về vai trò
sinh lí của chúng, trong số đó phải kể đến là K. K là nguyên tố chiếm tỉ lệ
khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật, nhưng cho đến
nay người ta chưa tìm thấy K tham gia vào bất kì thành phần nào của
nguyên sinh chất, cũng chưa tìm thấy bất kì enzyme nào có chứa K. K
thường tồn tại ở dạng ion K
+
ở mặt ngoài của cấu trúc tế bào. Một phần
đáng kể K tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lí không bền với protein và các
thành phần khác của nguyên sinh chất. K làm tăng độ ngậm nước của các

hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các
quá trình sinh tổng hợp. K còn có thể tham gia vào quá trình tổng hợp một
số vitamin và có ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật.
Na và Cl cũng là những nguyên tố mà nhiều vi sinh vật đòi hỏi với
một lượng không nhỏ, nhưng cho tới nay người ta vẫn còn biết rất ít vai
trò sinh lí của chúng. Hàm lượng Na và Cl đặc biệt cao trong tế bào vi
sinh vật ưa mặn sống trong nước biển, đất, vùng ven biển hoặc trên các
loại thực phẩm ướp mặn.
1.4. Yếu tố sinh trưởng
Đối với vi sinh vật thì yếu tố sinh trưởng là một khái niệm rất linh
động. Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động
sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được từ các chất
khác. Những chất được coi là yếu tố sinh trưởng của loài vi sinh vật này
hoàn toàn có thể không phải là yếu tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh
vật khác. Hầu như không có chất nào là yếu tố sinh trưởng chung đối với
tất cả các loài vi sinh vật.
Đặc điểm của môi trường sống một mặt ảnh hưởng đến khả năng
tổng hợp yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng đến đặc
điểm trao đổi chất của chúng. Chính thông qua các ảnh hưởng này mà môi
trường sống của từng loại vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu của
chúng về yếu tố sinh trưởng. Khi sống lâu dài trong các môi trường thiếu
yếu tố sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra được khả năng tự tổng hợp
yếu tố sinh trưởng mà chúng cần thiết.
Cùng một loài vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các điều kiện
khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về yếu tố sinh trưởng.
Chẳng hạn nấm mốc Mucor rouxii được chứng minh là chỉ cần biotin và

83
thiamine khi phát triển trong điều kiện kị khí. Khi nuôi cấy trong điều kiện
hiếu khí, chúng sẽ tự tổng hợp ra được yếu tố sinh trưởng này.

Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng
đến nhu cầu về yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật. Chẳng hạn việc đòi hỏi
acid pantotenic của một số vi sinh vật (ví dụ vi khuẩn bạch hầu
Corynebacterium diphtheriae) có thể thỏa mãn khi chỉ cần cung cấp cho
chúng β - alanine, chúng có thể tự tổng hợp được acid pantoic (acid
pantotenic cấu tạo từ acid pantoic và β - alanine).
Thông thường các chất được coi là yếu tố sinh trưởng đối với một
loài nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm
purine, pirimidine và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần
của màng tế bào, các vitamin thông thường
Mặt khác, nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin. Sinh
khối vi sinh vật thường chứa hầu hết các loại vitamin chủ yếu với những
hàm lượng khá cao. Người ta đã sử dụng thành công một số loài vi sinh
vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp một số loại vitamin tinh khiết dùng
trong y học. Đáng chú ý nhất là acid ascorbic (vitamin C), riboflavin
(vitamin B
2
), cyanocobalamin (vitamin B
12
).
2. Điều kiện sinh trưởng
Sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với
các điều kiện của môi trường bên ngoài. Các điều kiện này bao gồm hàng
loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau. Đa số các yếu tố đó
đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động là tối
thiểu, tối thích và cực đại.
2.1. Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi sinh vật
Các yếu tố của môi trường bên ngoài tác dụng lên tế bào thuộc ba
loại là yếu tố vật lí (độ ẩm, nhiệt độ, áp lực, tia bức xạ ), yếu tố hóa học
(pH môi trường, thế ôxy hóa khử, các chất diệt khuẩn ) và yếu tố sinh

học (chất kháng sinh, kháng thể). Dù là yếu tố nào nhưng khi đã tác dụng
bất lợi lên tế bào thì thường trước hết gây tổn hại đến các cấu trúc quan
trọng cho sự sống của tế bào. Những tổn hại đó dẫn đến phá hủy chức
phận hoạt động của các cấu trúc và làm chết tế bào. Chừng nào tế bào vi
sinh vật có thể sống sót chính là do chúng đã thích ứng với yếu tố đã cho
bằng những thay đổi về sinh lí hoặc di truyền.
Tác dụng có hại của các yếu tố bên ngoài tế bào thể hiện chủ yếu ở
những biến đổi sau đây:
1. Phá hủy thành tế bào: một số chất như enzyme lysozyme (chứa
trong lá lách, bạch cầu, lòng trắng trứng, đuôi thực khuẩn thể ) có khả

