Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase

i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn em đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của tập thể các thầy cô hướng dẫn,
gia đình và bạn bè. Nhân dịp này em xin chân thành bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới:
Toàn thể thầy cô, cán bộ thuộc Viện Công nghệ sinh học và môi trường,
Trường Đại học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt 4 năm học
tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho
quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời.
Thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và
môi trường và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn và tận
tình chỉ bảo cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện đề
tài.
Ban quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thực hành Hóa
sinh – Vi sinh, Khoa Chế biến đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn những người bạn của em không những động viên mà còn
cùng đồng hành, sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài.
Con cảm ơn bố mẹ đã luôn âm thầm cổ vũ, ủng hộ cho con và là nguồn động
viên lớn nhất mỗi khi con cảm thấy khó khăn nhất.
Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý.

Nha trang, ngày 02 tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực tập

Ngô Yến Thủy

ii

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1 TỔNG QUAN PHẾ LIỆU TÔM 3
1.1.1 Khái quát về phế liệu tôm 3
1.1.2 Thành phần và tính chất của phế liệu tôm 4
1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITIN 5
1.2.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 5
1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin 6
1.2.3 Tính chất của chitin 7
1.2.4 Ứng dụng của chitin và dẫn xuất của chitin 7
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHITIN 8
1.3.1 Sản xuất chitin theo phương pháp hóa học [10] 8
1.3.2 Sản xuất chitin theo phương pháp sinh học 11
1.3.3 Sản xuất chitin kết hợp phương pháp sinh học với phương pháp hóa học
14
1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG 17
1.4.1 Giới thiệu 17
1.4.2 Nguyên lý 17
1.4.3 Ứng dụng 18
1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 18
1.5.1 Khái quát về enzyme 18
1.5.2 Cơ chế tác dụng của enzyme. 19
1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân bằng enzyme 21
1.5.4 Enzyme Alcalase 23
CHƯƠNG II: 24
iii

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 24
2.1.2 Enzyme Alcalase 24
2.1.3 Hóa chất 24
2.1.4 Thiết bị 24
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 24
2.2.2 Bố trí thí nghiệm tổng quát 25
2.2.3 Xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 26
2.2.4 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung
enzyme 27
2.2.5 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein
bằng Alcalase 28
2.2.6 Bố trí thí nghiệm tối ưu quy trình khử protein bằng Alcalase 31
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH. 33
2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 34
3.2 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme 35
3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein 37
3.4 Tối ưu công đoạn tách protein của đầu tôm bằng Alcalase 42
3.5 ĐỀ SUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT Ý KIẾN 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 55
iv

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Ký hiệu Diễn giải
AU Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân protein
DD Độ deacetyl hóa
DH Độ thủy phân
E/S Tỷ lệ enzyme/cơ chất
RSM Phương pháp mặt đáp ứng
v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần (%) đầu và vỏ phế liệu tôm 3
Bảng 2.1 Thiết kế mức thực nghiệm của các tham số trong quy trình xác định ảnh
hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein 29
Bảng 2.2 Ma trận thí nghiệm theo DX – 2 Lever Factor 30
Bảng 2.3 Mức thực nghiệm dự kiến của các tham số tối ưu 32
Bảng 2.4 Ma trận thí nghiệm dự kiến tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase
theo mô hình Box – Behnken 32
Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 34

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo hóa học của Chitin 6
Hình 1.2 Sơ đồ quy trình của Pháp, 1996 8
Hình 1.3 Quy trình Stevens - Học Viện Công Nghệ Châu Á (2001) 9
Hình 1.4 Quy trình xử lý kiềm một giai đoạn của Trần Thị Luyến (2003) 10
Hình 1.6 Quy trình sản xuất chitin – chitosan của Trung tâm Chế biến, 11
Hình 1.7 Quy trình sử dụng enzyme papain của Trần Thị Luyến, 2003 14
Hình 1.8 Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sĩ Trung, 16

