KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes








Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: Trần Hạnh Triết

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************










NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Nguyễn Ngọc Hải Trần Hạnh Triết








Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005


3
LỜI CẢM TẠ


Tôi xin chân thành cảm tạ:

 Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho
tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng
 TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp
 Phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh
 Phòng phân tích hóa lý – Trung tâm phân tích thí nghiệm, Trƣờng đại học Nông
Lâm
 Những anh chị lớp Thú y K26; các bạn lớp Chăn nuôi K27 đã thực hiện khóa luận
tốt nghiệp cùng thời gian với tôi tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng
đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong
thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập
 Ba mẹ đã luôn động viên, chăm lo cho con trong suốt thời gian thực hiện đề tài













4
TÓM TẮT
TRẦN HẠNH TRIẾT, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN
CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus
sporogenes”.

Hội đồng hƣớng dẫn:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các chủng vi khuẩn L. sporogenes phân
lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA). Bƣớc đầu, chúng tôi tìm hiểu về đặc điểm
hình thái vi/đại thể và sinh hóa của vi khuẩn. Sau đó, tiếp tục khảo sát những đặc tính
khác: khả năng sinh acid lactic trong môi trƣờng 10% sữa đặc có đƣờng; khả năng
hình thành bào tử trong hai loại môi trƣờng nuôi cấy MRSA và GYE, hai điều kiện
nhiệt độ - thời gian 37
0
C/6 ngày và 37
0
C/2 ngày chuyển sang 50
0
C/2 giờ và 70
0
C/2
giờ. Những khảo sát về mặt sinh trƣởng và phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng
dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L. sporogenes sau này.
Những kết quả đạt đƣợc:
1. Đã phân lập đƣợc vi khuẩn L. sporogenes
2. Vi khuẩn L. sporogenes có khả năng sản sinh acid lactic nhƣng hàm lƣợng
không cao (0,144 – 0,342 g/100 ml môi trƣờng sữa)
3. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào
tử (37
0
C/6 ngày và 37
0
C/2 ngày → 50
0

C/2 giờ → 70
0
C/2 giờ) ảnh hƣởng không có
ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát















5
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .............................................................................................................................. iii
Tóm tắt .................................................................................................................................. iv
Mục lục ................................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................... viii
Danh sách các bảng ............................................................................................................... ix
Danh sách các hình................................................................................................................ ix
Danh sách các sơ đồ ............................................................................................................... x

1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích .................................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu ...................................................................................................................... 1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................................. 2
2.1. Tổng quan về probiotic ............................................................................................. 2
2.1.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................... 2
2.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic ............................................................. 2
2.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme ................................... 2
2.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B ......................................................... 2
2.1.2.3. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột .............................................. 3
2.1.2.4. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất .................................. 3
2.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch ............................................................ 4
2.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi ........................ 4
2.1.3.1. Trong nƣớc .......................................................................................... 4
2.1.3.2. Thế giới ............................................................................................... 5
2.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes ................................................................... 5
2.2.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................ 5

6
2.2.2. Đặc điểm phân loại ........................................................................................ 5
2.2.3. Đặc điểm phân bố .......................................................................................... 6
2.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................. 6
2.2.4.1. Tế bào sinh dƣỡng ............................................................................. 6
2.2.4.2. Bào tử ................................................................................................ 8
2.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi
khuẩn Lactobacillus khác .......................................................................................... 9
2.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất .......................................................... 10
2.2.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu ................................................. 13

2.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác
trong ứng dụng làm probiotic ................................................................................... 15
2.2.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes ........................................ 18
3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM............................................................ 19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ............................................... 19
3.1.1. Thời gian ....................................................................................................... 19
3.1.2. Địa điểm ........................................................................................................ 19
3.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 19
3.2.1. Mẫu khảo sát ................................................................................................. 19
3.2.2 Môi trƣờng ..................................................................................................... 19
3.2.3. Hóa chất......................................................................................................... 19
3.2.4. Thiết bị – dụng cụ ......................................................................................... 19
3.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 19
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................. 20
3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài ............................................................ 20
3.4.2. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 20
3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào .................................................. 21
3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa ........................................................... 22
3.4.3.Khả năng sinh acid lactic ................................................................................ 22
3.4.3.1. Định tính ............................................................................................ 22
3.4.3.2. Định lƣợng ......................................................................................... 23

7
3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử .................................................................................. 24
3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 27
4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................................... 28
4.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes ........................................................... 28
4.1.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 28
4.1.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes ..................................................... 28
4.1.2.1. Quan sát khuẩn lạc ......................................................................... 28