84
năng phân huỷ thành tế bào vi khuẩn dẫn đến tạo thành các nguyên lạp
chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương và các cầu lạp ở vi khuẩn Gram âm.
2. Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: một số chất không nhất
thiết phải xâm nhập tế bào, nhưng vẫn gây tác dụng kháng khuẩn. Do tác
dụng lên một hoặc một chức phận sinh lí của màng tế bào, chất này sẽ làm
vi khuẩn mất khả năng sinh sản. Rất có thể, trong trường hợp như vậy,
hàng rào thẩm thấu tồn tại trong màng tế bào chất đã bị hư hại.
Tác dụng kháng khuẩn của các chất ôxy hóa và các chất khử (H
2
O
2
,
các halogen ) là do ảnh hưởng của chúng lên các thành phần của màng tế
bào chất. Cũng có thể xếp vào nhóm các hợp chất này là rượu, phenol, các
chất tẩy rửa tổng hợp, các muối mật và một số kháng sinh (polymyxin,
thyroxydin, nistatin).
3.Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: các yếu tố vật lí cũng
như hóa học đều có thể gây nên tác dụng này. Chẳng hạn nhiệt độ cao làm

biến tính protein và làm chúng đông tụ do khả năng khử nước.
4. Kìm hãm hoạt tính: một số chất tác động vào các hệ thống sinh
năng lượng của tế bào, cyanite kìm hãm cytochrome - oxydase, fluoride
ngăn cản quá trình đường phân, các hợp chất hoá trị ba của acsenic bao
vây chu trình Krebs, dinitrophenol kìm hãm quá trình phosphoryl hoá ôxy
hóa. Các chất ôxy hóa mạnh (H
2
O
2
, halogen) phá hủy các hệ thống tế bào
làm tổn hại đến chức phận trao đổi chất. Các enzyme khác có thể bị bất
hoạt khi liên kết với các yếu tố kim loại như thủy ngân.
5. Hủy hoại các quá trình tổng hợp: trong sự có mặt của một số chất
tương tự về mặt cấu trúc với các chất trao đổi tự nhiên, gọi là các chất
kháng chất trao đổi (antimetabolism), quá trình sinh tổng hợp có thể bị ức
chế. Cơ chế tác dụng của các chất kháng chất trao đổi không giống nhau.
Một số gắn với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme mất hoạt
tính phân hủy cơ chất; một số khác có thể tham gia vào phản ứng enzyme
và được lắp vào sản phẩm của phản ứng nhưng sau đó không được sử
dụng trong trao đổi chất với cùng mức độ như trong trường hợp của cơ
chất thực.
2.2. Các nhân tố ảnh hưởng
* Các yếu tố vật lí
- Độ ẩm: hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến
nước, do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Đa số vi
khuẩn thuộc các sinh vật ưa nước nghĩa là chúng cần nước ở dạng tự do,
dễ hấp thụ. Chỉ một số xạ khuẩn có thể xếp vào bọn ưa khô. Nếu làm lạnh
tế bào đồng thời làm khô trong chân không ta có thể bảo quản được sức

85

sống của tế bào trong một thời gian dài. Đây là nguyên tắc của phương
pháp làm đông khô vi khuẩn.
Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi
khô hoặc sấy khô ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loài sản phẩm
(hoa quả khô, cá, ruốc thịt khô).
- Nhiệt độ: hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết
quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này thuộc phụ thuộc chặt
chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá
trình sống của tế bào.
Như đã nói trên, hoạt động của vi sinh vật bị giới hạn trong môi
trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Vùng này của nước nằm từ 2
o
C
đến khoảng 100
o
C gọi là vùng sinh động học. Hầu hết tế bào sinh dưỡng
của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao do protein bị biến tính, một hoặc
hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme
trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở
nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự
phá hoại màng tế bào chất (nói chung, các acid nucleic ít mẫn cảm với
nhiệt độ so với các enzyme).
Nhiệt độ thấp (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt quá
trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi cấu
hình không gian của một số permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng
đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ
động các chất dinh dưỡng.
- Áp lực: áp suất thẩm thấu và áp suất thủy tĩnh có thể ảnh hưởng
đến cấu trúc của tế bào vi khuẩn. Màng tế bào chất của tế bào vi khuẩn là
bán thấm do đó các hiện tượng thẩm thấu và việc điều chỉnh thẩm áp qua

các hệ thống permease đều có liên quan đến màng này. Trong môi trường
ưu trương tế bào mất khả năng rút nước và các chất dinh dưỡng hòa tan
bao quanh, tế bào chịu trạng thái khô sinh lí, bị co sinh chất và có thể bị
chết nếu thời gian kéo dài. Trong thực tế người ta ứng dụng tác dụng co
sinh chất của các nồng độ muối cao (10 - 15%) hoặc đường cao (50- 80%)
để bảo quản thực phẩm (muối dưa, cà, ướp thịt cá), hoa quả (làm mứt) vì
đa số vi sinh vật rất mẫn cảm với thẩm áp cao của môi trường. Ngược lại,
khi vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm nhập tế bào, áp lực
bên trong sẽ tăng lên. Tuy nhiên, do có thành tế bào cứng ở vi khuẩn
không xảy ra ra hiện tượng vỡ sinh chất như ở tế bào thưc vật.
Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa ít hơn 2%
muối, nồng độ muối cao hơn có hại cho tế bào. Nhưng cũng có một số vi
khuẩn lại sinh trưởng tốt nhất trong môi trường chứa tới 30% muối, ta gọi

86
là các vi khuẩn ưa muối (halophilic). Nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm
này, chúng không có khả năng phát triển ở những nồng độ đường cao.
- Các tia bức xạ: ánh sáng có thể gây ra những biến đổi và do đó có
thể gây tổn thương sinh học nếu được tế bào hấp thụ. Mức độ gây hại tùy
thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng được hấp thụ. Các tia
có thể gây những biến đổi hóa học là ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X,
tia gamma và tia vũ trụ. Ánh sáng mặt trời có thể gián tiếp tác động lên tế
bào do làm biến đổi môi trường. Tia tử ngoại có tác dụng mạnh nhất ở
bước sóng 260nm, đây là vùng hấp thụ cực đại của acid nucleic và
nucleoprotein gây dimer hóa thimine, dẫn đến ức chế sự nhân đôi của
ADN. Nhưng sau khi chiếu tia tử ngoại, nếu đưa vi khuẩn ra ánh sáng ban
ngày thì vi khuẩn có thể phục hồi khả năng sinh trưởng và phân chia. Hiện
tượng này gọi là quang tái hoạt (photoreactivation).
- Âm thanh: sóng âm thanh, đặc biệt trong vùng siêu âm (trên 20
kHz) có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của vi khuẩn, các tế bào sinh

