Định danh loài gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trùng gnathostoma sp trong ký chủ trung gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
==========



LÊ THỊ NGỌC DUNG


ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI
ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG
GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC






NhaTrang, tháng 6 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
==========

ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI
ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG
GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hƣớng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN ĐỨC TÂN
TS. TẠ THỊ MINH NGỌC
Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG
MSSV: 50130219
Lớp: 50CNSH
Khóa: 50


NhaTrang, tháng 6 năm 2012
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ
sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo
và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến cô giáo TS. Tạ
Thị Minh Ngọc đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Đức Tân
(Phân viện trưởng Phân viện Thú Y Miền Trung – Trưởng bộ môn nghiên cứu
Ký Sinh Trùng), Th.S Lê Đức Quyết ( Phó trưởng bộ môn nghiên cứu Ký Sinh

Trùng), Th.S Nguyễn Văn Thoại, Cô Sâm và các anh ở bộ môn nghiên cứu Ký
Sinh Trùng;cùng các cô, chú, anh, chị tại đơn vị thực tập đã tận tình hướng
dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại
Phân viện thú y miền Trung.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè,
những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần
rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian
học tập và thực hiện đồ án vừa qua.



Nha Trang, tháng 6 năm 2012
Sinh viên

Lê Thị Ngọc Dung

i

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Đặt vấn đề 1
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2
CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp 4
1.1.1. Hình thái cấu tạo 4

1.1.2. Vòng đời phát triển 5
1.1.3. Sức đề kháng 6
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng 6
1.1.5. Điều trị 6
1.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam và
trên Thế giới 7
1.2.1. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam 7
1.2.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma trên Thế
giới…. 8
1.3. Đặc điểm sinh học của các ký chủ nghiên cứu 11
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Mesocyclops leuckarti 11

ii

1.3.2. Đặc điểm sinh học của lƣơn 12
1.3.3. Đặc điểm sinh học của cá lóc 13
1.3.4. Đặc điểm sinh học của ếch 13
1.4. Phản ứng PCR 14
1.4.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 14
1.4.2. Phân loại phản ứng PCR 17
1.4.3. Các chỉ tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 22
1.4.3.1.Các loại mẫu DNA làm khuôn 23
1.4.3.2.Enzym DNA – polymerase 23
1.4.3.3.Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi 24
1.4.3.4.I–on Magiê (Mg
2+
) 25
1.4.3.5.Thành phần dNTP 25
1.4.3.6.Nƣớc 25
1.4.3.7.Thời gian và số lƣợng chu kỳ của phản ứng PCR 25

1.4.3.8.Yếu tố nhiệt độ của chu trình nhiệt 26
1.4.4. Phát hiện sản phẩm PCR 26
1.4.5. Độ tin cậy của phƣơng pháp PCR 28
CHƢƠNG 2: ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 28
2.1. Địa điểm nghiên cứu 28
2.2. Nội dung nghiên cứu 29
2.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu 29
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 29
2.3.2. Trang thiết bị 29

iii

2.3.3. Các loại hóa chất 29
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 30
2.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và xác định hình thái học 30
2.4.2. Phƣơng pháp giám định loài bằng PCR 30
2.4.3. Phƣơng pháp xét nghiệm cá lóc, lƣơn và ếch 32
2.4.4. Phƣơng pháp gây nhiễm G. spinigerum 33
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 33
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch 34
3.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma dựa vào hình thái học 35
3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lƣơn và ếch 35
3.2.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma phân lập đƣợc ở chó 36
3.3. Kết quả xác định loài bằng kỹ thuật PCR 39
3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum 40
3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 40
3.4.2. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops
leuckarti 42

3.4.3. Kết quả gây nhiễm ấu trùng G. spinigerum cho cá lóc, lƣơn và ếch 45
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47
4.1. Kết quả 47
4.2. Đề xuất ý kiến 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Kí hiệu
Tên viết tắt
G. spinigerum
G = Gnathostoma
N
Tổng số mẫu
L1, L2, L3
Ấu trùng kỳ 1, 2, 3
PCR
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng chuỗi trùng hợp –
phản ứng khuếch đại gen)
DNA
Deoxyribonucle Acid
RNA
Ribonucle Acid

v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3 Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn và ếch tại
tỉnh Khánh Hòa 34
Bảng 3.2. Kích thƣớc ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35
Bảng 3.3. Số móc trên hành đầu của ấu trùng L3 Gnathostoma sp 35
Bảng 3.4. So sánh số móc trên hành đầu của 4 loài Gnathostoma 36
Bảng 3.5. Kích thƣớc giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó 36