4.1.2.2. Quan sát hình thái tế bào ................................................................ 29
4.1.2.3. Quan sát hình thái bào tử................................................................ 29
4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes ...................................................... 29
4.2. Khả năng sinh acid lactic ......................................................................................... 31
4.2.1. Định tính ....................................................................................................... 31
4.2.2. Định lƣợng ................................................................................................. 32
4.3. Khảo sát khả năng hình thành bào tử ......................................................................... 34
5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................... 36
5.1. Kết luận..................................................................................................................... 36
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 36
6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 37

PHỤ LỤC











8
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ctv Cộng tác viên
CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên
FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và
dƣợc phẩm của Mỹ

GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức
khỏe
MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar
GYE Glucose Yeast Extract
SD standard deviation, độ lệch chuẩn





















9
DANH MỤC CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus ........ 6

Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus ...................... 6
Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và
Lactobacillus ..................................................................................................................... 7
Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với
Bacillus .............................................................................................................................. 8
Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus .......................................... 11
Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus ...................... 12
Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus ............. 17
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L. sporogenes . 24
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes .......................................................... 28
Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm . 30
Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa .......... 31
Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất ............. 33
Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát ......... 34
DANH MỤC CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử ........................................................................................ 8
Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic ............................................................................ 11
Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol ................................................ 14
Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE ................................. 38
Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi .... 29
Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes ................... 31
Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes .................................... 32
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

10
SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu ................................... 13
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes ........... 20
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes .............................................. 20

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa ............................ 21
Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa ......................................................... 22
Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner ................................................................ 23
Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes....... 25























11
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy
đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức
tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp
thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với
những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành
quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi.
Hiện nay, bệnh đƣờng tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các
nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những
tác dụng phụ. Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học)
ngày càng đƣợc chú trọng. Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các
enzyme của chúng. Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại
hệ vi sinh vật đƣờng ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trƣởng của thú nuôi.
Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng. Trong đó, nhóm vi
khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ
cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dƣỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt
tính ổn định. Nhờ vậy mà L. sporogenes ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất
chế phẩm sinh học.
1.2. Mục đích
Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để
sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic).
1.3. Yêu cầu
Phân lập các chủng L. sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn.
Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy
thay đổi.




12
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.3. Tổng quan về probiotic
2.3.1. Định nghĩa về probiotic
Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô
tả những yếu tố kích thích sinh trƣởng do vi sinh vật tạo ra [4]. Những nghiên cứu tiếp theo
giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic. Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ
probiotic đƣợc hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hƣởng có lợi đối với
động vật và ngƣời bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đƣờng
ruột vật chủ [4]. Những vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống
trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2].
2.3.2. Các chức năng sinh học của probiotic
2.3.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme
Vi sinh vật đƣờng ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự
tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất
dinh dƣỡng trong khẩu phần nhƣ: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ
hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng nhƣ: amylase, protease, cellulase… Nhóm
này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas,
Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,…
Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu
phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu
và Mn cho gà đẻ [2].
Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt
làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hƣởng phần nào lên sức đề
kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất.
2.3.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B
Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B6, B12 và
vitamin K ở manh tràng và đại tràng.

13
Bản thân tế bào nấm men có chứa một lƣợng dinh dƣỡng rất cao bao gồm: protein,
lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trƣởng và

sức đề kháng.
2.3.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất
Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác
dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt tính
urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH
3

trong phân gia súc, gia cầm [27]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy
một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên cứu cho
thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc đƣợc sinh ra trong quá trình tiêu hóa nhƣ:
indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp
cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trƣờng.
2.3.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột
Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt
thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đƣờng tiêu hóa
khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Việc bổ sung probiotic giúp
duy trì hệ vi sinh vật đƣờng ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng.
Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất
dinh dƣỡng và khối lƣợng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu
chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh nhƣ E. coli,
Salmonella typhimurium [7, 19, 29]. Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây
bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng.
Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của
của probiotic. Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do
chúng tạo ra nhƣ: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin,… Lactocidin
có phổ kháng khuẩn rất rộng. Các acid acetic và lactic làm giảm pH đƣờng ruột khiến
môi trƣờng đƣờng ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh Gr (-).
Một số bacteriocin thƣờng gặp nhƣ: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra),
nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium sinh ra),…L.