dưỡng bị chết nhanh chóng.
* Các yếu tố hóa học
- Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường có ý nghĩa
quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H
+
và OH
-
là
hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ
trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ. Cho nên việc xác
định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh
trưởng của tế bào là rất quan trọng.
Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và
sinh sản của vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt
động của nhiều enzyme. Giới hạn pH hoạt động đối với vi sinh vật ở trong
khoảng 4 - 10. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trung tính (7,0)
như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết
của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4). Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn
nốt sần, xạ khuẩn, vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm.
Một số vi khuẩn chịu acid (vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina
ventriculi), một số khác ưa acid như Acetobacter acidophilus, Thiobacillus
thiooxydans (ôxy hóa lưu huỳnh thành H
2
SO
4
) có thể sinh trưởng ở pH <1.
Nấm mốc và nấm men ưa pH acid (pH 4 - 6). pH môi trường không những
ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến các quá
trình trao đổi chất.
- Ảnh hưởng của ôxy: ôxy có vai trò hết sức quan trọng trong hoạt

động sống của vi sinh vật. Tuỳ thuộc vào nhu cầu đối với ôxy mà người ta

87
chia vi sinh vật thành các nhóm sau:
+ Hiếu khí bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể
sinh trưởng được khi có mặt ôxy phân tử (O
2
), chúng có chuỗi hô hấp
hoàn chỉnh, dùng O
2
làm thể nhận hydro cuối cùng. Trong các tế bào có
chứa enzyme SOD (superoxid dismutase), catalase và peroxidase có tác
dụng chuyển hoá các gốc O
2
2-
và O
2
-

để giải độc cho tế bào. Tuyệt đại đa
số vi nấm và số đông vi khuẩn thuộc nhóm này.
+ Hiếu khí không bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật có thể
sinh trưởng được cả trong điều kiện có ôxy lẫn không có ôxy. Trong tế
bào có chứa SOD và peroxidase, khi có ôxy chúng sinh trưởng tốt hơn.
Phần lớn nấm men và nhiều vi khuẩn thuộc nhóm này. Có thể kể đến các
loài như Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Enterobacter aerogenes,
Proteus vulgaris.
+ Vi hiếu khí: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể sinh
trưởng được ở điều kiện áp lực ôxy rất thấp. Chúng cũng thông qua chuỗi
hô hấp và dùng ôxy làm thể nhận hydro cuối cùng. Có thể kể đến các loài

như Vibrio cholerae, Hydrogenomonas spp, Zymononas spp, Bacteroides
spp
+ Kỵ khí: với các vi sinh vật thuộc nhóm này sự có mặt của ôxy
phân tử là có hại. Chúng không sinh trưởng được trên môi trường đặc hoặc
bán đặc khi để trong không khí hay trong không khí có chứa khoảng 10%
CO
2
. Chúng chỉ sinh trưởng được ở lớp thể dịch sâu, nơi không có ôxy, có
các quá trình lên men, quá trình phosphoryl hoá quang hợp, quá trình
methane hoá Trong tế bào của các vi sinh vật này không có SOD,
cytochrome-oxidase, phần lớn không có hydrogenperoxidase. Có thể kể
đến rất nhiều loài trong các chi Clostridium, Fusobacterium, Butyrivibrio,
Desulfovibrio, Veillonella
- Các chất diệt khuẩn (sát trùng): thường sử dụng là phenol và các
dẫn xuất của phenol, alkol, halogen, kim loại nặng, H
2
O, xà phòng, thuốc
nhuộm và các chất tẩy rửa tổng hợp của các muối ammon bậc bốn.
* Các yếu tố sinh học
Trong các yếu tố sinh học ảnh hưởng có hại lên các quá trình sống
của vi sinh vật cần kể đến kháng thể và kháng sinh. Chất kháng sinh có thể
có từ nhiều nguồn gốc khác nhau như tổng hợp hoá học, chiếc xuất từ thực
vật, động vật nhưng chủ yếu là được tổng hợp từ vi sinh vật. Đây là các
chất đặc hiệu mà ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi
sinh vật một cách chọn lọc.

88
Kháng thể là những chất có sẵn trong máu hoặc được xuất hiện khi
có kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, có khả năng liên kết đặc hiệu với
các kháng nguyên để làm mất hoạt lực của kháng nguyên (xem thêm phần

kháng sinh và miễn dịch ).
III. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật
Căn cứ vào dạng năng lượng sử dụng người ta có thể chia làm các
loại vi sinh vật:
- Các cơ thể quang tự dưỡng (photoautotrophic) hay quang dưỡng vô
cơ (photolithotrophic) có thể chuyển năng lượng ánh sáng thành năng
lượng trao đổi chất (ATP) và chất có tính khử (NADPH
2
). CO
2
là nguồn
carbon chủ yếu, H
2
O hay H
2
S là chất cho điện tử.
Có thể gặp những vi khuẩn quang hợp thải ôxy giống như cây xanh,
đại diện là các loài vi khuẩn lam (Spirulina, Anabaena, Nostoc…). Các tảo
đơn bào quang hợp không thải ôxy như các vi khuẩn lục thuộc họ
Chlorobacteriaceae (Chlorobium, Thiosulfatophilum ), đây là những vi
khuẩn quang dưỡng vô cơ kị khí với H
2
S hoặc S
2
O
3
2-
làm chất cho điện tử.
Các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc bộ Thiorhodobacteriales như
Chromatium, những vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường

muối vô cơ như nhiều loại cây xanh, đây là những vi khuẩn kị khí quang
dưỡng vô cơ khi có mặt trong môi trường S hoặc H
2
S.
- Các vi khuẩn quang dị dưỡng (photoheterotrophic) hay quang
dưỡng hữu cơ (photoorganotrophic), sử dụng ánh sáng làm nguồn năng
lượng và hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon, như các vi khuẩn màu tía
không lưu huỳnh thuộc bộ Athiorhodobacteriales, họ Athiorhodaceae, các
loài thuộc giống Rhodospirillum. Những vi khuẩn này thiên về vi hiếu khí,
là những vi khuẩn quang dưỡng hữu cơ, không có khả năng phát triển với
H
2
S là chất cho electron độc nhất, chất cho electron của chúng là acetate,
succinate hay hydro.
- Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ (Chemolithotrophic) hay hóa tự
dưỡng (Chemoautotrophic) sử dụng năng lượng được tạo thành từ các
phản ứng hóa học và CO
2
làm nguồn carbon.
Năng lượng có được là nhờ ôxy hóa các hợp chất vô cơ như NH
4
+
,
NO
2
-
, H
2
, H
2

S, S, S
2
O
3
2-
, Fe
2+
Chúng hình thành một nhóm rất hạn chế
tham gia vào các chu trình vật chất sống ở trong đất và nước như
Hydrogenomonas ôxy hóa hydro, Nitrosomonas ôxy hóa NH
3
, Nitrobacter
ôxy hóa nitrite, Thiobacillus ôxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh
- Các cơ thể hóa dị dưỡng (Chemoheterotrophic) hay hóa dưỡng hữu
cơ (Chemoorganotrophic) bao gồm các vi khuẩn, vi nấm, động vật nguyên

89
sinh, động vật, chúng sử dụng năng lượng hóa học và một cơ chất hữu cơ
làm nguồn carbon chủ yếu. Một nhóm lớn các vi khuẩn hóa dưỡng hữu cơ
là những vi sinh vật gây bệnh rất được chú ý trong Y học, các vi khuẩn tạp
nhiễm vào thức ăn, các vi khuẩn được sử dụng trong công nghiệp để tổng
hợp các chất kháng sinh, các loại vitamin, các amino acid
IV. Sinh lí học của sự sinh trưởng
1. Các phương pháp xác định số lượng và sinh khối vi khuẩn
1.1. Xác định sinh khối vi khuẩn
Việc chọn phương pháp để xác định sinh khối vi khuẩn tùy thuộc
vào mục đính nghiên cứu. Chẳng hạn, muốn đánh giá sản lượng tế bào thì
cần sinh khối tươi hoặc khô sau khi đã li tâm tế bào; muốn xác định cường
độ trao đổi chất hay hoạt tính enzyme, người ta lại tính hàm lượng protein
hoặc nitơ. Như vậy, trong thực tế có thế sử dụng các phương pháp trực

tiếp hoặc gián tiếp.
Các phương pháp trực tiếp gồm có:
1. Xác định sinh khối tươi hoặc sinh khối khô (phương pháp này
kém chính xác).
2. Xác định hàm lượng nitơ tổng số (phương pháp Kjelhdal) hay
hàm lượng carbon tổng số (theo Vslike-Folch), các phương pháp này cho
độ chính xác cao.
3. Trong thực tế người ta thường xác định hàm lượng protein của vi
khuẩn. Có thế dùng phương pháp buire cải tiến hoặc phương pháp so màu
khác. Các phương pháp vi lượng dựa vào việc đo số lượng các thành phần
đặc trưng của protein như threonine, tryptophan (theo Lowry hoặc Folin-
Ciocalteu) cũng cho kết quả tốt.
Có thể nói xác định hàm lượng protein trong sinh khối là phương
pháp thích hợp nhất vì một mặt protein là thành phần chủ yếu của chất
khô, mặt khác đó là những thành phần hoạt động trong sinh khối (hầu hết
protein của tế bào là enzyme).
* Các phương pháp gián tiếp để đo sinh khối vi khuẩn:
1. Đo độ đục của dịch treo tế bào, đây là phương pháp rất thuận lợi.
Trong thực tế ta thường đo mật độ quang học của dịch treo, trong một số
trường hợp người ta cũng xác định sự khuếch tán ánh sáng.
2. Đo các chỉ số cường độ trao đổi chất như hấp thụ O
2
, tạo thành
CO
2
hay acid, vì các chỉ số này liên quan trực tiếp với sinh trưởng. Dĩ
nhiên ta chỉ dùng các phương pháp này trong trường hợp không sử dụng
được các phương pháp khác, ví dụ khi mật độ sinh khối rất nhỏ.

