Kỹ thuật phân tích Vi sinh - Nấm thực phẩm pdf

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate
Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn
hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và
thay đổi màu của chỉ thị màu
– Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37
o
C/24 h
– Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển
– Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu
• E. coli
• Enterobacter aerogenes
• Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển
• Âm tính: không đổi màu
2. Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo
phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn
hiếu khí và kỵ khí tùy ý
- Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H
2
O
2
.
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện
- Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả
3. Thử nghiệm Oxydase
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của
vi khuẩn
- Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và

Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+)
- Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc. Nhỏ
thuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine
dihydrochloride)
- Phản ứng dương tính: có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu
• Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p-
phenylenediamine dihydrochloride)
• Phản ứng dương tính: có màu tím.
• Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu.
1
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
4. Thử nghiệm phân giải Ure
Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia và
carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường.
– Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus.
– Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37
o
C/24 – 48 h
– Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ. Phản ứng âm
tính: không chuyển màu
• Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím
• Âm tính: không màu
5. Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương)
Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng
đông huyết tương thỏ
–Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh
– Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vi
khuẩn. Ủ ấm 37
o
C/4-24h

–Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không
thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính.
Dương tính: hình thành khối đông huyết tương
6. Thử nghiệm sinh Idol
Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển
hóa trypton tạo thành indol
- Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37
o
C/24 h
- Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu
đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal
dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản
ứng âm tính
- Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h
– Dương tính: màu đỏ cánh sen
– Âm tính: màu vàng
7. Thử nghiệm MR
Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid
bền.
- VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm
2
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản
phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung
tính)
- Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37
o
C từ 2-5 ngày
- Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có
màu đỏ, âm tính màu vàng

8. Thử nghiệm VP
Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3
butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành
diacetyl
– Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl –
guanidin có màu đỏ
– Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP. Ủ 37
o
C/24 – 48 h
– Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử
B( KOH 40%). Lắc nhẹ
– Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h
– Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường
9. Thử nghiệm lên men đường
Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn
đến thay đổi màu của môi trường
* PHƯƠNG PHÁP MPN:
- Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi
- Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ
37
o
C/24 – 48 h
- Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi
trường và có bóng hơi trong ống Durham
* Thử khả năng lên men đường
A. Lactose broth
• Escherichia coli
• Proteus vulgaris
• Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi
• Phản ứng âm tính: không đổi màu

• Sinh hơi ◊ hình thành bóng hơi trong ống durham
3
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
* LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H
2
S (TSI)
• Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose
• Cấy hai bước
- Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng
- Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37
o
C/24h
• Nếu chỉ lên men Glucose.
- Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu
nuôi cấy.
- Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone
◊ phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường)
- Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 ◊
phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng
* LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI
• Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose
- Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng
- Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi
trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong
điều kiện hiếu khí.
- Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch
- Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân
thạch có màu đen (H
2
S +)

10. Thử nghiệm khử nitrat
Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit
và ni tơ phân tử
- Một số vi khuẩn có khả năng khử NO
3
thành NO
2
và các hợp chất
chứa Nitơ khác như amonia (NH
3
) và khí Nitơ (N
2
)
NO
3
> NO
2
> NH
3
or N
2
- Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h. Sau đó nhỏ
thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid . Hai hợp chất này
kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính).
* Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử
nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat
dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau:
4
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành

nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính
- Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã
chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường)
11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu)
- Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy
trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba
dạng tan máu:
Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc
Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc
Tan máu (γ): không có vùng tan máu
12. Thử nghiệm khả năng di động
Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế
bào.
– Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch
mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37
o
C từ 18-24h
– Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh
đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch
13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin
Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng
gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28
o
C
• Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase
- Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14
ngày
• Phương pháp gelatin Strip
- Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay
đổi màu.

Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm
trong hai tuần.
5
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC
NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau
khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ±1
o
C trong thời gian từ 5 - 7 ngày. Số lượng
bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g(ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm
nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các
đậm độ pha loãng
PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
THIẾT BỊ - DỤNG CỤ
• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm
• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn.
• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1
o
C.
• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1
o
C.
• Tủ sấy khô.
• Nồi hấp áp lực .
• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml.
• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn .
• pH met hoặc giấy đo pH.
HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG
• Thạch dùng cho Vi sinh vật