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25
Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân
trắng 26
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên
liệu ban đầu và bổ sung enzyme 27
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả
khử protein 28
Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase 31
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung
Alcalase đến hiệu quả khử protein 35
Hình 3.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng hoạt động của
Alcalase 38
Hình 3.3 Đồ thị Half normal về ảnh hưởng của các nhân tố 38
Hình 3.4 Đồ thị về sự tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ Enzyme/nguyên liệu 39
Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian 41
Hình 3.6 Đánh giá mức độ phù hợp của phương trình 43
vii

Hình 3.7 Kết quả ANOVA phân tích các biến số 43
Hình 3 8 Kết quả phân tích ANOVA 44
Hình 3.9 Đường đồng mức về mối tương quan giữa thời gian và nhiệt độ tới hiệu
quả khử protein 46
Hình 3.10 Đường đồng mức về mối tương quan giữa nồng độ enzyme và nhiệt độ
tới hiệu quả khử protein 46
Hình 3.11 Quy trình đề suất khử protein đầu tôm bằng Alcalase 49

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản ở nước ta phát triển
mạnh mẽ, các sản phẩm thủy sản của chúng ta đã vươn ra nhiều nước trên thế giới
ngay cả những thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu… Ngành đã tạo
công ăn việc làm cho hàng triệu người lao động. Bên cạnh đó còn đem về cho nhà
nước một nguồn ngoại tệ không nhỏ nhờ việc xuất khẩu các mặt hàng thủy sản đặc
biệt là mặt hàng thủy sản đông lạnh như: tôm, mực, cá….Trong đó tôm đông lạnh
chiếm tỉ lệ không nhỏ trong tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm. Theo
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6 tháng đầu
năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD, tăng
16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là nhóm hàng
có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của
Việt Nam. Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4
tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ năm 2010. Trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ
USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD. Bên cạnh việc tăng sản lượng tôm
xuất khẩu là lượng phế liệu tôm thải ra cũng tăng lên. Lượng phế liệu này có thể
chiếm tới 40 – 60% trọng lượng tôm và có chứa nhiều thành phần có giá trị như:
protein, chitin, astaxanthin. Do vậy hiện nay người ta đang tập trung nghiên cứu thu
hồi chúng để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau trong đời sống. Protein có thể
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để tăng giá trị dinh dưỡng, nâng cao hiệu quả trong
chăn nuôi. Astaxasnthin cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm,
thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chitin và dẫn xuất của nó – chitosan – được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: trong công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ
phẩm, nông nghiệp, và một số ngành công nghiệp khác.
Trong nhiều công trình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan trước đây, giai
đoạn khử protein được xử lý bằng kiềm mạnh và khử khoáng bằng HCl với lượng
lớn và nồng độ cao dẫn đến dịch protein thu được sau quá trình thường thải bỏ do
có nồng độ hóa chất cao, gây ô nhiễm môi trường nếu không được xử lý hoặc việc
2

xử lý nước thải cũng khó khăn hơn. Mặt khác việc sử dụng hóa chất với nồng độ

cao còn gây cắt đứt mạch chitin làm giảm độ nhớt của chitosan.
Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng enzyme cho việc thu hồi
protein, chitin nhưng chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào tối ưu hóa bằng enzyme
Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng. Có nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ
enzyme, thời gian như trong nhiều báo cáo trước đây ảnh hưởng tới quá trình thủy
phân protein bằng enzyme. Phương pháp mặt đáp ứng Box Benhken được thiết kế
để đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm
mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp
thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết được. Vì vậy đề tài: ”Ứng dụng phương pháp
mặt đáp ứng để tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng
enzyme Alcalase” được thực hiện nhằm giải quyết hạn chế đã nêu.
Mục tiêu đề tài:
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein trên đối tượng
đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase.
- Áp dụng phương pháp mặt đáp ứng để thiết lập chế độ khử protein từ phế
liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase.
Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về việc sử
dụng enzyme trong công nghệ sản xuất chitin, giúp hiểu biết sâu hơn về các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình khử protein bởi Alcalase nói riêng và protease nói chung.
từ các kết quả tối ưu thu được sẽ cho phép mô hình hoá quá trình chiết xuất chitin
và thu hồi các sản phẩm hữu ích ở qui mô pilot và qui mô công nghiệp.
Nội dung đề tài:
- Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt sơ bộ nguyên liệu đến hiệu
quả khử protein bằng enzyme Alcalase.
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng khử protein của Alcalase.
- Tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme
Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng.
3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN PHẾ LIỆU TÔM
1.1.1 Khái quát về phế liệu tôm
Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt
hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Công nghệ chế
biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu tôm và vỏ tôm, thường
chiếm 50 – 70% nguyên liệu ban đầu (Đỗ Văn Nam và cộng sự, 2005 và
Shahidi,1991)
Phế liệu tôm chủ yếu gồm đầu và mảnh vỏ, ngoài ra còn có phần thịt vụn do
bóc nõn không cẩn thận và một số tôm bị hỏng. Phần đầu thường chiếm khối lượng
34 – 45% trọng lượng tôm nguyên liệu, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10 – 15%. Tuy
nhiên tỷ lệ này tùy thuộc vào phương pháp gia công chế biến, giống loài và giai
đoạn sinh trưởng của chúng [7]. Đối với tôm càng xanh Macrobrachium
rosenbergii, phần đầu chiếm tới 60% trọng lượng tôm. Tôm sú Penaeus monodon
thì đầu chiếm tới 40% trọng lượng tôm. Sản phẩm tôm bóc nõn, rút chỉ lưng, lượng
đuôi và vỏ chiểm khoảng 25% trọng lượng tôm [4].
Bảng 1.1 Thành phần (%) đầu và vỏ phế liệu tôm [3]
Phế liệu Protein Chitin Lipid Tro Canxi Phospho
Đầu 53,5 11,1 8,9 22,6 7,2 1,68
Vỏ 22,8 27,2 0,4 11,7 11,1 3,16

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6
tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu
USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là
nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu
chủ lực của Việt Nam. Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu
về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ năm 2010. Trong đó, tôm sú đạt hơn
1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD. [33]
4

Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), từ nay đến năm 2015, tiêu
thụ thủy sản tính theo đầu người trên toàn cầu sẽ tăng trưởng khoảng 0,8%/năm,
tổng nhu cầu thủy sản và các sản phẩm thủy sản sẽ tăng khoảng 2,1%/năm. Đó là
một điều kiện thuận lợi để các doanh nghiệp thủy sản Việt Nam tiếp tục đẩy mạnh
xuất khẩu trong năm tới, nhất là với các thủy sản nuôi trồng như tôm, cá tra [32].
1.1.2 Thành phần và tính chất của phế liệu tôm
Trong đầu tôm, thành phần chủ yếu là protein, chitin, khoáng, sắc tố,… Tùy
vào giống loài, đặc điểm sinh lý, sinh thái, mùa vụ mà tỷ lệ các thành phần này thay
đổi theo.
Protein: tỷ lệ protein trong đầu tôm cao hơn trong vỏ tôm rất nhiều và thường
là protein không hòa tan tồn tại ở hai dạng.
- Dạng tự do: tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ.
Dạng này chủ yếu từ phần thịt tôm bị biến đổi, hư hỏng bị bỏ vào trong phế liệu
hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng. Nếu công nhân vặt đầu không đúng
kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều, mặt khác việc xử lý phế liệu
cũng khó hơn.
- Dạng phức tạp: dạng này liên kết với Chitin, CaCO
3
như một phần thống
nhất của vỏ đầu tôm.
Chitin tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và các chất hữu cơ khác
chủ yếu là CaCO
3
. Chính liên kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế
Chitin.
Tro: trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ
yếu là CaCO
3
.
Sắc tố: trong vỏ đầu tôm, sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Astaxanthin là một

loại carotenoid thường tồn tại ở dạng tự do, mono hay di-ester với các acid béo
không no mạch dài, hoặc dưới dạng phức protein – astaxanthin. Trong vỏ đầu tôm,
astaxanthin liên kết chặt chẽ với lớp vỏ canxi carbonat – chitin. Và khi liên kết này
bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin có màu đỏ đặc trưng.
5

Chất ngấm ra: trong phế liệu đầu tôm tồn tại một số chất ngấm ra như
Trimethylalamin (TMA), Trimethylamixyt (TMAO), Taurin, Ure, các acid amin tự
do. Các chất này không có giá trị về mặt dinh dưỡng nhưng chúng có ý nghĩa quyết
định đến màu, mùi đặc trưng của sản phẩm.
Lipid: hàm lượng lipid trong phế liệu tôm thấp. Phần đầu có tỷ lệ cao hơn vỏ,
chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa như eicosapentaenoic acid (EPA),
decosahexaenoic acid (DHA). Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con
người và có nhiều ứng dụng trong y học.
Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme. Theo tạp chí
Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 05/1993) thì hoạt độ enzyme protease của đầu
tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi. Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa
chymotrypsin, được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư. Một vài loại enzyme khác
có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminase,
chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế.
Ngoài thành phần chủ yếu kể trên còn có các thành phần khác như: Nước,
Lipid, Phospho…
1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITIN
1.2.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên
Chitin là polymer hữu cơ phổ biến thứ hai trong thiên nhiên sau Cellulose.
Chitin có thể tìm thấy trong những màng tế bào của hầu hết sinh vật sống trong tự
nhiên.
Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một
số động vật không xương sống như; côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và giun tròn.
Chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật không xương sống.

Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào nấm thuộc họ Zygemycethers,
một vài loại tảo Chlorophiceae.
Trong các loài thủy sản, đặc biệt trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực hàm lượng
chitin – chitosan chiếm khá cao từ 14 – 35% so với trọng lượng khô. Hàm lượng
chitin biến đổi theo từng loại nguyên liệu, trong đó phế liệu nang mực ống có hàm
6

lượng chitin cao nhất 75 – 80%, tiếp theo là tôm sú Penaeus monodon 34,9% và
tôm thẻ Penaeus vannamei 18,3% [15].
1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin
Chitin là một polymer mạch dài của N-acetylglucosamine, dẫn xuất của
glucose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm axetyl
amino (-NHCOCH
3
). Như vậy, chitin là poly N-acetyl-β-D glucosamine liên kết với
nhau nhờ cầu nối β-1,4 glucoside.


Hình 1.1 Cấu tạo hóa học của Chitin
Công thức phân tử: (C
32
H
54
N
4
O
21
)
n
, tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu mà chỉ

số n khác nhau.
Ở tôm hùm n=700 – 800
Ở tôm thẻ n=400 – 500
Ở cua n=500 – 600.
Phân tử lượng: M
chitin
= (203,09)n
Cấu trúc chitin gồm 3 dạng α-chitin, β-chitin, γ-chitin. Chitin từ tôm và có
dạng α-chitin, còn chitin từ mực có dạng β-chitin. α-chitin có độ rắn phân tử cao
nhất và dạng rắn chắc và các mạch chitin sắp xếp song song nhưng ngược chiều
nhau. β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều nhau, có độ rắn thấp,
tính hydrat hóa cao. γ-chitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì có một
mạch ngược chiều. Trong tự nhiên, α-chitin có mặt nhiều nhất và thường rất cứng
trong khi β-chitin, γ-chitin thì tạo nên tính dẻo, dai
7

1.2.3 Tính chất của chitin
Chitin có màu trắng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không
tan trong nước, môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như este, rượu,
nhưng lại tan trong dung dịch đặc nóng của muối trung tính thyoxyanat liti (LiSCN)
và thyoxyanat calcium (Ca(SCN)
2
) tạo thành dung dịch keo.
Chitin ổn định với chất oxy hóa mạnh như KMnO
4
, nước javen (NaClO),
oxy già (H
2
O
2

),… người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin.
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng λ = 884 – 890 nm
Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt
mạch thu được 88,5% D-glucosamine và 21,5% acid acetic. Quá trình thủy phân bắt
đầu xảy ra ở mối nối Glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH
3
).
(C
32
H
54
N
4
O
21
)
n
+ 2(H
2
O) = (C
28
H
50
N
4
O
19
)
n
+ 2(CH

3
COOH)
n
Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 – 50%) thì Chitin sẽ bị
mất gốc acetyl tạo thành Chitosan:
Chitin + n NaOH
đđ
Chitosan + n CH
3
COONa
1.2.4 Ứng dụng của chitin và dẫn xuất của chitin
Chitosan là dạng N-deacetyl của chitin khi deacetyl bằng kiềm đặc. Chitosan
là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β-D glucosamine liên
kết với nhau nhờ cầu nối β-1,4 glucoside.
Trong mỹ phẩm: Dùng làm phụ gia để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp
sinh học với da, chống tia cực tím, làm mềm da, làm kem lột mặt
Trong công nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in,
phim ảnh, chitin/chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm.
Trong xử lý nước thải: Chitosan dùng để xử lý nước thải trong công nghiệp
(tạo phức với các kim loại nặng độc hại) để lọc trong nước phục vụ tiêu dùng.
Trong nông nghiệp: Chitin/Chitosan chống lại các vi nấm và vi khuẩn gây
bệnh của môi trường xung quanh để bảo vệ thực vật. Chitin/Chitosan còn dùng làm
chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.
8

Trong công nghiệp thực phẩm: Để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực
phẩm, hoa quả, rau tươi như đào, quả lê, quả kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà
chua Dùng để lọc trong các loại nước quả ép, bia, rượu vang, nước giải khát,…
Trong công nghệ sinh học: Dùng để cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật,
làm chất mang sử dụng trong sắc ký lọc.

Trong y tế: Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược
độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…
Dùng làm chất màng sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polyme. Dùng làm vật liệu:
Da nhân tạo, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHITIN
1.3.1 Sản xuất chitin theo phương pháp hóa học [10]
* Quy trình sản xuất của Pháp (1996)
Vỏ tôm
Hấp chín, phơi khô
Xay thô
Ngâm NaOH 3,5% (tỷ lệ 1W:10V, 2h, 65
0
C)
Rửa trung tính
Ngâm HCl 1N, tỷ lệ 1W/10V, 2h, t
0
phòng
Ngâm acetone tỷ lệ 1W:5V, 30 phút, t
0
phòng
Ngâm NaClO 0,315%, tỷ lệ 1W:10V, 6 phút, t
0
phòng
Rửa trung tính
Chitin
Hình 1.2 Sơ đồ quy trình của Pháp, 1996
9

Nhận xét:
Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm

thu được có màu sắc trắng đẹp do có 2 bước khử sắc tố.
Nhược điểm: Giá thành cao do thêm chi phí hấp chín, xay nhỏ, ngâm acetone.
Khi tiến hành rửa trung tính sẽ gặp khó khăn lớn do nguyên liệu đã bị xay nhỏ, rất
khó rửa, hao phí nguyên liệu lớn. Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh
hưởng đến mạch polymer do đó độ nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton
rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Chưa kể các yếu tố an toàn sản
xuất nên công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta
* Quy trình sản xuất chitin - chitosan của Stevens, 2001

Hình 1.3 Quy trình Stevens - Học Viện Công Nghệ Châu Á (2001)
Phế liệu vỏ tôm tươi
Khử protein
(NaOH 4%, 24h, 30
0
C)
Kiểm tra hàm lượng protein
Khử khoáng
( HCl 4%, 24h, 30
0
C)