90

1.2. Xác định số lượng tế bào
Trong trường hợp xác định số lượng tế bào sống người ta thường
đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các vi khuẩn sống trong điều kiện sinh
trưởng thuận lợi. Dịch treo vi khuẩn được pha loãng và một thể tích nhất
định được đưa lên môi trường thạch trong hộp Petri. Sau khi nuôi cấy
người ta đếm số khuẩn lạc mọc lên. Nếu giả dụ rằng mỗi tế bào tạo thành
một khuẩn lạc thì đếm số khuẩn lạc ta sẽ đếm được số tế bào sống. Tất
nhiên điều này không đúng đối với các vi khuẩn mọc thành chuỗi, thành
đôi hay thành đám hoặc đối với các dịch treo vi khuẩn không đồng nhất.
Số khuẩn lạc cũng rất phụ thuộc vào thành phần môi trường. Tế bào
mọc thành khuẩn lạc trên môi trường này không nhất thiết cũng cho xuất
hiện khuẩn lạc trên môi trường khác.
Với một số loại vi khuẩn khó phát triển trên môi trường thạch người
ta có thể kiểm tra số lượng bằng phương pháp pha loãng liên tiếp sau đó
cấy từ mỗi độ pha loãng 1ml vào từng ống đựng môi trường chỉ thị (nếu
có 1 vi khuẩn đưa vào cũng đủ cho phản ứng dương tính sau khi nuôi cấy).
Phương pháp này gọi là phương pháp số lượng có khả năng nhất (MPN =
Most Probable Number). Có thể cấy vào 5 ống và lấy số liệu ở 3 độ pha
loãng cuối (có phản ứng dương tính) rồi tra bảng để tìm ra số lượng gần
đúng mật độ vi khuẩn.
Hoặc có thể lọc mẫu qua màng lọc vi khuẩn rồi đặt màng lọc lên đĩa
môi trường thạch để kiểm tra số khuẩn lạc mọc và suy ra mật độ vi sinh
vật trong mẫu.
Nếu kích thước của tế bào khá lớn có thể đếm trực tiếp trên phòng
đếm (thường hay dùng các loại phòng đếm Thomas hay Goriaev).
2. Sinh trưởng lũy thừa và thời gian thế hệ
Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của vi sinh vật. Sinh
trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng tế bào, còn phát triển (sinh sản)
là sự tăng số lượng tế bào. Điều cần chú ý là khi nói về sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến sinh trưởng và phát triển của một

số lượng lớn tế bào của cùng một loại. Bởi vì, việc nghiên cứu một cá thể
tế bào vi khuẩn quá nhỏ là rất khó. Tuy nhiên sự tăng số lượng tế bào
không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối. Chẳng
hạn, khi chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân
chia 1 - 2 lần nhưng cho 2 - 4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường; trong
pha mở đầu, sinh khối vi khuẩn tăng lên, nhưng số tế bào không thay đổi,
ngược lại, vào cuối pha logarid kích thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào
vẫn còn tăng.

91
Giả sử trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh
dưỡng, ta cấy vào đó một tế bào vi khuẩn. Nếu thành phần môi trường
hoàn toàn phù hợp với nhu cầu của tế bào vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng
khối lượng và thể tích, tổng hợp các thành phần của tế bào (thành tế bào,
màng tế bào chất, ADN, ARN, protein ) cho đến khi kích thước lớn gấp
đôi và vi khuẩn sẽphân chia cho 2 tế bào. Hai tế bào này lại tiếp tục sinh
trưởng và phân chia để cho 4, 8, 16 tế bào…
Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là N
o
thì sau n lần phân
chia ta sẽ có số tế bào tổng cộng là N :
N = N
0
. 2
n
(1)
Các giá trị N và N
0
có thể xác định nhờ phòng đếm hoặc tính số
khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc. Còn giá trị n (số thế hệ) có thể tính

nhờ logarid thập phân:
logN = logN
0
+ n. log2
⇒ n =
2log
)log( NoN −
(2)
Giả sử vi khuẩn phân chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian
giữa 2 lần phân chia liên tiếp (hoặc thời gian cần cho việc phân đôi tế bào)
gọi là thời gian thế hệ và được biểu thị bằng g:
g =
n
t
=
0
1
loglog
2log).(
NN
tt
−
−
(3)
Ở đây t = t
2
– t
1
biểu thị sự sai khác giữa thời gian đầu (t
1

) và thời
gian cuối (t
2
) tính bằng giờ. Giá trị đảo nghịch của thời gian thế hệ hay là
số lần phân chia sau một đơn vị thời gian (tức sau 1 giờ) gọi là hằng số tốc
độ phân chia C:
C =
t
n
=
2log).(
loglog
12
0
tt
NN
−
−
(4)
Rõ ràng thời gian thế hệ càng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng và sinh
sản càng nhanh. Từ công thức (4) ta có:
n = ct (5)
Thay giá trị của n vào phương trình (1) ta có:
N = N
0
.2
ct
(6)
Hằng số tốc độ phân chia C phụ thuộc vào một số điều kiện: loài vi
khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy.

3. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi tĩnh

92
3.1 Quá trình sinh trưởng
Nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta
không thêm vào chất dinh dưỡng cũng không loại bỏ đi các sản phẩm cuối
cùng của trao đổi chất (quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng
không gian nhất định). Sự sinh trưởng trong một “hệ thống đóng” hay “hệ
kín” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc không những đối với các
cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarid số lượng tế bào theo thời
gian gọi là đường cong sinh trưởng (hình 4.1).












02468
4
6
8
10
12

logN
t(h )
Hình 4.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn
Pha la
g

Pha
logarid

Pha ổn đ
ị
nh
Pha tử
vong

Quá trình sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong hệ kín trải qua các
giai đoạn :
* Pha lag (pha mở đầu = pha tiềm tàng)
Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc
độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là
chưa có khả năng sinh sản) nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ
rệt do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (protein,
enzyme, acid nucleic ) diễn ra mạnh mẽ.
Độ dài của pha lag phụ thuộc trước hết vào tuổi của ống giống và
thành phần môi trường. Thông thường tế bào càng già thì pha lag càng dài.
Rõ ràng nguyên nhân của pha lag là sự khác biệt giữa các tế bào ở pha ổn
định (hoặc bào tử) với các tế bào đang sinh trưởng logarid. Trong pha lag
diễn ra việc xây dựng lại các tế bào nghỉ thành các tế bào sinh trưởng
logarid (hoặc sinh trưởng theo lũy thừa).