14
acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus khác và
acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh [6, 34].
2.3.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch
Yếu tố đƣợc xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của
vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan. Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất
muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào [32]. Saarela và ctv (2000) cho rằng
khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tƣơng tác giúp probiotic tiếp xúc
với hệ thống lympho đƣờng ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn
dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [28].
2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi
2.3.3.1. Trong nƣớc
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi
sinh vật có lợi cho đƣờng ruột ở nƣớc ta không ngừng phát triển. Kết quả của các
nghiên cứu tìm hiểu ảnh hƣởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn
thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế… đƣợc ứng dụng trong
chăn nuôi ngày càng rộng rãi. Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia:
Sữa chua và canh trùng B. subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con
(Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hƣng, 1962)
Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột trên gia súc (Lê
Thị Tài và ctv, 1968 – 1978) [3].
Chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn
con (Phan Thanh Phƣợng và ctv, 1979 – 1984)
Các chế phẩm trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đƣờng ruột ở heo và tác
dụng điều tiết kích thích sinh trƣởng của chế phẩm
Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac
(Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu
chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con).
Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trƣờng Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành
công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu

chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi.

15
Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl (Bacillus subtilis) đã
sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên ngƣời và gia súc.
2.3.3.2. Thế giới
Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, ngƣời ta hƣớng vào việc phân lập và
chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đƣa vào đƣờng ruột, nâng cao sức
chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đƣờng ruột cho ngƣời, động vật nuôi, nhất
là trẻ sơ sinh, ngƣời già và thú non.
Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nƣớc khác trên thế giới đã sản xuất những chế
phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị
bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của ngƣời và vật nuôi nhƣ: Biozim, Rozim F - 3C,
Lactopure, NatureFlora,…
2.4. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes
2.4.1. Lịch sử phát hiện
L. sporogenes lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1933 bởi L.M. Horowitz-
Wlassowa và N.W. Nowotelnow. Vào thời gian đó, vi khuẩn đƣợc phân loại và mô tả
nhƣ sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị khí
tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974).
Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans [8].
Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tƣơng
đồng về DNA đã khẳng định L. sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus.
Năm 1967, L. sporogenes đƣợc xếp lại vào giống Lactobacillus.
2.4.2. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại nhƣ sau:
Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus
Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus sporogenes

2.4.3. Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn L. sporogenes có mặt trong các sản phẩm đồ hộp. Chúng phân bố tƣơng
đối rộng rãi trong tự nhiên.
2.4.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

16
2.4.4.1. Tế bào sinh dƣỡng
Hình thái
Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L.
sporogenes có những nét tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus (xem
Bảng 2.1 và 2.2)
Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và
Lactobacillus [35]
Điểm tƣơng đồng Chi tiết
Hình dạng khuẩn lạc -Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm
-Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, lấp lánh, không tạo
sắc tố.
Hình dạng tế bào -Hình que thon, dài
-Kích thƣớc: 0,3 - 0,8 µm 3,0 - 5,0 µm
-Tròn ở đầu tận cùng

Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus [35]
Điểm khác biệt Chi tiết
Hình dạng khuẩn lạc -Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhăn.
Hình dạng tế bào -Bacillus luôn có dạng hình que thẳng, trong khi
Lactobacillus còn có dạng hình que uốn cong.
-Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của
L. sporogenes có ở một đầu tế bào.

Các đặc điểm sinh trƣởng phát triển và sinh hóa
Tƣơng tự nhƣ hình thái, những điểm tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt
Bacillus về mặt sinh trƣởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes đƣợc trình bày ở
Bảng 2.3 và 2.4

17
Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L.
sporogenes và Lactobacillus [35]
Điểm tƣơng đồng Chi tiết
Môi trƣờng nuôi cấy -Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để
phát triển nhƣ: carbonhydrate (để lên men),
peptone, chiết thịt, chiết nấm men.
-Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp: MRSA có bổ sung
nƣớc ép cà chua
a
.
pH tối ƣu 5,5 - 6,8
Nhiệt độ tối ƣu 30 - 45
0
C
Một số phản ứng sinh hóa -Không thủy phân tinh bột, casein.
-Không hóa lỏng gelatine
-Indole (-)
-Không sinh gas hay H
2
S
-Không có menaquinones
Khả năng lên men đƣờng -Sản xuất acid khi lên men các loại đƣờng: lactose,
arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose,
fructose, maltose, sucrose và trehalose.

-Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose,
sucrose, trehalose và lactose.
Một số đặc điểm khác -Gram (+)
-Hiếu khí hay kị khí tùy ý

Lƣu ý:
(a) L. sporogenes cũng phát triển tốt trong môi trƣờng GYE (glucose yeast extract agar).
Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L.
sporogenes so với Bacillus [35]
Điểm khác biệt Chi tiết
Môi trƣờng nuôi cấy Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus

18
Một số phản ứng sinh hóa Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-)
trong khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+)
Khả năng lên men đƣờng Bacillus không lên men đƣợc lactose

2.4.4.2. Bào tử
Hình thái
Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium. Bào
tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dƣỡng, có kích thƣớc 0,9 - 1,21,0 - 1,7 µm .
Cấu tạo chi tiết của bào tử L. sporogenes đƣợc mô tả theo Hình 2.1.

Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử. Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng
ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dƣới màng trong (cortex), màng vỏ
của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập
vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast),
vật chất nhân (nuclear material) [15, 39].
Khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ nhiệt độ, pH, môi trƣờng dinh dƣỡng không phù
hợp,… L. sporogenes từ dạng tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử.

Đặc tính
o In vitro

19
Bào tử L. sporogenes bền với nhiệt và những điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt
khác. Chúng vẫn sống ngay cả sau khi đã xử lý ở 100
o
C trong 20 phút trong dung dịch
đệm phosphate ở pH 7. Bào tử nảy chồi trong dịch canh chứa malt ngay cả khi có HCl
pha loãng (pH 4,6 – 5,6), dịch NaOH (pH 7,6 – 9,6), dịch muối (nồng độ 5%, 10%,
20%), dịch acid boric 2,5% và nƣớc cất. Bào tử chịu đƣợc kháng sinh 2 – 8 lần so với tế
bào dinh dƣỡng [12].
o In vivo
Khi qua đƣờng miệng, bào tử đƣợc hoạt hóa và hồi sinh trong môi trƣờng acid của
dạ dày - ruột với pH thấp nhờ hoạt động đánh khuấy hóa học của dạ dày và môi trƣờng
nƣớc trong dạ dày. Các lớp màng (coat) hút nƣớc và trƣơng phồng lên. Sự gia tăng hàm
lƣợng nƣớc làm tăng tỉ lệ trao đổi chất của vi khuẩn trong bào tử, chồi hình thành và ló
ra ngoài lớp màng của bào tử. Tại tá tràng, bào tử không còn nữa, các tế bào nảy chồi
chuyển thành tế bào sinh dƣỡng. Chúng nhân lên rất nhanh trong ruột non. Thông
thƣờng, sự nảy chồi diễn ra khoảng 4 giờ sau khi bào tử đi vào qua đƣờng miệng. Tế
bào sinh dƣỡng nhân đôi sau mỗi 30 phút. Các tế bào này cố định trên bộ máy tiêu hóa
và tiếp tục hoạt động trao đổi chất, sản xuất acid lactic và bacteriocin. Điều này tạo một
môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột [13].
2.4.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và
các vi khuẩn Lactobacillus khác
Vi khuẩn L. sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều đặc
tính và chức năng sinh học của Lactobacillus. Những đặc tính và chức năng này đều có
ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic.

2.4.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả năng
chữa bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trƣờng sữa
đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau:
Phân giải protein
Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các polypeptide
mạch ngắn.

20
Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng.
Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn
dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng: trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời
già hay gia súc non.
Phân giải lipid
Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng
triglyceride thành các acid béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh
dƣỡng đối với ngƣời và vật nuôi.
Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus
phân giải đƣợc cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [25, 26] và muối mật
[14]. Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng.
Phân giải đƣờng lactose
Lactobacillus mang enzyme beta - galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase
(LDH) có tác dụng chuyển hoá đƣờng lactose thành acid lactic. Đây là một acid hữu cơ
có những đặc tính sinh học đặc biệt.
o Vai trò của acid lactic [5]
Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ƣu điểm sau:
 Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón
 Tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe
 Kích thích sự tiết dịch vị
 Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày
 Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp

Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng
Lactobacillus làm probiotic. Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus
sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic (xem Hình 2.3). Ở
ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột.

21

D(-) acid lactic L(+) acid lactic
Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic.
L (+) acid lactic: đƣợc chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng
hợp glycogen.
D (-) acid lactic: đƣợc chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ đƣợc bài tiết
dƣới dạng urine. Sự hiện diện của acid không đƣợc chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ
gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh. Một số
loài Lactobacillus, tiêu biểu là L. acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về
mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm đƣợc sử dụng trong nhiều liệu pháp.
Vì vậy, xu hƣớng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả
năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe. Đại diện tiêu biểu thỏa mãn
yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes.
Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đƣờng ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của
vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế.
Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn
Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt
khuẩn trực tiếp [23, 31]. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức
chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa.


Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus
Tên bacteriocin Loài sản xuất
Acidolin L. acidophilus

Acidophilin L. acidophilus
Lactacin B L. acidophilus

22
Lactacin F L. acidophilus
Bulgarin L. bulgaricus
Plantaricin SIK-83 L. plantarum
Plantaricin A L. plantarum
Lactolin L. plantarum
Plantaricin B L. plantarum
Lactolin 27 L. helveticus
Helveticin J L. helveticus
Reuterin L. reuteri
Lactobrevin L. brevis
Lactobacillin L. brevis

Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối
nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H
2
O
2
, CO
2
và diacetyl.
Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33]
Sản phẩm trao đổi chất Tác dụng
1.Carbon dioxide Ức chế sự khử nhóm carboxyl?
Làm giảm tính thấm của màng tế
bào?
2. Diacetyl Tƣơng tác với các protein gắn kết

arginine
3. Hydrogen peroxide /
Lactoperoxidase
Oxi hóa những protein cơ bản

2.4.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu
Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời
xa xƣa ở Trung Cận Đông. Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi
khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và
tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1).

23

Các lợi ích về mặt dinh dƣỡng
Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lƣợng ăn vào tăng lên khi cho
ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp
vitamin B. Hàm lƣợng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thƣờng cao hơn
trong sữa tƣơi. Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng
tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16].
Các lợi ích về mặt trị liệu
Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những
rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh
hepatic encephalopathy, ung bƣớu, lƣợng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm
Lactobacillus
Trị liệu
Dinh dƣỡng
Phục hồi cân
bằng hệ vi sinh
vật đƣờng ruột
Giải độc tố

Cải thiện tình
trạng không dùng
đƣợc lactose
Tăng cƣờng
miễn dịch
Loại bỏ carcinogen
trong sản phẩm
cuối
Ngăn chặn sự
phát triển của
mầm bệnh trong
thực phẩm
Sản xuất
vitamin nhóm
B, K.
Tăng cƣờng
khả năng tiêu
hóa các chất
trong thực
phẩm và tăng
cƣờng những
hoạt tính sinh
học tự nhiên
của chất dinh
dƣỡng
Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu [35]

24
âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose (lactose
intolerance).

Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu. Cơ chế tác
động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể đƣợc biểu diễn nhƣ
Hình 2.5.

Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35]
Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lƣợng cholesterol gắn
cholesterol vào khoang ruột [17].
Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân
lactose thành acid lactic [21]. Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử
dụng đƣợc lactose ở những ngƣời thiếu enzyme lactase.
Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trƣờng
bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, lƣợng urase trong
ruột giảm và kéo theo lƣợng NH
3
trong máu. Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây
trở ngại cho NH
3
hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH
3
từ máu vào ruột
[24].
Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase,
azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai
trò trong việc hình thành và phát triển khối u. Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi
Chất béo trong khẩu phần
Nhũ hóa
Hấp thụ
Tổng hợp cholesterol
Muối mật
Lactobacillus ức

chế enzyme khử
hydroxymethyl
glutarate CoA,
enzyme này hạn
chế tốc độ tổng
hợp cholesterol
Lactobacillus
kết hợp với
muối mật để
ngăn cản
muối mật đi
vào vòng tuần
hoàn máu.

25
trƣờng acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn
trong ruột kết. Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18].
Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột,
Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy. Acid lactic cũng giúp tăng cƣờng nhu động
ruột nên chữa đƣợc chứng táo bón.
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả
năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A -
synthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận đƣợc lƣợng interferon tăng 65% ở những
ngƣời tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22].
Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men
glycogen thành acid lactic. Đây là môi trƣờng không thích hợp cho mầm bệnh phát
triển nhƣ Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),…
[30]
Khi dùng Lactobacillus kèm theo kháng sinh sẽ giúp ngăn ngừa các triệu chứng
trên. Lactobacillus thông qua các hoạt động trao đổi chất của mình: tạo acid lactic,

bacteriocin để cố định trong đƣờng ruột, âm đạo hay miệng và tạo môi trƣờng không
phù hợp cho mầm bệnh phát triển.
Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và
giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH
3
và hạn chế vi sinh
vật gây thối nhiễm vào đƣờng ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trƣởng ở
thú nuôi [11].
2.4.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus
khác trong ứng dụng làm probiotic
Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vƣợt trội hơn các vi khuẩn
khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tƣởng nhƣ:
Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể ngƣời và vật nuôi
Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho ngƣời và vật nuôi
Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đƣờng tiêu hóa để
ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập