Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào bảo quản chủng vi sinh vật

1

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu và các Thầy Cô khoa Chế Biến, trường Đại Học Thuỷ Sản
Nha Trang đã tận tình giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức quý báu
trong thời gian em học tại trường.

PGS.TS Lê Văn Hiệp – Viện Trưởng Viện Vacxin Nha Trang, người đã tạo
điều kiện và giúp đỡ em hoàn thiện tốt đồ án này.

ThS. Nguyễn Công Bẩy - Tổ trưởng tổ kiểm vi, phòng kiểm định, Viện
vacxin Nha Trang, người đã tận tâm chỉ bảo, động viên khuyến khích và giúp đỡ
em trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu để hoàn thành đồ án.
Các anh chị công tác tại Tổ kiểm vi, phòng kiểm định Viện Vacxin Nha
Trang đã nhiệt tình cộng tác giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
suốt quá trình em thực hiện đồ án.


H ThÞ Kim Thy






PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

2

mơc lơc
trang
MỞ ĐẦU 1
PHẦN THỨ NHẤT – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
I. KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ 3
1.1. Lịch sử ra đời của kỹ thuật đông khô 4
1.2. Nguyên lý đông khô 4
1.2.1. Sự thăng hoa 4
1.2.2. Chân không 6
1.2.3. Áp suất bay hơi 6
1.2.4. Áp suất chân không 7
1.2.5. Áp suất an toàn 7
1.2.6 Áp suất báo động 8
1.2.7. Các tá chất sử dụng trong đông khô 9
1.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô 9
1.3.1. Giai đoạn làm đông 9
1.3.2. Giai đoạn làm khô 15
PHẦN THỨ HAI - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 21
I. Đối tượng 21
1.1. Máy đông khô Epsilon 2-6 D, hãng Christ 21
1.2. Chủng vi sinh vật 21
II. Vật liệu 21
2.1 Dơng cơ, m¸y mc 21
2.2. M«i tr-ng, ha cht, dung dÞch 22
2.3. Tá chất sử dụng trong đông khô
III. Phương pháp nghiên cứu 22
3.1. M« h×nh nghiªn cu 22

3.2 Thời gian nghiên cứu 22
3.3. Mô hình nghiên cứu 22
3.4 Ph-¬ng ph¸p kiĨm tra ® sng 23
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

3

3.5. Phương pháp đông khô chủng 24
3.6. phương pháp kiểm tra độ ẩm tồn dư 26
3.7. phương pháp kiểm tra chân không 26
3.8. Ph-¬ng ph¸p xư lý s liƯu 27
PHẦN BA - KẾT QUẢ 28
A. KẾT QUẢ 28
I. Các thông số kỹ thuật của quy trình đông khô chủngVSV 28
1.1. Thời gian đông khô chủng 28
1.2. Điểm đông và nhiệt độ đông… 29
1.3. Thay đổi áp suất, nhiệt độ và hình thái vật lý của sản phẩm trong quá
trình đông khô…… 30
II. Kết quả kiểm tra chất lượng trước và sau đông khô chủng 31
2.1. Độ sống của chủng trước và sau đông khô 31
2.2. Kết quả kiểm tra độ ẩm tồn dư 32
2.3. Mức độ hư hỏng sản phẩm do quá trình đông khô 33
2.4. Kết quả kiểm tra độ chân không sau đông khô 33
B. BÀN LUẬN 34
I. Thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô 34
1.1. Thời gian đông khô 34
1.2. Điểm đông và nhiệt độ sản phẩm 35
1.3. Thay đổi áp suất chân không, nhiệt độ sản phẩm và hình thái vật lý 35
1.4. Nút cao su và nút nhôm 36
II. Kết quả đông khô chủng VSV 37

2.1. Độ sống…………… 37
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

4

2.2. Tá chất 37
2.3. Độ ẩm tồn dư, sản phẩm hỏng với thời gian đông khô 38

PHẦN THỨ TƯ -KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
A. KẾT LUẬN 39
1. Các thông số của kỹ thuật đông khô 39
2. Đông khô chủng VSV 39
B. ĐỀ NGHỊ 40
tµi liƯu tham kh¶o
PHỤ LỤC
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
MỞ ĐẦU

Đông khô, là một kỹ thuật tiên tiến để bảo quản các mẫu vật phẩm, được áp dụng
một cách rộng rãi trong nhiều ngành và lĩnh vực khác nhau như y học, công nghệ vi sinh
vật, công nghệ phóng xạ hạt nhân, khảo cổ học, nông nghiệp, bảo quản thực phẩm .
Càng ngày, đông khô càng được ứng dụng nhờ những đặc tính ưu việt vượt trội, mang
lại hiệu quả kinh tế cao. Nhờ sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, công nghệ đông khô đã
có sự phát triển vượt bậc, kỹ thuật đông khô ngày càng hiện đại, rút ngắn thời gian đông
khô,giảm tỷ lệ hư hỏng sản phẩm. Chi phí về nhân công giảm bớt đáng kể nhờ sự tự
động hóa và đơn giản hóa, góp phần hạ giá thành sản phẩm.
Công tác bảo quản chủng giống vi sinh vật có một ý rất lớn trong các phòng
nghiên cứu và trong công nghệ vi sinh vật. Việc bảo quản không chỉ đơn thuần giữ
chủng sống, mà phải duy trì được những đặc tính ban đầu, không bị thay đổi tính chất.