• Pepton dùng cho Vi sinh vật
• Muối tinh khiết (NaCl)
• Glucoza tinh khiết
• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na
2
HPO
4
)
• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH
2
PO
4
)
• Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40%
• Axit xitric dung dịch 20%
• Dung dịch NaOH 0,1N
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ
• Chuẩn bị môi trường
6
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế
theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm
và được hấp tiệt trùng (110
o
C/30 phút hoặc 121
o
C/15 phút).
• Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
- Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều

kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
• Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm
lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml nước pepton, lắc đều 2-3 phút thu
được dung dịch mẫu thử 10-1.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
• Pha loãng mẫu
- Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton
nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men.
- Sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch, nếu cần tính tổng số cả
nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa
sẵn 9 ml nước pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp
tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. Pha loãng mẫu cho
đến khi có đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo
dự tính.
• Đổ đĩa:
- Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ
dùng 2 đĩa petri và một pipet đã tiệt khuẩn riêng.
- Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác
nhau cho vào giữa từng đĩa petri
- Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1
o
C trong điều kiện vô khuẩn,
điều chỉnh pH môi trường đến 4,5 - 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20%,
40% hoặc dung dịch axit xitric 20%
- Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với
môi ttrường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần
- Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang
- Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được

quá 30 phút
7
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
• Ủ ấm:
- Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1
o
C hoặc
khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày. Không lật ngược đĩa
- Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm
mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược
đĩa).
- Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
• Đọc kết quả
- Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ
5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả.
- Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng
càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành
lại các bước nuôi cấy.
TÍNH KẾT QUẢ
a. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N)
bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược
trên các đĩa theo công thức sau:
ΣC
N =
(n
1
+ 0,1.n
2
) d
- C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn

- n
1
,n
2
: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đẫ chọn thứ 1 thứ 2
- d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1
(Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa)
b. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị
pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng
c. Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha lãng ban đầu
(10-1) có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết
quả theo trung bình cộng .
d. Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như
sau:
- Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng
- Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác.
d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu 10
-1
8
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
BÁO CÁO KẾT QUẢ
- Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết
quả tính được tổng số BT nấm men–nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml sản
phẩm kiểm tra
- Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của
phương pháp từ 12 đến 37% .
9
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

-Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau
khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ±1
o
C trong thời gian từ 24- 48 giờ. Số lượng vi
khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm
được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ
pha loãng.
PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
THIẾT BỊ DỤNG CỤ
Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm:
• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm
• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn.
• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1
o
C.
• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1
o
C.
• Tủ sấy khô.
• Nồi hấp áp lực .
• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml.
• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn .
• pH met hoặc giấy đo pH.
HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG
• Thạch dùng cho vi sinh vật
• Pepton dùng cho vi sinh vật
• Muối tinh khiết (NaCl)
• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4)
• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4)
• Natri hydroxit tinh khiết (NaOH)

• Cao thịt.
• Cao men
• Trypton
• Glucose tinh khiết
10
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ
• Chuẩn bị môi trường
- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế
theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm
và được hấp tiệt trùng (110
o
C/30 phút hoặc 121
o
C/15 phút).
• Chuẩn bị mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện
vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
• Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm
lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml pepton, lắc đều 2-3 phút thu được
dung dịch mẫu thử 10-1.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
• Pha loãng mẫu
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa
sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp
tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo
• Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi
đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng.
• Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ

khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa
petri
• Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1
o
C trong điều kiện vô
khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung
dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi
chiều 3 lần.
• Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
• Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không
được quá 30 phút
• Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt
thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên
bề mặt
• Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 ± 1
o
C từ 24- 48 giờ.
11
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
ĐỌC KẾT QUẢ
• Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc
trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ
số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
• Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng
càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến
hành lại các bước nuôi cấy.
TÍNH KẾT QUẢ
Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc của hai đậm độ pha loãng liên tiếp
để tính kết quả
N =

TÍNH KẾT QUẢ
• C:Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
• n
1
,n
2
: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ
hai
• d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất
• Sau đó làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu
thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số
mũ thích hợp của 10).
VD:
- Ở đậm độ pha loãng 10
-2
có 150 và215 khuẩn lạc
- Ở đậm độ pha loãng 10
-3
có 16 và 25 khuẩn lạc
150+215+16+25
N = = 18480 = 1,8 x 104 CFU/g/ml
(2+0,1 x 2) x 10
-2

* Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị
pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng, VD
- Ở đậm độ pha loãng 10
-2
có 180 và 250 khuẩn lạc
- Ở đậm độ pha loãng 10

-3
có 60 và 75 khuẩn lạc
12
dnn
C
).1,0(
21
+
∑
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10
-2
)để tính kết quả.
180 + 250
N = = 21500
2 x 10-2
Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm
* Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu
(10
-1
) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn
lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm. VD
- Ở đậm độ pha loãng 10
-1
của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc
- Ở đậm độ pha loãng 10
-2
có 6 và 7 khuẩn lạc
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10
-2