93
Khi chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid vào môi trường mới
khác với môi trường trước đó ta vẫn thấy có sự xuất hiện pha lag. Nguyên
nhân của pha lag trong trường hợp này chính là sự thích ứng của vi khuẩn
với điều kiện nuôi cấy mới; sự thích ứng đó có liên quan đến việc tổng
hợp các enzyme mới mà trước đây tế bào chưa cần. Các enzyme mới này
được tổng hợp nhờ sự cảm ứng của các cơ chất mới.
Ví dụ: Nếu chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid từ môi
trường khoáng - glucose sang môi trường khoáng - maltose ta sẽ thấy xuất
hiện pha lag, đây là thời gian cần cho việc hình thành enzyme maltase (α-
glucozidase).
Đặc trưng của hiện tượng sinh trưởng kép là đường cong sinh trưởng
gồm hai pha lag và hai pha log. Sau khi kết thúc pha log thứ nhất tế bào lại
mở đầu pha lag thứ hai và tiếp tục pha log thứ hai (hình 4.2).

Hình 4.2 Đường cong sinh trưởng kép
E. coli trong môi trường hỗn hợp glucose - sorbitol (bên trái)
Aerobacter aero
g
enes tron
g
môi tr
ư
ờn
g
hỗn hợ
p
mu
ố
i ammon và

Hiện tượng sinh trưởng kép thường gặp khi nuôi cấy vi khuẩn trong
môi trường chứa nguồn carbon gồm một hỗn hợp của hai chất hữu cơ khác
nhau. Khi sinh trưởng tế bào sẽ đồng hóa trước tiên nguồn carbon nào mà
chúng “ưa thích” nhất. Đồng thời cơ chất thứ nhất này đã kìm hãm các
enzyme cần cho việc đồng hóa cơ chất thứ hai. Chỉ sau khi nguồn carbon
thứ nhất đã cạn thì nguồn carbon thứ hai mới có thể cảm ứng tổng hợp nên
các enzyme cần trong việc chuyển hóa nó.
Hiện tượng sinh trưởng kép không chỉ hạn chế ở các nguồn carbon
và năng lượng mà thấy ở các nguồn nitơ và phôtpho. Chẳng hạn
Aerobacter aerogenes có thể sử dụng nguồn nitơ là amino acid, muối
ammon và nitrate. Nếu khi cấy chuyển vi khuẩn từ môi trường nước thịt
sang môi trường chứa muối ammon hoặc nitrate thì pha lag sẽ biểu hiện.

94
Nếu từ môi trường nước thịt sang môi trường chứa hỗn hợp cả hai loại
muối sẽ thấy có hiện tượng sinh trưởng kép. Các ion NH
4
+
được đồng hoá
trước đồng thời kiềm chế việc tổng hợp cảm ứng enzyme nitrate -
reductase. Chỉ sau khi hết muối ammon trong môi trường thì muối nitrate
mới được sử dụng.
Sinh trưởng kép là hiện tượng phổ biến và có thể giải thích bằng cơ
chế kiềm chế nói chung và đặc biệt bằng hiệu ứng glucose.
* Pha logarid (pha log)
Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa,
nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình:

N = N
o
.2
ct

hay X= X
o
.e
ut

Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý nói
chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được
coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”.
* Pha ổn định (pha cân bằng)
Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số
tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào sống
không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ
cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn
toàn) tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Do đó việc chuyển từ
pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần.
Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản
phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid hữu cơ) và việc cạn
chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất).
Nguyên nhân thứ nhất rất phức tạp và khó phân tích, nguyên nhân thứ hai
đã được nghiên cứu kĩ hơn.
* Pha tử vong
Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa
(mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào
bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Ở các vi khuẩn sinh bào tử quá
trình phức tạp hơn do sự hình thành bào tử.

Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha tử vong. Sự chết của tế
bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự
phân. Do sức sống lớn bào tử bị chết chậm nhất (trong những điều kiện
thích hợp như khô và nhiệt độ thấp bào tử có thể có khả năng sống vài
trăm năm). Nguyên nhân của pha tử vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên

95
quan đến điều kiện bất lợi của môi trường. Trong trường hợp môi trường
tích lũy các acid nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ hiểu. Nồng
độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt
tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến
sự chết của hàng loạt tế bào. Ngoài đặc tính của bản thân chủng vi khuẩn,
tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến
tiến trình của pha tử vong.
Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong
như deaminase, decarboxylase, các amylase và protease ngoại bào. Ngoài
chức phận xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ
yếu xúc tác cho quá trình phân giải.
Tốc độ tử vong của tế bào có liên quan trực tiếp đến thực tiễn vi sinh
vật học và kĩ thuật, đó là vấn đề bảo quản các chủng vi sinh vật quan trọng
về mặt lí thuyết (các chủng và các biến chủng đặc biệt) và kĩ thuật (các
chủng sinh chất kháng sinh, amino acid, vitamin với sản lượng cao).
Ngoài khả năng sống ta còn cần bảo quản cả các đặc tính di truyền của vi
khuẩn với nhiều phương pháp bảo quản khác nhau, nhưng tất cả đều nhằm
làm giảm trao đổi chất đến tối thiểu chủ yếu bằng cách giảm nhiệt độ và
độ ẩm
4. Các thông số của đường cong sinh trưởng
Sản lượng tế bào được tính bằng hiệu giữa khối lượng cực đại (X
max
)

và khối lượng ban đầu (X
0
) khi nuôi cấy vi khuẩn (tính bằng gam):
X = X
max
- X
0
Tỷ số giữa sản lượng tế bào (X) với lượng cơ chất đã được dùng
(S) (tính bằng đơn vị trọng lượng) gọi là hệ số kinh tế (Y).
Y =
S
X

Nếu sản lượng tính bằng gam và cơ chất đã dùng tính bằng mol thì
gọi là hệ số kinh tế mol (Y
m
).
Hệ số kinh tế mol (Y
m
) cho phép ta liên hệ sản lượng tế bào với số
lượng ATP thu được do phân giải một lượng cơ chất nào đó. Ta có thể tính
được sản lượng tế bào (tính bằng gam) cho 1 mol ATP đã tiêu thụ. Đại
lượng này gọi là hệ số năng lượng (Y
ATP
). Hệ số năng lượng được tính dễ
dàng nếu ta biết con đường phân giải của loại cơ chất và năng lượng ATP
sinh ra do sự phân giải ấy.
Hằng số tốc độ sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong pha log được
tính theo công thức:

96
μ =
)(
lnln
0
0
tt
XX
t
−
−
=
)(lg
lglg
0
0
tte
XX
t
−
−

Trong công thức: X
0
và X
t
là mật độ huyền phù tế bào tại các thời
điểm t
0
và t, và lge = 0.43429.

Thời gian của pha lag (T
1
).
Đây là một thông số quan trọng để xem xét tính chất của vi khuẩn và
môi trường nuôi cấy có thích hợp hay không. Thông số này được xác định
bằng hiệu giữa thời điểm t
r
(tại đây huyền phù tế bào có mật độ xác định
nào đó x
r
) và t
i
(tại đây khối tế bào có thể đạt đến mật độ mà sau đó nếu
đem nuôi cấy thì chúng bắt đầu pha log ngay).
T
1
= t
r
– t
i
= t
n
-
μ
0
lnln xx
r
−

Vì T

1
chỉ thuận lợi để so sánh 2 giống với cùng tốc độ sinh trưởng
log giống nhau, nên người ta thường biểu thị thời gian của pha lag không
phải thời gian tuyệt đối, mà là thông qua thời gian sinh lý (thời gian của
1lứa g). Hiệu giữa sự sinh trưởng thực tế và lý thuyết là L = T
1
x v.
Đại lượng L chỉ cho biết giống phát triển trong thực tế chậm hơn
phát triển theo lý thuyết bao nhiêu thế hệ tại thời điểm cuối pha lag và
chuyển vào đầu pha log. Thông số này thường dùng để so sánh các số liệu
nói về ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác nhau, các chất ức chế sinh
trưởng và điều kiện nuôi cấy.
5. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi liên tục
Trong phương pháp nuôi cấy tĩnh nói trên, các điều kiện môi trường
luôn luôn thay đổi theo thời gian, mật độ vi khuẩn tăng lên còn nồng độ cơ
chất giảm xuống. Vi khuẩn phải sinh trưởng và phát triển theo một số pha
nhất định, sinh khối đạt được không cao. Tuy nhiên trong nhiều nghiên
cứu và thực tiễn sản xuất ta cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện
ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong pha
log. Dĩ nhiên trong một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần
(qua những khoảng thời gian ngắn) vào môi trường dinh dưỡng mới.
Nhưng đơn giản hơn, người ta đưa môi trường dinh dưỡng mới vào bình
nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi
khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong
chemostas và turbidostas.
Cơ sở của phương pháp nuôi liên tục: giả sử ta có một bình nuôi cấy
trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng phát triển. Cho chảy liên tục vào bình
môi trường mới có thành phần không đổi. Thể tích bình nuôi cấy được giữ

97

không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi
trường đi ra với cùng một tốc độ.
Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó
tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị
sự thay đổi thể tích sau một giờ).
Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi
bình nuôi cấy với thể tích:
v
-
= -
dt
dX
= D.X
Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính:
X = X
0
. e
-Dt
Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình biểu thị bởi
phương trình:
v
+
=
dt
dX
= μ.X
Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình tăng theo phương trình:
X = X
0
. e

μt
Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong
nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa độ tăng v
+
và độ giảm v
-
:
v = v
+
- v
-
=
dt
dX
= (μ - D).X
Nếu μ > D => v > 0: mật độ vi khuẩn trong bình tăng.
Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm.
Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời
gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học.
Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu
được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường
xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian.
Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào,
trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và
không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc
nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện
quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp.
Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể
duy trì được điều kiện μ = D.
Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh

trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong. Mỗi pha

98
sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất định. Việc điều
khiển tự động khó thực hiện.
Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến
việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây trong phạm
vi nhất định bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện môi trường
không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động (hình 4.3).


Turbidost
Chemosta













Hình 4.3 Nuôi cấy liên tục trong chemostas (trái) và
turbidostas (phải)

V. Sự kìm hãm sinh trưởng và sự diệt khuẩn

1. Các phương pháp khử trùng
1.1. Khử trùng bằng nhiệt
- Khử trùng bằng phương pháp Pasteur
Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới
100
0
C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các môi trường dễ bị
hỏng khi đun sôi như sữa, bia, rượu vang Khử trùng kiểu Pasteur có thể
ở 60
0
C trong 30 phút hoặc 75
0
C trong 15 phút hay 80
0
C trong 10 phút.
- Khử trùng bằng cách đun sôi
Người ta dùng nồi Koch hay nồi Arnola để khử trùng. Nồi hấp được
cấu tạo bằng thùng hai vỏ kim loại. Nước ở thùng ngoài được đun sôi, hơi
nước sẽ vào thùng trong. Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 100
0
C. Ở

99
nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng
nảy mầm. Ngoài phương pháp trên người ta còn có thể đun sôi trực tiếp
các dụng cụ bằng kim loại, cao su, kim tiêm và xylanh trong thời gian
khoảng 10 phút.
- Khử trùng bằng phương pháp hấp gián đoạn