Vì quan trọng như vậy, nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia,
thành lập các trung tâm giữ giống như American type Culture Collection - ATCC – Mỹ,
National Collection of Type Cultures –NCTC – Anh, Korean Collection of Type
Cultures – KCTC – Hàn Quốc, Japan Collection of microorganisms – JCM – Nhật .
Có rất nhiều phương pháp bảo quản chủng giống vi sinh vật khác nhau. Tuỳ theo mục
đích và thời gian bảo quản mà ta có thể áp dụng các hình thức bảo quản thích hợp như:
cấy truyền, bảo quản trong lạnh thông thường, đông băng. Để bảo quản lâu dài thì cách
tốt nhất là đông khô.
Ở Việt Nam, đông khô đã được ứng dụng từ lâu, trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như đông khô sữa, chất phóng xạ, thực phẩm và sản phẩm nông nghiệp khác. Trong công
nghệ vi sinh vật, đông khô được sử dụng phổ biến để giữ những chủng quý hiếm
Trong 10 năm(1986-1995) phòng gốc giống viện Vacxin đã giữ chủng vi khuẩn
đông khô và hình thành hệ thống lô giống cho việc sản xuất các Vacxin tả, thương hàn,
bạch hầu- ho gà – uốn ván đạt tiêu chuẩn quốc tế. Các chủng vi sinh vật khác rất cần
được bảo quản lâu dài bằng kỹ thuật đông khô, nhằm duy trì và phát triển hệ thống
chủng giống phong phú của Viện.
4 chủng vi sinh vật mới được Trung tâm Kiểm định Quốc gia cung cấp cho Viện
Vacxin để phục vụ cho công tác kiểm định. Các chủng này có hồ sơ đầy đủ, nhưng số
lượng mỗi chủng chỉ có 2 ống. Để có đủ số lượng chủng cho những năm tiếp theo thì cần
nhân chủng và bảo quản bằng phương pháp thích hợp.

Vì thế, mà em tiến hành đề tài “ Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào
bảo quản chủng vi sinh vật”.

Với hai mục tiêu sau:

1. Tìm hiểu kỹ thuật đông khô

2. Anh hưởng của kỹ thuật đông khô đến độ sống của chủng vi sinh vật.

Để thực hiện được mục tiêu trên, các nội dung cần phải tiến hành nghiên cứu là:

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
Nội dung 1: Tiến hành đông khô 4 chủng hiện có tại Tổ kiểm vi.

Nội dung 2: Kiểm tra độ sống của chủng vi sinh vật trước và sau khi đông khô.

Nội dung 3: Kiểm tra độ ẩm tồn dư sau đông khô.

Nội dung 4: Kiểm tra độ chân không sau đông khô.

Trong nghiên cứu, trình độ và kinh nghiệm thực tế của em có hạn, chắc chắn không
tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong quý Thầy cô đóng góp ý kiến bổ sung hoặc chỉ ra
những chỗ cần sữa chữa để đồ án của em hoàn thiện hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành tốt đồ án này.




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
PHẦN THỨ NHẤT.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I. KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ
1.1. Lịch sử đông khô:
Altmann (1890) làm khô các mô ở –20
O

C và chân không để nghiên cứu về lịch sử,
ông giấu 40 năm sau, khi chết mới công bố
Shackell (1909) là người đầu tiên đông khô thành công ở thực phẩm và huyết
thanh.
Hai ông Predtets Chensky (1912) Griorowitch đã lặp lại thành công kỹ thuật này.
Tival (1927) ở Pháp và Elser (1934) ứng dụng rộng rãi vào công nghệ. Elser
(1935) báo cáo về đông khô huyết thanh.
Flosdorf-Mudd (1935) mô tả rộng rãi phương pháp ở Mỹ và Greaves (1939) ở
Anh. Các ông này vạch ra khả năng ứng dụng đông khô huyết thanh cho lâm sàng và
đông khô bổ thể (1940).
Stobes (1943) tóm lược lý luận và có nhiều kết quả nghiên cứu đi sâu vào phương
pháp này.
Đông khô chủng vi khuẩn do Schackell – Hammer (1911) Swift (1921) Brown
(1932) Flosdorf –Mudd (1938) Stamp (1947) Sordelli –Greaves (1944) phát triển kỹ
thuật, chế tạo dụng cụ và chọn tá dược.
Hêthrington – Craig trong labor Difco (mỹ) ứng dụng đông khô môi trường nuôi
cấy thành công (1939- 1940).
B.Gorsy là người dùng máy đông khô huyết thanh và chủng giống vi khuẩn đầu
tiên ở Viện HUMAN (Hungary) vào năm 1940 với máy Flosdorf –type.
Sau hai thập kỷ 50-60 phát triển kỹ thuật đông khô với nhiều bước tiến vượt bậc
và xác lập thành lý thuyết công nghệ đến từng chi tiết (Ở Pháp có Rey là người đóng góp
nhiều công sức để ứng dụng đông khô cho thực phẩm).
Tuy giámáy đông khô và các trang thiết bị cao, song kỹ thuật đông khô có nhiều
hứa hẹn khi ứng dụng đông khô chủng giống VSV, chế phẩm miễn dịch, vacxin - huyết
thanh, dược phẩm cao cấp và cả thực phẩm quý hiếm nữa.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8