để tính kết quả.
12 + 8
N = = 100
2 x 10-1
Kết quả :1,0 x 102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm
* Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như
sau:
- Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng
- Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác
d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (thường là10
-1
)
BÁO CÁO KẾT QUẢ
• Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả
tính được số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm
tra
• Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của
phương pháp từ 12 đến 37%
13
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS
KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN)
Định nghĩa Coliform cổ điển
Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas
- Escherichia coli
- Klebsiella
- Enterobacter
- Citrobacter
Sinh acid và gas do lên men lactose ở 37°C: 95% là coliform
Sinh acid và gas ở 44°C : 90 % là E.coli

Định nghĩa Coliform mới
- Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas
(24-48h/36±2°C)
- Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C;
bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân
tryptophan tạo thành Indol)
Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh
14
Enzyme based methods
• Escherichia coli
• Klebsiella
• Enterobacter
• Citrobacter
• Yersinia
• Serratia
• Hafnia
• Escheri
chia coli
• Klebsiel
la
•Enterobacter
• Citrobacter
• Yersinia
• Serratia
• Hafnia
Acid production from lactose
• Escher
ichia coli
• Klebsiella
• Enterobacter

• Citrobacter
Old defnition duction from
lactose
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Coliforms – Nơi cư trú và phát triển
Khái niệm chung
- Trực khuẩn Gram âm
- Không sinh bào tử
- Kỵ khí không bắt buộc
- Lên men Lactose
Vai trò
- Chỉ điểm sự nhiễm phân
- Đánh giá tình trạng vệ sinh nước và vệ sinh môi trường
Nguyên lý phương pháp
- Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí khi nuôi cấy trong
môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30°C và phù hợp trong phép thử khẳng
định
Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Tài liệu trích dẫn: TCVN 4882 : 2001
Dụng cụ - Thiết bị
- Máy đồng nhất mẫu
- Tủ sấy 180 – 200°C
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 30 ±1°C
- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm
Nhóm coliform bao gồm cả VSV sống tự do
và trong đường ruột động vật
Fecal coliform chỉ phát triển ở
đường ruột động vật máu nóng
•E. coli chỉ phát triển ở đường

ruột động vật.
15
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml
- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C
- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm
- pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C
- Ống Durham
Môi trường
- Dung dịch pepton – muối
- Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc)
- Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth –
môi trường thử khẳng định)
Các bước tiến hành
 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:
- Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung
dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10
-1
). Từ đó pha
loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng
các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
- Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml sản phẩm ban đầu cho vào bình đã có sẵn
90ml nước pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu. Từ đó pha
loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng
các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
 Cấy mẫu và ủ ấm:
- Canh thang tăng sinh nồng độ kép:
Dùng pipet vô trùng hút 10 ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc
10ml đậm độ 10

-1
(sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng
sinh chọn lọc. Mỗi mẫu cấy 3 ống.
Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C
/ 24h ± 2h
- Canh thang tăng sinh nồng độ đơn:
Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1ml
đậm độ pha loãng 10
-1
(sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang
tăng sinh chọn lọc. Mỗi đậm độ cấy 3 ống.
Tiến hành tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo(nếu có). Trộn đều
mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C / 24h ±
16
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
2h. Nếu sau 24h mà thấy môi trường không đục hoặc không sinh khí thì để
tiếp 24h ± 2h nữa và quan sát lại.
 Phép thử khẳng định:
Từ mỗi ống canh thang tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc nồng độ kép
đã nuôi cấy có hiện tượng đục và sinh khí cấy chuyển sang một ống môi
trường thử khẳng định, mỗi ống cấy một ăng( một vòng que cấy). Ủ ấm ở
30°C / 24h ± 2h. Quan sát lần 1 mà không đục hoặc không sinh khí thì để
thêm 24h ± 2h nữa và quan sát lại
Biểu thị kết quả
- Lựa chọn các độ pha loãng
Trường hợp 1: có ít nhất một độ pha loãng cho ba ống dương tính
VD: 3 3 2 1 0
Trường hợp 2: Không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính
VD: 2 2 1 1 0
Các trường hợp đặc biệt