Kiểm tra hàm lượng khoáng
Chitosan

Chitin
Deacetyl
(NaOH 50%, 24h, 30
0
C)
Cao hơn 1%

Cao hơn 1%
10

Nhận xét: Quy trình ít công đoạn, sản phẩm có chất lượng khá tốt. Song sử dụng
hóa chất nhiều với nồng độ cao trong thời gian quá dài, do đó dễ làm ảnh hưởng tới
độ nhớt sản phẩm.
* Quy trình sản xuất chitosan một công đoạn xử lý kiềm, Trần Thị Luyến (2003)

Hình 1.4 Quy trình xử lý kiềm một giai đoạn của Trần Thị Luyến (2003)
Nhận xét: Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có
chất lượng không kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm.
Tổng thời gian xử lý giảm rất nhiều, như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là
phương pháp tốt hơn hẳn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm là dung
dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng.
V
ỏ
tôm khô

V
ỏ
tôm tươi

Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein, lipid
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h

w/v = 1/10
HCl 10%
t
o
phòng
t= 5h
w/v = 1/5
NaOH 40%
t
o
= 80±2
o
C
t = 5h
w/v = 1/10
Rửa trung tính
Chitosan
11

* Quy trình sản xuất chitin – chitosan của Trung tâm Chế biến, Đại học Nha Trang

Hình 1.5 Quy trình sản xuất chitin – chitosan của Trung tâm Chế biến,
Đại học Nha Trang
Nhận xét: Quy trình của Trung tâm Chế biến có ưu điểm là đơn giản, không
đòi hỏi máy móc thiết bị phức tạp, vì vậy dễ áp dụng trong sản xuất lớn. Tuy nhiên
thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất vẫn còn cao. Trong khi đó lượng nước
thải trong quá trình sản xuất là khá lớn, chất lượng protein và astaxanthin là tương
đối tốt. Do đó, có thể kết hợp phương pháp sinh học trong quá trình đầu như là một
bước tiền xử lý, thì có thể giảm được lượng hóa chất sử dụng và việc tận thu sản
phẩm trong dịch thải ban đầu theo phương pháp sinh học sẽ có chất lượng tốt hơn.

1.3.2 Sản xuất chitin theo phương pháp sinh học
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc sử dụng hệ enzyme có sẵn
trong đầu tôm hoặc bổ sung enzyme nguồn gốc từ thực vật (papain, bromelain…),
động vật (nội tạng cá thu, ngừ, mực ống…), vi sinh vật (protease từ nấm mốc và vi
Khử khoáng
Ph
ế
li
ệ
u tôm

Khử protein
Chitin
Chitosan
HCl 7%, 24h, 30
0
C, tỷ lệ 1/5 (w/v)
NaOH 6%, 24h, 30
0
C, tỷ lệ1/5(w/v)
NaOH 40%, 6,5h, 80
0
C,
tỷ lệ 1/10(w/v)
Deacetyl
Rửa sơ bộ
12

khuẩn) để thủy phân protein đầu tôm thành các phần peptid, aminoacid và thu hồi
chúng. Quá trình deacetyl được thực hiện bởi enzyme deacetylase. Sản phẩm

chitosan thu được có chất lượng cao do không ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất.

H
2
N-CH-CO-NH-CH- H
2
N-CH-COOH + H
2
N-CH-CO-NH-
R
1
R
2
R
1
R
2

Polypeptide Amino acid Peptid

Trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng
phương pháp sinh học trong sản xuất Chitin – Chitosan như:
Synowiecki và cộng sự (2000) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein
của phế liệu vỏ tôm Crangon cragon nhằm thu hồi chitin và protein. Ban đầu vỏ
tôm Crangon cragon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 20
0
C
trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 55
0
C và pH 8,5.

Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25). Hàm
lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình thủy phân
có sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M.
Mizani và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thủy phân phế liệu đầu tôm P.
semisulcatus bằng enzyme thương mại Alcalase. Để cải thiện hiệu quả trích ly một
vài chất hóa học như sodium sulphite và Triton x-100 được sử dụng kết hợp với
enzyme. Khi Alcalase sử dụng độc lập (12AU/kg), hiệu suất trích ly protein 45,1%
nhưng khi kết hợp xử lý với Triton x-100 (0,01g/kg) thì hiệu suất thu hồi protein
giảm xuống 39%, trong khi bổ sung sodium sulphite (200mM/l) cùng với enzyme
hay hỗn hợp enzyme và Triton x-100 tăng mức trích ly protein từ 62% và 65,1%
tương ứng. Protein kết tủa tại pH 3,1 thì hàm lượng sulphite trong bột protein giảm
97% và bột protein thu được có chứa đầy đủ amino acid thiết yếu thích hợp làm
thức ăn chăn nuôi.
Holanda và Netto, (2006), nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế
liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và
Protease
H
2
O
13

Pacreatin. Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42%
protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng
enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 60
0
C, pH
8,5. Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin
cao hơn so với trypsin, chimotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi
protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7mg/100g phế liệu khô.
Rao và Stevens (2005) đã sản xuất chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ tôm với

Lactobacillus plantarum 541. Hiệu suất thu hồi chitin từ đầu và vỏ tôm là 4,5% và
13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein
và 63% khoáng từ vỏ tôm.
Gần đây Trường đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy
trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý,
ứng dụng công nghệ enzyme và có nhiều kết quả được công bố đã góp phần đáp
ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe
hơn về chất lượng chitin/chitosan trên thị trường.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006) nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp
vi khuẩn Bacillussubtilis để loại bỏ protein ra khỏi vỏ của phế liệu tôm. Sau 24h
phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%.
Trần Thị Luyến (2003) đã sử dụng enzyme papain để sản xuất chitin/chitosan
cho kết quả rất tốt
14















Hình 1.6 Quy trình sử dụng enzyme papain của Trần Thị Luyến, 2003

Nhận xét: Quy trình cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các sản phẩm khác.
Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn (41,25%). Để
nâng cao chất lượng chitin có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để
khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục
đích thu hồi protein và tận dụng, chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên,
cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này.
1.3.3 Sản xuất chitin kết hợp phương pháp sinh học với phương pháp hóa
học
- Ưu điểm:
Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm
nhẹ trong thời gian ngắn.
V
ỏ
tôm khô

V
ỏ
tôm tươi

Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h
w/v = 1/10
HCl 10%
t

o
phòng
t= 5h
w/v = 1/5
Papain 13%
T
o
=70 – 80
o
C
t = 4h
pH = 5
w/v = 1/10

Rửa trung tính
Chitin

Phơi khô
15

Giảm ô nhiễm môi trường do giảm lượng hóa chất sử dụng đồng thời giảm
lượng chi phí lớn cho công tác xử lý ô nhiễm môi trường.
Giá thành rẻ do tận thu được chất có giá trị kinh tế như thu hồi protein làm
bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được
thu hồi trong quá trình sản xuất.
Thời gian xử lý ngắn hơn phương pháp sinh học, khoảng 48 giờ.
- Nhược điểm: Kỹ thuật sản xuất phức tạp, thời gian kéo dài hơn so với
phương pháp hóa học.
Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất kết hợp phương pháp
hóa học và sinh học đã được nghiên cứu rộng rãi ở Việt Nam và trên thế giới, như

nghiên cứu của TS. Trang Sĩ Trung, trường Đại học Nha Trang.
16


Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sĩ Trung,
Trường Đại học Nha Trang
Nhận xét: Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn
(khoảng 30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp
(50
o
C trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thường với việc sử dụng
hóa chất). Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng
hiệu quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường cùng với giảm một lượng
đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho Chitin và môi
Phế liệu vỏ đầu tôm thẻ
Xay nhỏ
Thu dịch protein astaxanthin
Khử protein bằng enzyme
Flavourzyme

Khử protein còn lại bằng NaOH
loãng

Rửa trung tính
Khử khoáng bằng HCl
Rửa trung tính
Chitin

- pH = 6,5
- Thời gian 6 giờ

- Nhiệt độ 50
o
C
- Enzyme/nguyên liệu
0,1% (v/w)
- Thời gian 12 giờ
- Nhiệt độ phòng
- NaOH 2%
- Thời gian 6 giờ
- Nhiệt độ phòng
- HCl 4%
17

trường. Do đó, chất lượng Chitin thu được rất cao và hiệu quả kinh tế thu được cũng
cao. Từ đây, mở ra một hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học để có thể sản xuất
ra Chitin chất lượng cao và thân thiện với môi trường có thể ứng dụng trong sản
xuất ở quy mô công nghiệp.
1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG
1.4.1 Giới thiệu
Một hàm đơn giản, chẳng hạn như tuyến tính hoặc bậc hai đa thức, gắn vào
các dữ liệu thu được từ các thí nghiệm được gọi là một bề mặt phản ứng, và cách
tiếp cận được gọi là phương pháp mặt đáp ứng (Box G.E.P. và Draper N.R.,1987).
Phương pháp mặt đáp ứng (Response Surface Method – RMS) đã được giới
thiệu bởi Box G.E.P và Wilson K.B vào năm 1951
1951 Box and Wilson: CCD
1959 Kiefer: Start of D-optimal Design
1960 Box and Behnken: Box-Behnken Design
1971 Box and Draper: D-optimal Design
1972 Fedorov: exchange algorithm
1974 Mitchell: D-optimal Design

Mô hình này chỉ ở mức tương đối, nhưng nó được áp dụng rộng rãi bởi vì
như một mô hình dễ dàng để ước lượng và áp dụng trong thực tế. Thiết kế thí
nghiệm ít.
1.4.2 Nguyên lý
Phương pháp bề mặt đáp ứng là một tập hợp các kỹ thuật thống kê và toán
học hữu ích cho phát triển, cải thiện và tối ưu hóa quá trình.
RSM sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một phản
ứng tối ưu. Box và Wilson đề nghị sử dụng một mô hình đa thức bậc hai để làm
điều này.
Để thiết kế chương trình cần có yếu tố đầu vào (x) và hàm mục tiêu (y)
18

ji
ji
jjj
k
j
jj
k
j
xxbxbxbby



2
11
0

Trong đó x
i

, x
j
là các biến độc lập
Hàm xấp xỉ
), ,2,1(
,
1
0
22110
ni
x
xxxy
i
k
j
ijj
iikkiii



















1.4.3 Ứng dụng
Phương pháp mặt đáp ứng đã được sử dụng trong nhiều năm trong ngành vật
lý học. Cho đến nay phương pháp được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học
và các khoa học khác. Phương pháp mặt đáp ứng là một công cụ hữu ích để nghiên
cứu các quá trình phức tạp. Nó đã được áp dụng thành công để tối ưu hóa điều kiện
xử lý như nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme/cơ chất
đến mức độ thủy phân, thu nhận protein. RSM xác định ảnh hưởng của các biến
khác nhau, đơn lẻ hoặc đồng tác động.
Tác giả Wanna Choorit (2008) và cộng sự sử dụng phương pháp mặt đáp ứng
để xác định hiệu suất khử khoáng trong quy trình lên men vỏ tôm. Theo N. Bhaskar
(2006) tối ưu hóa điều kiện lên men phế liệu tôm bằng Pediococus acidolactici
CFR2182 sử dụng phương pháp mặt đáp ứng và ảnh hưởng các điều kiện sau khi tối
ưu lên quá trình khử protein và khử khoáng và việc thu nhận carotenoid recovery.
1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.5.1 Khái quát về enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein mà chỉ cần
lượng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một lượng cơ chất lớn thành sản phầm.
Enzyme đa phần đều là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ
tính chất của một protein thông thường. Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn
12000 Dalton. Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong
dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực… Enzyme dễ