1.2. Nguyên lý đông khô

Huyền dịch vi khuẩn được làm đông, nước sẽ chuyển thẳng từ trạng thái rắn sang
trạng thái khí và thăng hoa nhờ máy hút chân không tạo ra áp suất thấp ở nhiệt độ rất
thấp.[1].
Theo nguyên lý này tế bào vi khuẩn được làm khô mà vẫn giữ nguyên hình thái.
Khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc bằng một dung dịch thích hợp thì tế bào lại trở lại
trạng thái ban đầu.
1.2.1. Sự thăng hoa [14].
Trong quá trình đông khô thì sản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không
(nhỏ hơn 6.11 mbar) và hơi nước bay ra từ sản phẩm sẽ được ngưng tụ tại bề mặt (rất
lạnh) của bộ ngưng tụ (ice condenser). Bộ ngưng tụ hoạt động như máy bơm hơi nước,
máy bơm chân không để giữ áp suất chân không trong khoang.
Nhưng để thăng hoa được thì sản phẩm phải được cấp nhiệt (theo nguyên lý nhiệt
học thì bay hơi thì thu nhiệt). Khi đông khô ví dụ như các bình to đáy tròn thì nhiệt độ
phòng chính là nguồn nhiệt cung cấp cho sản phẩm. Nếu đông khô các lọ nhỏ trong khay
thì nhiệt cấp cho sản phẩm là từ các giá đỡ sản phẩm(giá sản phẩm điều khiển được nhiệt
độ).
Khoảng 90-99 % lượng nước được lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đông khô
chính (main drying), lượng nước liên kết trong sản phẩm còn lại sẽ được lấy ra trong quá
trình đông khô cuối cùng (final drying) dưới áp suất chân không rất thấp.

1.2.1 Sự thăng hoa
- Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6.11 mbar và cố định thì khi thay đổi nhiệt độ,
nước sẽ tồn tại ở ba trạng thái.
+ lỏng
+ rắn
+ khí
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
- Tại áp suất chính xác 6.11 mbar và nhiệt độ 0
o

C thì nước sẽ tồn tại cả ở ba trạng
thái rắn, lỏng, khí (điểm cắt của ba trạng thái).
- nếu áp suất nhỏ hơn 6.11 mbar thì nước sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và
ngược lại bằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí được
gọi là thăng hoa).

1.2.2. Chân không [15]
Định luật khí lý tưởng p × V = m × R
m
× T = const.
p = áp suất khí (Pa), 10
5
Pa = 1 bar
V = thể tích (m
3
)
m = khối lượng (kg)
R
m
= R/M,

R: hằng số khí lý tưởng = 8,314J/mol× k,
M = khối lượng trên mol [g/mol], H
2
O = 18
T = nhiệt độ (K)
Ví dụ: 1,0 gam đá tại áp suất
1,0 mbar, thu được 1 m
3
hơi

0,1 mbar, thu được 10 m
3
hơi
0,01 mbar, thu được 100 m
3
hơi
Khi ở áp suất chân không rất sâu thì sẽ có một lượng rất lớn hơi nước tạo ra, nhưng
không nhất thiết phải giảm nhanh lượng nước trong mẫu
1.2.3 Ap suất bay hơi [15]
Ap suất bay hơi là lực bay hơi của một chất lỏng. Nó bằng hàm của nhiệt độ T và
loại chất, đơn vị là (Pa), 10
5
Pa = 1 bar khi nhiệt độ tăng thì áp suất bay hơi sẽ tăng.
Đường cong áp suất bay hơi miêu tả sự chuyển đổi trạng thái rắn, lỏng, khí có dạng
logarithmic. [14]


1.2.4 Ap suất chân không : [16]
Đ
ộ
chân không t
ố
t:
-
áp su
ấ
t bay h
ơ
i th
ấ

p và

- lượng hơi nước tạo ra nhiều
Rắn

Tan
chảy

Lỏng

Thăng hoa

Điểm cắt 3

Bay hơi

Tạo khí

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10

Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định độ chân không và nhiệt độ
khô. Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm được điều chỉnh chủ yếu bởi áp suất chân
không (mà không bởi nhiệt độ giá) theo áp suất bay hơi của nước.
Nhiệt độ bề mặt sản phẩm gần như độc lập với nhiệt độ giá. Trong quá trình khô thì phải
đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy nhiệt độ khô nên thấp hơn ít nhất nhiệt độ
đông 10
o
C. Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ dàng tra được áp suất chân không khô theo
bảng đường cong áp suất bay hơi. [14]

Ví dụ :
Nhiệt độ đông : t
eu
= -10
o
C
Nhiệt độ khô : t
dry
= -20
o
C
⇒Ap suất chân không : P
dry
= 1, 030 mbar.
1.2.5 Ap suất an toàn :
Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phải đặt áp suất an toàn. Nếu áp suất
trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất an toàn) thì nhiệt độ của giá cấp cho
sản phẩm phải được dừng và quá trình thăng hoa chậm lại, tránh được sự tan chảy của
sản phẩm. Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn 5
o
C so với điểm tan chảy (hay điểm đông) [14].
Theo đường cong áp suất bay hơi dễ dàng tìm được P
safe.

Ví dụ :
Nhiệt độ đông t
eu
=-10
o
C

Nhiệt độ khô t
dry
= -20
o
C
Ap suất chân không P
dry
= 1, 030 mbar
Nhiệt độ an toàn t
saf
= -15
o
C
Ap suất chân không an toàn P
saf
= 1,650 mbar
1.2.6 Ap suất báo động:
Các máy lớn có giá điều nhiệt bằng chất lỏng thì có thể có hệ thống cảnh báo áp suất
báo động. Nếu áp suất trong buồng khô tăng tới giá trị đặt áp suất báo động thì máy sẽ cắt
cấp nhiệt cho sản phẩm. Bộ điều khiển sẽ cho ra âm thanh báo động và nhiệt độ giá được
làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đông càng nhanh càng tốt. Nhiệt độ báo động nên thấp hơn
nhiệt độ đông từ 3
o
C. (5
o
C)[14].
Nhiệt độ đông t
eu
= -10
o

C
Nhiệt độ khô t
dry
=-20
o
C
Ap suất khô P
dry =
1,030 mbar
Nhiệt độ an toàn t
saf
= -15
o
C
Ap suất an toàn P
saf
= 1,650 mbar
Nhiệt độ báo động t
alarm
= -13
o
C
Ap suất báo động P
alarm
=1,980 mbar
1.2.7 giới thiệu tá chất sử dụng trong kỹ thuật đông khô
Tá dược thường dùng:
. Cho vi khuẩn :
Sacarose :10 %
Gelatin 2%

Dextrose :7,5%
Huyết thanh ngựa, thỏ khử bổ thể
. Nấm men, mốc :
Sacarose 10%
Gelatin 1%
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11

Lactose 20%
. Virus :
Tá dược Eagles cho virus Dại :
Huyết rhanh bê 10 %
NaHCO
3
0,035%
Streptomycin 100µg/ml
Aureomycin 5µg/ml
Đơn giản hơn là
Huyết thanh ngựa 2% (An Độ)
Hoặc Glucose 10%
Hoặc Sữa phi kem 20%(ATCC Mỹ)
Huyết thanh :
Saccarose 10% [29].

1.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô [4], [11], [24], [30].
1.3.1. Giai đoạn làm đông
Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp xuống và những tinh thể rắn được hình
thành. Do đó, nếu làm đông nhanh thì tế bào ít bị tổn thương do kích thước tinh thể nhỏ,
còn nếu làm đông chậm thì tế bào dễ bị tổn thương do kích thước tinh thể lớn làm rách tế
bào.

Giai đoạn làm đông chế phẩm làm cho các phản ứng hoá học bị giảm thiểu đồng
thời làm ngưng hẳn các hoạt động xúc tác của các enzyme có trong tế bào VSV. Kỹ thuật
làm đông không chỉ tạo thể rắn cho chế phẩm mà quan trọng hơn là hình thành một trạng
thái kết tinh tối ưu có thể tránh được sự huỷ hoại chế phẩm trong giai đoạn nước chuyển
từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí[4].
* Hình thức làm đông
Trong quá trình làm đông chế phẩm chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn
theo hai hình thức cơ bản:
- hình thành ơtectic: đối với dung dịch đệm được làm đông đến một nhiệt độ nhất định
gọi là nhiệt độ ơtectic thì dung dịch chuyển sang pha rắn tức thời, ví dụ dung dịch NaCl
có nhiệt độ eutectic là –21,6
o
C, dung dịch CaCl
2
là –55
o
C.
+hình thành tinh thể: Đối với tố chất và thành phần hoạt tính của chế phẩm được làm
đông đến một nhiệt độ xác định thì dung dịch chuyển sang trạng thái kết tinh một cách
từ từ bằng cách tăng dần nồng độ rắn, độ nhớt trong dung dịch và trở nên cứng như chất
rắn.
Ở nhiệt độ –1
o
Cđến –4
o
C số tinh thể đá được tạo thành trong sinh phẩm rất ít, nên
có kích thước trung bình tương đối lớn. Ở nhiệt độ –10
o
C đến -40
o

C số tinh thể đá tạo
thành nhiều vô kể, nên kích thước rất nhỏ,khoảng từ 5-10 µ.m. Ở nhiệt độ –80
o
C thì
chất lỏng sẽ không tạo thành được tinh thể mà chỉ tạo đươc chất rắn vô hình định (dạng
thuỷ tinh thể).
Nhiều công trình nghiên cứu cho biết ở nhiệt độ cao hơn –30
o
C thì kích thước tinh thể
phát triển bình thường ra xung quanh, lớn dần chiều dài cũng như chiều ngang.Ở nhiệt
độ thấp hơn –30
o
C thì kích thước tinh thể đá chỉ phát triển theo chiều dài, nên tinh thể đá
trở thành sợi dài bao bọc xung quanh tế bào.Trong trường hợp này các tinh thể đá không
những không phá huỷ cấu trúc tế bào của chế phẩm mà bảo vệ toàn vẹn tế bào.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12

Sự khác biệt các thành phần trong chế phẩm đóng vai trò quyết định quá trình
làm đông.Do đó với mỗi loại chế phẩm thì có quy trình làm đông phù hợp nhằm tạo ra
chế phẩm đông khô đạt chất lượng [4].
* Điểm ơ tectic và nhiệt độ đông toàn phần.
- Ơtectic là cấu trúc tinh thể đá được hình thành có điểm tan chảy không đổi khả dĩ
thấp nhất.
- Trong chế phẩm mỗi thành phần có nhiệt độ đông (nhiệt độ ơtectic)riêng, ví dụ
NaCl là –21,6
o
C dextran là –10
0
C, gelatin là –11

o
C, glucose là –40
o

Nhiệt độ đông toàn phần của chế phẩm là nhiệt độ thấp nhất xác định được bằng thiết bị
đo,ví dụ nhiệt độ đông toàn phần của nước là 0
o
C, sữa là –13
o
C, vẵcin là –25
o
C.
Nhiệt độ đông toàn phần của chế phẩm được xác định bằng cách dựa vào giản đồ lý
thuyết đường biểu diễn nhiệt độ của các thành phần trong chế phẩm hoặc bằng thực
nghiệm dựa vào sự thay đổi điện trở xuất của chế phẩm theo nhiệt độ khi chuyển từ
trạng thái lỏng sang trạng thái rắn.
Cách đơn giản để xác định điểm đông toàn phần của chế phẩm là điểm giao nhau
của đường biễu diễn nhiệt độ và điện trở xuất.



Khi nhiệt độ đông hoàn toàn của chế phẩm được xác định thì nhiệt độ làm khô và
áp xuất chân không phải được xác định cho phù hợp. Để tránh hiện tượng tan chảy chế
phẩm trong suốt quá trình làm khô thì nhiệt độ làm khô (nhiệt độ làm khô cấp1) phải
thấp hơn nhiệt độ đông toàn phần ít nhất là 10
o
C.
* Tốc độ làm đông
Tốc độ làm đông là mối tương quan giữa nhiệt độ và thời gian. Tốc độ làm đông liên
quan đến hình thành cấu trúc tinh thể của chế phẩm khi chuyển từ trạng thái lỏng sang

trạng thái rắn. Tuỳ thuộc vào loại sản phẩm đông khô mà có tốc độ làm đông phù hợp để
tạo hình thái tối ưu cho quá trình làm khô.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13

Đối với chế phẩm phẩm đông khô là vi khuẩn thì tốc độ làm đông chậm nhỏ hơn hoặc
bằng 0,5
o
C /phút.
Chế phẩm là virut và các thành phần của virut thì tốc độ làm đông trung bình từ 0,5-
1,0
o
C / phút.
Còn đối với các loại tế bào khác thì tốc độ làm đông nhanh từ 1,0-3,0
o
C/phút.
Trong quá trình làm đông, tốc độ làm đông khác nhau thì chế phẩm có hình thái tinh thể
khác nhau.
- Tốc độ làm đông chậm (< 0,5
o
C /phút): chế phẩm tạo thành có kích thước tinh
thể lớn, số lượng tinh thể ít. Các tinh thể này sắp xếp theo chiều thẳng đứng từ dưới lên
trên,dạng này dễ thăng hoa và độ ẩm sau thăng hoa thấp.
- Tốc độ làm đông nhanh(1,0 - 3,0
o
C /phút): chế phẩm tạo nhiều tinh thể, tinh thể có
kích thước nhỏ. Các tinh thể này sắp xếp không theo một trật tự nào,dạng này khó đông
khô và ảnh hưởng đến độ ẩm sau đông khô. Những chế phẩm có độ nhớt cao thì khi làm
đông tạo nhiều tinh thể đá có kích thước rất nhỏ và khả năng thoát hơi nước kém trong
giai đoạn làm khô. Do đó, quá trình làm khô chậm lại và chế phẩm dễ bị thay đổi cấu

trúc.
Trong quá trình làm đông những chế phẩm có độ đặc càng cao thì nhiệt độ đông
toàn phần càng thấp và còn tồn tại một số vùng trong chế phẩm chưa đông hoàn toàn. Vì
vậy phải pha loãng huyền dịch trước khi tiến hành đông khô.


Khi nhiệt độ chế phẩm đạt 0
o
C (hình trên), huyền dịch chế phẩm vẫn còn ở trạng thái
lỏng (A). điểm đông bắt đầu hình thành với số lượng ít B. Các điểm đông phát triển tạo
tinh thể có kích thước lớn, số lượng tinh thể ít và sắp xếp theo hướng từ dưới lên trên
(C).
Tại (D) chế phẩm đông hoàn hoàn có cấu trúc ổn định. Cấu trúc này tạo điều kiện cho
quá trình thăng hoa và chế

Đồ thị 3. đông chậm vá quá trình kết tinh

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14



Khi nhiệt độ chế phẩm đạt 0
o
C (hình trên) điểm đông hình thành với số lượng
nhiều (A). các điểm đông bắt đầu phát triển lớn dần (B).Số lượng tinh thể nhiều, kích
thước nhỏ (C). tại điểm (D) sinh phẩm đông hoàn toàn.
Đến cuối giai đoạn làm đông yêu cầu chế phẩm phải đạt được một trạng thái phù
hợp nhất cho giai đoạn thăng hoa. Vì vậy nhiệt độ sau cùng của giai đoạn làm đông phải
đủ thấp khoảng –40

o
C đến –50
o
C và trong khi làm đông nhiệt độ chế phẩm được giảm
đều đặn với một tốc độ phù hợp tránh làm cho chế phẩm hóa rắn đột ngột.
Tốc độ làm đông quá nhanh sẽ không đủ thời gian để nước thẩm thấu ra ngoại
bào, do đó nước còn lại trong nội bào quá nhiều sẽ tạo thành những tinh thể đá làm phá
huỷ tế bào.
Ngược lại, tốc độ làm đông quá chậm thì nước thẩm thấu ra ngoại bào ở mức tối
đa, nên môi trường nội bào quá cô đặc làm phá huỷ tế bào.
Thực chất của quá trình đông khô diễn ra khi môi trường ngoại bào được làm đông. Khả
năng làm khô tế bào phụ thuộc vào tốc độ làm đông và khả năng thẩm thấu của tế bào.
*Giai đoạn làm khô.
Sau khi đạt được nhiệt độ đông và cấu trúc tinh thể phù hợp ở giai đoạn làm đông,
chế phẩm được làm khô bằng cách hấp thụ nhiệt lượng để chuyển các phân
tử nước từ dạng tinh thể thành hơi trong đều kiện chân không mà không qua trạng thái
lỏng gọi là quá trình thăng hoa.
*Giai đoạn làm khô cấp một.[11]
Ở giai đoạn này, nhờ máy hút chân không tạo môi trường áp suất thấp nên nước
sẽ chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng sau đó được
thăng hoa ra ngoài. Khi quá trình làm khô kết thúc thì toàn bộ nước tự do sẽ bay hơi.
Lượng nước liên kết còn lại khoảng 7-8%.
Trong suốt thời gian làm khô cấp 1, nhiệt độ dàn ngưng tụ, nhiệt độ chế phẩm và
áp suất chân không là những yếu tố quyết định tốc độ thăng hoa của chế phẩm. Nhiệt độ
của dàn ngưng tụ phải thấp hơn 15
o
C so với nhiệt độ làm khô của sản phẩm. Nhiệt độ
Đồ thị 4: Đông nhanh và qúa trình kết tinh
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15

làm khô phải thấp hơn nhiệt đô đông toàn phần từ 5- 10
o
C. Áp lực chân không phải đạt
10
-2
Torr hoặc thấp hơn nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thăng hoa diễn ra.
Khi nhiệt độ chế phẩm tương đương hoặc thấp hơn 3- 5
0
C so với nhiệt độ kệ thì giai
đoạn làm khô cấp 1 kết thúc.[29]



Hinh 6. Sự thay đổi trạng thái chế phẩm trong giai đoạn làm đông.

Trong quá trình làm khô cấp 1, nước tự do dưới dạng tinh thể được tách khỏi chế
phẩm theo hướng từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong, tạo thành hai lớp gồm lớp
khô và lớp đông, giữa hai lớp này là mặt phân cách.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16


Hình 6. Quá trình thăng hoa của nước trong quá trình làm khô
Do áp suất hơi nước tại mặt phân cách lớn hơn áp suất hơi nước dàn ngưng tụ,
nên hơi nước từ các tinh thể đá di chuyển ra khỏi chế phẩm đến bám vào dàn ngưng tụ.
Nước ở trạng thái rắn nhận nhiệt lượng để chuyển sang hơi thoát khỏi sản phẩm,
sau đó hơi nước thải nhiệt trở thành trạng thái rắn bám vào dàn ngưng tụ. Nếu nhiệt độ
sinh phẩm cao hơn nhiệt độ đông toàn phần thì chế phẩm sẽ bị tan chảy. Vì vậy áp lực

chân không và nhiệt độ chế phẩm phải được kiểm soát trong suốt quá trình làm khô.

* Giai đoạn làm khô cấp hai.
Sau khi giai đoạn làm khô cấp 1 kết thúc, chế phẩm có dạng khô xốp. Tuy nhiên
vẫn còn khoảng 7-8% lượng nước còn tồn tại dưới dạng nước liên kết. Chế phẩm sẽ
không ổn định về cấu trúc và hoá học cũng như độ ẩm tồn dư cao sau khi đông khô nếu
lượng nước liên kết không được tách khỏi chế phẩm.
Ơ giai đoạn làm khô cấp hai, nước liên kết tách khỏi chế phẩm bằng cách tăng
nhiệt độ chế phẩm. Giai đoạn này đòi hỏi áp suất chân không thấp hơn 10
-3
Torr, nhiệt
độ dàn ngưng tụ phải thấp hơn –60
o
C. Tuỳ thuộc vào loại chế phẩm mà thời gian làm
khô cấp 2 bằng 1/3 đến 1/2 so với thời gian làm khô cấp 1.[29]
Trong giai đoạn thăng hoa, áp lực chân không và nhiệt độ ảnh hưởng đến chất
lượng của chủng VSV. Vai trò của nhiệt lượng trong quá trình thăng hoa được minh hoạ
ở hình bên dưới.


Hình 7. Chuyển hoá nhiệt và hơi nước trong quá trình làm khô

Trong quá trình đông khô, sản phẩm khô từ trên xuống và từ ngoài vào trong của lọ
chứa. Do đo, hơi nước thăng hoa phải đi xuyên qua phần khô của sản phẩm với tốc độ
thay đổi tuỳ thuộc vào độ xốp (cấu trúc tinh thể) và bề dày của phần khô. Để kích thích
và duy trì tốc độ thăng hoa, áp lực chân không cần được điều chỉnh hạ xuống song song
với nhiệt lượng gia tăng. [10]
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17

Lượng nước khi thăng hoa càng lớn sẽ giải phóng theo một lượng nhiệt lớn. Nhiệt
lượng này có thể làm tan trở lại và huỷ hoại một phần sản phẩm nếu như chúng không
được giải phóng nhanh ra khỏi sản phẩm. Do vậy, khi dùng nhiệt để kích thích quá trình
thăng hoa phải kèm theo mức độ chân không phù hợp.[10]
Ở cuối giai đoạn đông khô nhiệt độ kích vẫn duy trì và nhiệt độ chung VSV tự động
nâng lên dần. Trong những trường hợp cần thiết, có thể cung cấp thêm nhiệt lượng để
kích thích tách các phân tử nước còn lại bên trong chủng VSV, vì các phân tử này thường
bám rất chặt bên trong sản phẩm. Nhiệt độ kích ở giai đoạn này liên quan đến nhiệt độ
sau cùng và tính ổn định của chủng sau đông khô. Nhiệt độ này cần thiết phải được điều
chỉnh trong khoảng+30
o
C đến + 50
o
C để chủng không bị huỷ hoại.[10]
Ap suất hơi nước thay đổi theo nhiệt độ, khi nhiệt độ chế phẩm tăng thì áp suất hơi
nước tương ứng càng lớn, vì vậy độ chênh lệch áp suất hơi nước giữa mặt phân cách với
dàn ngưng tụ càng lớn, do đó quá trình thăng hoa diễn ra càng nhanh.
Ví dụ nhiệt độ chế phẩm ở –10
o
C có áp suất tương ứng là 2,560 mbar,ở –20
o
C là
1,030mbar, ở –40
o
C là 0,120 mbar, trong khi đó nhiệt độ ở dàn ngưng tụ ít nhất la -60
o
C
tương ứng 0,009 mbar.[4]
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18

* Cơ chế truyền nhiệt.[4],[11]
Nhiệt lượng được truyền từ kệ vào chế phẩm theo hình thức dẫn nhiệt trực tiếp hoặc
bức xạ nhiệt hoặc kết hợp cả hai hình thức truyền nhiệt này.
Ở các thiết bị đông khô cũ nguồn cấp nhiệt bằng điện trở. Còn thiết bị đông khô mới
dùng dung dịch silicon tải nhiệt nên chênh lệnh nhiệt độ giữa các điểm trên bề măt kệ
chỉ khoảng 1
o
C.[10]


Cuối giai đoạn làm khô, chế phẩm có dạng khô xốp và có tính háo nước rất mạnh
nhưng vẫn còn một lượng nước nhỏ cố định trong sinh phẩm gọi là độ ẩm tồn dư. Độ ẩm
tồn dư được xác định khi áp suất hơi nước của sinh phẩm tương đương với áp suất hơi
nước của dàn ngưng tụ tại một nhiệt độ xác định.[10][69].
Nếu độ ẩm tồn dư chưa đủ thấp thì tiếp tục loại nước liên kết trong chế
phẩm bằng cách hạ thấp nhiệt độ của dàn ngưng tụ từ –60
o
C xuống –80
o
C hoặc
tăng nhiệt độ sinh phẩm từ 20
o
C lên 30
o
C nhằm tăng độ chênh lệch áp suất hơi
nước giữa chế phẩm với dàn ngưng tụ. Nhiệt độ chế phẩm tăng trong giới hạn cho
phép giảm độ ẩm tồn dư mà không huỷ hoại chế phẩm.

H

ì
n
h

t
h
ứ
c

t
r
Đông băng
Đông khô cấp 1
Đông khô cấp 2
Thăng hoa






Tách nước liên kết
Độ ẩm tồn dư
Sinh ph
ẩ
m

đông băng
N
ước liên kết

N
ước kết tinh
Lượng nước trong SP.

Giai đoạn đông khô
Hình 8. L
ượng nước chuyển hóa trong quá trình đông khô
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
19

uyền nhiệt vào sản phẩm trong suốt quá trình đông khô được biễu diễn ở hình bên
dưới:
















Hình 9. Cách thức truyền nhiệt vào sản phẩm trong suốt quá trình đông khô

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
20

PHẦN THỨ BA

KẾT QUẢ
I. Các thông số kỹ thuật của quy trình đông khô chủng VSV

1.1 Thời gian đông khô chủng VSV
Bảng 1 Thời gian đông khô theo từng giai đoạn của mỗi chủng

Giai đoạn Thời gian đông khô (h) của từng chủng
Candida
albicans
Bacillus
subtilis
Micrococus
lutes
Clostridium
sporogenes
Làm đông
Làm khô cấp 1
Làm khô cấp 2
4
18
3
2,5
22
4,5

5
33
3
5
38
7
Tổng thời gian
đông khô
25 29 41 50

Nhận xét:
Thời gian làm đông: ngắn nhất là quy trình đông khô chủng Bacillus subtilis là 2,5h.
3 chủng Candida albicans, Micrococus lutes, Clostridium sporogenes có thời làm đông
là 4h và 5h.
Thời gian làm khô cấp 1: ngắn nhất là quy trình cho chủng Candida albicans: 18h, dài
nhất là quy trình cho chủng Clostridium sporogenes: 38h.
Tổng thời gian: Quy trình Candida albicans =25h
Quy trình Clostridium sporogenes = 50h gấp đôi thời gian đông khô chủng
Candida albicans.
1.2 Điểm đông và nhiệt độ đông
Bảng 2 Điểm đông và nhiệt độ đông trong quá trình làm đông

Chủng VSV Nhiệt độ ở vị trí
đo (
o
C)
Candida
albicans
Bacillus
subtilis

Micrococus
lutes
Clostridium
sporogenes
Trung
bình
Điểm đông -15 -13 -14 -17 -14,75
Trong sản phẩm -41 -40 -40 -42 -40,75
Dàn ngưng
-80
o
C
Nhận xét:
Điểm đông của sản phẩm (chủng Bacillus subtilis) là cao nhất –13
o
C
Thấp nhất : chủng Clostridium sporogenes –17
o
C
Trung bình: -14,75
o
C
Nhiệt độ sản phẩm trong quá trình làm đông từ –40 đến –42
o
C.
Nhiệt độ của dàn ngưng: -80
o
C
Từ kết quả ở bảng 2 ta có biểu đồ sau:
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

21

Biu 1. im ụng v nhit sn phm trong giai on lm ụng
0
10
20
30
40
50
C. albicansB. subtilisM. luteusC. sporogenes
ẹieồm ủoõng
Nẹ ủoõng toaứn phan

1.3 Thay i ỏp sut, nhit v hỡnh thỏi vt lý ca sn phm trong quỏ trỡnh
ụng khụ
Bng 3. p sut, nhit v hỡnh thỏi ca sn phm trong quỏ trỡnh ụng khụ
chng VSV
p sut bung ụng khụ
(mbar)
Giai on
Nhit sn
phm
Chõn khụng An ton
hỡnh thỏi vt
lý
Lm ụng 25
o
C n
42
o