VD: 3 3 0 0 0
2 2 0 1 0
- Xác định chỉ số MPN
- Tính số có xác suất lớn nhất
Nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn.
Với nồng độ kép:chia chỉ số MPN cho 10.
17
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
HÌNH THÁI
• Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.8-1.0 μ
• Đứng riêng rẽ, thành đôi, hoặc tụ thành đám như chùm nho.
• Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động
• Không sinh nha bào
• Bắt màu Gram dương
ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY
• Hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy
thông thường
• Phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (từ 10
– 45
o
C).
• Trong môi trường canh thang, sau 5 – 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi
trường, sau 24 giờ, môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều
nhưng nếu để lâu, canh thang trở nên trong, bề mặt có váng mỏng, dễ
lắng xuống.
• Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển
mạnh, khuẩn lạc dạng S, trơn, lồi, sáng bóng, bờ đều, có sắc tố vàng
nhạt hoặc vàng thẫm. Sắc tố có thể thay đổi khác nhau, nhiều chủng
màu da cam, những chủng kháng kháng sinh sắc tố thường màu vàng,

mọc nhiều trên thạch, đục, trơn, ẩm ướt và trắng, vàng hoặc da cam.
• Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan
máu và có sắc tố vàng.
TÍNH CHẤT SVHH
• Lên men sinh acid các đường glucoza, lactoza, maltoza và manitol.
• Không lên men sinh axit các đường arabinoza, inositol, raffinoza,
rhamnoxa hoặc xyloza.
• Không thủy phân Esculin và tinh bột, khử nitrat, thuỷ phân arginin,
gluamat và khử nhóm cacboxyl của lysin (có men lysin
decacboxylase).
• Sinh ra proteaza, lipaza, phosphataza,. Một số chủng sinh ra
lecithinaza.
• Tất cả các chủng đều sinh ra coagulaza, ít nhất có 3 yếu tố tan huyết
(α, β và δ).
• Thường gặp tan máu β bởi các chủng phân lập từ động vật.
18
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
• Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 30-37
o
C, pH là 7.0-7.5.
Enzym
• Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ. Nó là một protein
vững bền với nhiệt độ, tính chất kháng nguyên yếu, có thể gây thành
huyết cục trong tĩnh mạch, yếu tố để tạo nên nhiễm khuẩn huyết.
• Fibrinolysin: đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người. Men này làm
tan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc mạch
nhỏ tạo ra nhiễm khuẩn di căn.
• Desoxyribonuclease: là men có thể thuỷ phân AND, có thể gây ra tổn
thương các tổ chức
• Hyaluronidase: gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự thuỷ

phân của acid hyaluronic
• Penicillinase: tụ cầu gây bệnh có thể tiết ra men này làm mất tác dụng
của Penicillin
ĐỘC TỐ
Độc tố tan máu (hemolysin) có ba loại chính:
- Độc tố tan máu α, gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37
o
C. độc tố này
gây hoại tử da và gây chết, là ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao
và có thể trở thành giải độc tố.
- Độc tố tan máu β có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 40C, ít độc hơn
độc tố α.
- Độc tố tan máu δ có tác dụng lên hồng cầu người đã rửa và gây hoại
tử da.
- Độc tố diệt bạch cầu(Leucocidin): làm bạch cầu mất tính di động và bị
phá huỷ nhân.
- Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột
cấp. Các độc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra, gồm bốn loại,
trong đó mới có hai loại được biết rõ là: độc tố ruột A do chủng gây
nhiễm độc thức ăn, độc tố ruột B do chủng gây viêm ruột sinh ra
KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
• Các bệnh ngoài da: gây viêm nhiễm các vết xước tạo thành mụn, nhọt
đầu đinh, đinh râu…
• Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người đề kháng
yếu hoặc trẻ em. Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở
19
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
thành mạn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ…
• Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh thường xảy ra nhanh,
trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
• Do độc tố
• Triệu chứng: là nôn mửa, đau quặn bụng, mệt lả và đi ỉa lỏng. Những
triệu chứng này thường có trong một vài giờ và ít trường hợp kéo
nhiều ngày. Thường bệnh nhân hồi phục không có biến chứng.
• Liều gây bệnh: < 1,0 µg (>100 000CFU/g). Độc tố của tụ cầu rất bền
vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100
o
C trong 30 phút
nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt
trong quá trình chế biến.
• Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun
sôi ở 100
o
C trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào
sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến.
• Thời gian ủ bệnh: từ 1 -7h, thông thường 3 – 6h
• Thức ăn thích hợp cho tụ cầu phát triển và sinh độc tố: loại có độ ẩm
cao
• Những thực phẩm có nguy cơ cao ô nhiễm do tụ cầu là thịt và sản
phẩm thịt, gia cầm và trứng, các món xalat, rau trộn, sữa và sản phẩm
sữa…
NƠI CƯ TRÚ VÀ NGUỒN LÂY NHIỄM
• Trong đất, nước, các dụng cụ sản xuất, chế biến, cư trú ở người và
động vật (nguồn lây nhiễm quan trọng nhất)
• 50% người bình thường mang vi khuẩn này ở trong mũi họng. Vì thế
đầu móng tay thường nhiễm những vi khuẩn này.
• Trong quá trình chế biến, thực phẩm có thể bị ô nhiễm tụ cầu có thể
qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt là khi tay người chế biến có những vết
trầy xước hoặc có mụn mủ Nếu những thực phẩm này để hàng giờ ở