Các môi trường dinh dưỡng, các ống bằng cao su và một số dụng cụ
dễ bị hỏng khi khử trùng ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần phải khử trùng bằng
cách đun sôi lặp lại 3 lần trong 3 ngày kế tiếp nhau. Lần đun thứ nhất
trong 30 - 45 phút làm cho các tế bào sinh dưỡng đều bị chết, nhưng bào
tử vẫn còn sống. Sau đó để môi trường, dụng cụ đã khử trùng vào tủ ấm
28 - 30
0
C. Ở nhiệt độ này trong môi trường thích hợp, các bào tử sẽ nảy
mầm. Trong lần khử trùng thứ hai các tế bào vừa mới nảy mầm lại bị tiêu
diệt. Để đảm bảo hoàn toàn vô trùng ta tiếp tục khử trùng lần thứ 3 trong
ngày thứ 3 kế tiếp.
- Khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave)
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng
hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1atm. Nồi hấp áp lực cao làm bằng kim loại,
có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi
để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. Thùng khử trùng có nắp van
thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xì hơi
khi áp suất quá mức cần thiết và để nồi khỏi bị nổ. Khoảng trống giữ hai
lớp vỏ là ngăn chứa hơi nước được nối với phểu. Nước trong nồi phải đủ
đến mức quy định đã khắc trên ống đo nước, phía trên của thùng có lỗ để
đưa hơi nước vào thùng trong. Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van
xung quanh.
Chuẩn bị môi trường để khử trùng: các dụng cụ chứa môi trường chỉ
được chứa đến 2/3 thể tích và nút kín bằng nút bông. Nút bông không
được chặt quá để khỏi ngăn cản sự cung cấp ôxy cho vi sinh vật và không
lỏng quá dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường, đáy nút
bông phải gọn tròn không dài quá hoặc ngắn quá. Khi phân phối môi
trường tuyệt đối không để môi trường dính vào miệng ống nghiệm, bình
hay nút bông. Dụng cụ xếp vào nồi khử trùng phải ngay ngắn, không xếp
quá sít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua. Khi khử trùng bằng nồi áp lực

cao, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo.
Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý pH của môi trường, pH dưới
5,5 thạch bị thủy phân và khi nguội không có khả năng tạo gel. Nếu môi
trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramen hóa đường. Để
tránh các hiện tượng trên, trong khi khử trùng phải để môi trường có pH
trung tính, sau khi khử trùng phải trung hòa lại môi trường đến mức pH

100
cần thiết. Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 30
0
C trong
2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng.
- Khử trùng bằng sức nóng khô
Cách khử trùng này tiến hành trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 170
0
C
trong 2 - 3 giờ. Ở điều kiện này các tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi
sinh vật đều bị tiêu diệt. Cách khử trùng này được sử dụng để khử trùng
các dụng cụ thủy tinh. Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần
được nút kín bằng nút bông. Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói
kín bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra.
- Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa
Cách khử trùng này dùng để khử trùng que cấy vi sinh vật, các dụng
cụ bằng sắt (kim, kẹp, gắp, dao, kéo ), một số dụng cụ thủy tinh (đũa
thủy tinh, que gạt ). Muốn khử trùng ta đưa đi đưa lại nhiều lần dụng cụ
trên ngọn lửa đèn cồn, bằng cách này mọi vi sinh vật bám trên bề mặt
dụng cụ đều bị tiêu diệt.
1.2. Khử trùng không bằng nhiệt
- Dùng nến lọc vi khuẩn
Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumine trong môi trường dễ

bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách
lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. Các lỗ của màng lọc nhỏ hơn kích thước
của tế bào vi khuẩn. Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là loại lọc seltz,
loại này có 2 bộ phận. Một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa
dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới. Hai bộ phận được gắn vào
nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc. Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa
2 bộ phận một màng lọc tròn bằng amian hay bằng nitrocellulose dày
khoảng 3 - 5cm (màng lọc chỉ dùng một lần).
- Khử trùng bằng hóa chất
Hóa chất được dùng để khử trùng bảo quản nguyên vật liệu và để
làm sạch phòng thí nghiệm, bệnh viện. Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý tới
nồng độ thích hợp, không gây độc đối với con người. Sàn nhà, bàn ghế
trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0,5 -
3%, hoặc nước phenol 3 - 5%. Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ
thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thuỷ tinh
- Khử trùng bằng tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời
Tia tử ngoại có bước sóng 13 - 400 nm đều có tác dụng diệt khuẩn.
Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử
ngoại trong khoảng 30 - 40 phút.

101
Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 - 400 nm cũng có tác dụng diệt
khuẩn. Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng
cụ của phòng thí nghiệm 2 - 3 giờ sau khi đã được rửa sạch.
2. Các phương pháp bảo quản
1. Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào
thạch. Sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +4
0
C.
Phương pháp này đơn giản nhất và thường được dùng nhưng kém hiệu quả

nhất.
2. Bảo quản dưới dầu vô trùng: dầu paraffin vừa ngăn cản môi
trường khô vừa làm giảm trao đổi chất gây cản trở sự xâm nhập của ôxy.
3. Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng: do cấu trúc lí - hóa cát
và đất sét đều là những vật chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là
các bào tử. Sau khi làm khô không khí cát (hoặc đất sét) cùng với vi khuẩn
có thể bảo quản tế bào rất lâu.
4. Đông khô: là phương pháp hoàn thiện và có hiệu quả nhất. Vi
khuẩn được trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh ) rồi làm
lạnh và làm khô nhờ băng khô. Sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn giữ
được khả năng sống mà không bị biến đổi về di truyền.
5. Bảo quản trong glycerine (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-60
0
C
hay - 80
0
C): đây là phương pháp rất thích hợp nhưng cần mua được loại
ống nhựa chịu nhiệt (khi khử trùng).

Câu hỏi ôn tập chương 4

1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật?
2. Các cơ chất dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh
vật?
3. Cơ chế và tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên sinh trưởng và
phát triển của vi sinh vật?
4. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật, điểm khác biệt của phương
pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục?
5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đường cong sinh trưởng, hiện tượng
sinh trưởng kép?