C
0 0 T lng sang
rn (dng
bng)
Khụ cp 1 -40 n 25
o
C 0,05 0,1 Trng
mn,xut hin
t trờn xung
di
Khụ cp2 -25 n 25
o
C 0,001 0,01 Khi trng
mn u
Kt thỳc 22 n 25
o
C 0 0 Khi c,
trng, mn, d
bong thnh
bỏnh

Nhn xột:
Khụng hỳt chõn khụng: p sut =p sut khớ quyn
Trong giai on lm ụng, nhit sn phm c h t mc bng nhit
phũng xung khong - 42
o
C. Sn phm c lm ụng hon ton: t dng lng sang
dng bng.
Giai on khụ cp 1: Nhit sn phm tng dn n khong 25
o

C. p sut
chõn khụng cn thit gi sn phm khụng b tan chy l< 0,1mbar. Sn phm
c lm khụ dn t trờn xung di, t ngoi vo trong nờn cú th quan sỏt thy
mu trng mn ca sn phm ụng khụ.
Nhit ụng (-
0
C)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
22

Giai đoạn khô cấp 2: Nhiệt độ tăng dần đế nhiệt độ phòng nên áp suất chân không
phải hạ thấp xuống để bảo vệ sản phẩm an toàn. Lúc này, toàn bộ sản phẩm đã có
màu trắng mịn vì nước tự do đã được rút hết.
Khi kết thúc quá trình đông khô, sản phẩm có dạng một khối bánh trắng mịn dễ
bong. Đây là hình thức sản phẩm rất đẹp.
II Kết quả kiểm tra độ chất lượng trước và sau đông khô chủng:
2.1 Độ sống của chủng trước và sau đông khô
Bảng 4 Độ sống trước và sau đông khô



Nhận xét:
Tỷ lệ sống là tỷ số giữa độ sống sau đông khô và độ sống trước đông khô.
Cả trước và sau đông khô tất cả 4 chủng đều đạt độ sống >10
7
TBS/lọ. Độ sống cao
nhất cả trước và sau đông khô là chủng Bacillus subtilis, thấp nhất là chủng Cadidan
albicans.
Độ sống ( x10
7

TBS/lọ ) Chủng
Trước đông khô Sau đông khô
Tỷ lệ sống
1.Micrococcus
luteus
8,50 4,00 0,47
2. Bacillus subtilis 9,00 8,25 0,92
3. Candida albicans 4,75 1,25 0,26
4.Clostridium
sporogenes
6,00 5,25 0,88
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
23

Từ kết quả độ sống ta có biểu đồ sau:

Biểu đồ 2: Độ sống của chủng trước và sau đông khô
0
2
4
6
8
10
C. albicansB. subtilisM. luteusC. sporogenes
Tröôùc ñoâng khoâ
Sau ñoâng khoâ

2.2 Kết quả kiểm tra độ ẩm tồn dư
Bảng 5 Độ ẩm tồn dư trong sản phẩm của các quá trình đông khô

Chủng Quy trình đông khô chủng Độ ẩm tồn dư (%)
Candida albicans 25h 7,2%
Bacillus subtilis 29h 5,5%
Micrococus lutes 41 2,1%
Clostridium sporogenes 50h 2%
Tiêu chuẩn Who
≤ 3%
Nhận xét:
Độ ẩm tồn dư cao nhất: 7,2% ứng với quy trình đông khô 25h.
Thấp nhất: 2% và 2,1% với quy trình đông khô 41h và 50h.
Qua kết quả trên ta thấy, độ ẩm tồn dư trong sinh phẩm tỷ lệ nghịch với thời gian đông
khô: thời gian càng dài thì tỷ độ ẩm tồn dư(%) càng thấp
Độ sống ( x10
7
TBS/ lọ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
24

T kt qu trờn ta cú biu sau
Biu 3 m tn d v tng thi gian ụng khụ.
0
10
20
30
40
50
60
C. albicansB. subtilisM. luteusC. sporogenes
0
1

2
3
4
5
6
7
8
Thụứi gian (h)
ẹoọ aồm ton dử (%)

2.3 Mc h hng sn phm do quỏ trỡnh ụng khụ
Trong quỏ trỡnh ụng khụ, mt s sn phm b teo li. Mc teo cú th ch teo
phn chõn bỏnh nhng cng cú th teo ton b bỏnh. Nguyờn nhõn gõy teo l do s iu
chnh nhit sn phm v ỏp sut chõn khụng cha hp lý, hoc do thi gian lm ụng
quỏ ngn cha lm ụng ton b sn phm.
Mc h hng sn phm c trỡnh by trong bng 6

Chng Tng s sn phm
thu c
S lng b teo T l %
Candida albicans 250 15 0,06
Bacillus subtilis 280 40 0,142
Micrococus lutes 340 5 0,014
Clostridium
sporogenes
150 0 0
T l sn phm b teo thp nht l khi ụng khụ chng Clostridium sporogenes, cao nht
l chng Bacillus subtilis.
Tng thi gian (h)
m tn d (%)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
25

Từ kết quả bảng 6 ta có biểu đồ 4

0
100
200
300
400
C. albicansB. subtilisM. luteusC. sporogenes
Soá löôïng SP teo
Toång soá SP

Biểu đồ 4 Lượng sản phẩm bị teo do quá trình đông khô
1.3 Kết quả kiểm tra độ chân không sau đông khô:
Độ chân không được kiểm tra bằng máy đo chân không Telsla.
Có 3 mức độ đạt chân không:
. Mức độ chân không tốt: lọ phát ra ánh sáng trắng.
. Mức độ chân không kém :lọ phát ra ánh sáng đỏ.
. Chân không không có hoặc không đáng kể: không phát sáng.
S
ố sản phẩm (lọ)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version