6.6
o
C, tụ cầu sẽ phát triển và sinh độc tố.
20
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS
1.Nguyên lý phương pháp
Dựa trên khả năng sinh Lecithinase phân giải Lecithin của
Staphylococcus aureus trên môi trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ
trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37
o
C/24 – 48h. Số lượng
Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được
tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản
ứng đông huyết tương dương tính.
2. Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm
và thức ăn chăn nuôi.
NỘI DUNG
1.Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy 180 – 200
o
C
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 25 ±1
o
C
- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm
- Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml
- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1
o

C
- Máy đếm khuẩn lạc
- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm
- pH met hoặc giấy đo pH
2.Dung dịch pha loãng, môi trường, hoá chất
• Nước đệm pepton
• Môi trường Bair parker
• Dung dịch Kali Tellurit 1%
• Dung dịch sulphamezatin (sulphadimidin, INH) 0,2%
• Dung dịch Natri pyruvat 20%
• Dung dịch lòng đỏ trứng
• Canh thang tim óc ( Brain Heart Infusion)
• Huyết tương thỏ
21
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
3.Các bước tiến hành
3.1 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:
Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml mẫu thử cho vào bình 90ml nước đệm
pepton(đậm độ 10
-1
). Từ đậm độ này pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy
từng mẫu thử.
• Sản phẩm dạng khác: caan 10g mẫu thử cho vào 90 ml nước đệm
pepton (đậm độ10
-1
). Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng
mẫu thử.
3.2 Cấy mẫu
• Sản phẩm dạng lỏng: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml

mẫu thử ban đầu. Lặp lạii với các đậm độ pha loãng khác.
• Sản phẩm dạng khác: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml
đậm độ pha loãng ban đầu (đậm độ 10
–1
) Lặp lại với các đậm độ pha
loãng khác.
• Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm
càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô.
• Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào tủ
ấm 35-37 ± 1
o
C/ 24-48h
3.3 Đếm khuẩn lạc
• Chỉ tính những đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc.
• Đếm tất cả những khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường
kính từ 1-1,5 mm, bao quanh bởi một vùng đục sát khuẩn lạc và vùng
trong phía bên ngoài) và không điển hình (không có vùng trong).
3.4 Thử khẳng định
• Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, mỗi
khuẩn lạc cho vào một ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi ở 35-
37
o
C/20 -24h
• Cho 0,1ml môi trường đã nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để ở
35-37
o
C / 4-6h. Phản ứng được coi là dương tính khi phần đông huyêt
tương chiếm 1/2 thể tích dung dịch.
22
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

23
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase
đã nhận dạng trên mỗi đĩa
b
c

b
nc
a = C
c

+ C
nc
A
c

A
nc
• A
c
là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase
• A
nc
là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase
• b
c
số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với
coagulase
• b

nc
số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương
tính với coagulase
• C
c
là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa
• C
nc
là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa
Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã
nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử
24
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Σa
N =
V (n
1
+ 0,1 n
2
) d
• Σa là tổng số khuẩn lạcc Staphylococci có phản ứng dương tính với
coagulase được nhận dạng có mặt trong mẫu thử
• V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
• n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất
• n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai
• d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn
(huyền phù ban đầu là một độ pha loãng)
4 Biểu thị kết quả
• Độ pha loãng 10
-2

Đĩa 1: 65 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=65
Đĩa 2: 85 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=85
• Độ pha loãng 10
-3

Đĩa 1:3 KLĐH, 3KL có coagulase(+), a=3
Đĩa 2: 7 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=7
N= 65+85+3+7/0,1(2+ 0,1x2) 10
-2
= 57272
= 5,7 x 104 CFU/g(ml)
CHUẨN BỊ DUNG DỊCH LÒNG ĐỎ TRỨNG
• Dung dịch Kali Tellurit
- Kali Tellurit 1g
- Nước cất VT 100ml
Làm ấm để hòa tan, bảo quản 0-5
o
C/vài tháng
• Dung dịch Natri Pyruvat
- Natri Pyruvat 20g
- Nước cất VT 100ml
25