Bảng 3.6. Số móc trên hành đầu giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó . 37
Bảng 3.7. Kết quả xác định loài bằng dựa vào hình thái cấu tạo và bằng PCR39
Bảng 3.8. Quá trình phát triển trứng G. spinigerum thành ấu trùng kỳ 2 40
Bảng 3.9. Kích thƣớc ấu trùng kỳ 2 G.spinigerum 40
Bảng 3.10. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops leuckarti 42
Bảng 3.11. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng G. spinigerum ở cá lóc, lƣơn, ếch qua gây
nhiễm thực nghiệm 45














vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp 4
Hình 1.2. Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp 5
Hình 1.3. Giun Gnathostoma sp tạo thành khối U trong dạ dày chó 6
Hình 1.4. Hình thái Mesocyclops leuckarti 11
Hình 1.5. Sơ đồ PCR 17

Hình 3.1. Hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35
Hình 3.2. Giun Gnathostoma sp phân lập ở chó 37
Hình 3.3. Trứng Gnathostoma sp 37
Hình 3.4. Kết quả PCR 39
Hình 3.5. Các giai đoạn phát triển trứng G.spinigerum 42
Biểu đồ 3.1. Liên quan giữa kích thƣớc ấu trùng và cƣờng độ nhiễm ở
Mesocyclopsleuckarti 44
Hình 3.6. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclopsleuckarti 44
Biểu đồ 3.2. Dao động kích thƣớc ấu trùng L3 theo thời gian 45
Hình 3.7: Hình ảnh gây nhiễm cá lóc, lƣơn, ếch 46

1

LỜI MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Gnathostomiasis là bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang ngƣời
do loài giun tròn Gnathostoma sp gây ra. Có 12 loài gây bệnh trên động vật đã
đƣợc ghi nhận, G. spinigerum, G. hispidum, G. turgidum, G.doloresi, G.
nipponicum, G. americanum, G. procyonis, G. miyazakii, G. malaysiae, G.
vietnamicum, G. didelphis và G.brasiliense (Daengsvang, 1980; Miyazaki,
1991). Trong đó có 4 loài gây bệnh trên ngƣời là G.spinigerum, G.hispidum,
G.doloresi và G.nipponicum. Tỷ lệ nhiễm G. spinigerum cao đƣợc thông báo ở
các nƣớc Châu Á nhƣ: Thái Lan, Nhật Bản, Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc,
Philippines, Indoneaia và Việt Nam. Ngƣời đầu tiên nhiễm Gnathostoma sp ở
Việt Nam đƣợc phát hiện năm 1963, trong những năm gần đây có nhiều trƣờng
hợp nhiễm mới đƣợc phát hiện (Lê Thị Xuân, 2003; Trần Phú Mạnh Siêu,
2010).
Vòng đời của Gnathostoma sp đã đƣợc thông báo trƣớc đây
(Daengsvang, 1972). Giun trƣởng thành sống trong khối U của dạ dày của vật
chủ cuối cùng (lợn, chó, mèo), trứng theo phân ra ngoài môi trƣờng với điều

kiện nhiệt độ, ẩm độ thích hợp, ấu trùng sẽ thoát khỏi vỏ trứng, xâm nhập vào
vật chủ trung gian thứ nhất (các loài giáp xác thuộc họ Cyclopidae). Khi vật
chủ trung gian thứ 2 (các loài cá nƣớc ngọt, ếch, lƣơn) ăn phải vật chủ trung
gian thứ nhất (Cyclops), ấu trùng tiếp tục phát triển đến giai đoạn ấu trùng kỳ
3. Ngƣời hoặc lợn, chó, mèo nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng kỳ 3 này.
Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có
ký sinh trùng ở động vật cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc
tính hình thái học và nuôi cấy. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân
loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhƣng trong
nhiều trƣờng hợp khó khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dƣới loài một cách
chính xác (McCarthya, Moore, 2000). Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm
đúng môi trƣờng thích hợp nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ
cho ký sinh trùng, bệnh phẩm đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái
sống, nên các phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất

2

nhiều hạn chế (Mori và Notomi, 2009). Các phƣơng pháp chẩn đoán truyền
thống áp dụng trong lâm sàng và dịch tễ học nhƣ xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng
hay các sản phẩm của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có
những sai số nhất định, tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký
sinh trùng cùng tồn tại ở một nơi nhƣ đƣờng ruột ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ
hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn. Phƣơng pháp sinh học phân tử nhân bản
DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu đƣợc, đặc biệt là phân tích biến đổi
gen/hệ gen đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã
bƣớc đầu chứng minh cho kết quả chính xác hơn nhiều so với phƣơng pháp
truyền thống (Mori và Notomi, 2009). Các số liệu chính xác của các phƣơng
pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hƣớng mới và rất có thể sẽ
làm thay đổi một phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có
(Littlewood, 2008).

Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những
định hƣớng phát triển vƣợt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là
sự phát triển phƣơng pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) đƣợc ứng dụng
cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh
vật, trong đó có ký sinh trùng (Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ
không thể thiếu đƣợc trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký
sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008). Do có tính
nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lƣợng rất ít khuôn DNA của
đối tƣợng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trƣởng nào, PCR đã có thể cho sản
phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu.
Từ thực tế trên, dƣới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng
Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Định danh loài
Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát
triển của ấu trùng Gnathostoma sp trong ký chủ trung gian”
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch
tại Khánh Hòa.
Xác định thành phần loài Gnathostomasp phân lập đƣợc.

3

Nghiên cứu các giai đoạn phát triển ấu trùng Gnathostoma sp ở
Cyclopidae và ở cá lóc, lƣơn, ếch.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn
các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và
bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân
thành cảm ơn!

4

CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp
Gnathostoma thuộc bộ Spiruida, lớp Secernatea, ngành giun tròn
Nematoda, họ Gnathostomatidae, loài Gnathostoma Owen, 1936. Cho tới nay
Gnathostoma có 12 loài gây bệnh ở động vật, trong đó có 4 loài có thể gây
bệnh ở ngƣời đã đƣợc ghi nhận (Daengsvang, 1980).
1.1.1. Hình thái cấu tạo
Giun trƣởng thành dài 11 – 54 mm và rộng 0,9 – 3,1 mm, đỉnh đầu của
giun có 8 hàng móc, thực quản dài 2,4mm, túi cổ nằm bên cạnh ở phần nửa trên
của thực quản, ruột màu đen; tinh hoàn hình ống uốn khúc (James Tseng,
2003). Ấu trùng L3 của giun Gnathostoma spinigerum dài từ 2,5 mm đến 5,1
mm, rộng từ 0,29 mm – 0,51 mm; cấu tạo đặc trƣng của ấu trùng là đỉnh đầu có
4 hàng móc, số móc hàng 1 đến 4 lần lƣợt là 45, 48, 50 và 52 (Bong – Kwang
Jung và cộng sự, 2008). Trứng Gnathostoma có kích thƣớc 38 – 40 µm x 65 –
70 µm và có nắp ở một đầu trứng (James Tseng, 2003).








Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp
: www.med.cmu.ac.th )
Ghi chú: (1): trứng giun Gnathostoma; (2): giun đực trƣởng thành;
(3): giun cái trƣởng thành; (4): ấu trùng giun Gnathostoma; (5): phần đầu ấu

1
2
3
4
5
6
7

5

trùng giun Gnathostoma; (6): phần đầu giun Gnathostoma trƣởng thành; (7):
đuôi của con cái trƣởng thành
1.1.2. Vòng đời phát triển
Vòng đời Gnathostoma sp qua 3 vật chủ, bao gồm 2 vật chủ trung gian
và 1 vật chủ cuối cùng.
Giun trƣởng thành sống trong khối U ở thành dạ dày của vật chủ cuối
cùng (chó, mèo, lợn, hổ, sƣ tử, báo, chồn), ở đây giun đẻ trứng, trứng theo phân
ra ngoài môi trƣờng nƣớc và phát triển phôi. Sau 10 – 15 ngày, trứng nở ra
giai đoạn ấu trùng kỳ 1 (L1).
Ấu trùng L1 bị ăn bởi vật chủ trung gian thứ nhất (giáp xác thuộc họ
Cyclopidae), ấu trùng di hành qua thành dạ dày, tới khoang cơ thể phát triển
thành ấu trùng kỳ 2 sau 7 – 12 ngày. Kích thƣớc ấu trùng 0,49 – 0,52 mm.
Khi vật chủ trung gian thứ 2 (cá, ếch, rắn, lƣơn, ) ăn phải cyclop đã
nhiễm ấu trùng Gnathostoma, ấu trùng di hành qua thành dạ dày đến gan hoặc
cơ phát triển thành ấu trùng kỳ 3 hoàn thiện. Nếu vật chủ cuối cùng ăn phải vật
chủ trung gian thứ 2, ấu trùng phát triển đến giun trƣởng thành khoảng 6 – 8
tháng.

Hình 1.2. Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp
(Nguồn dpd.cdc.gov/dpdx/html/Gnathostomiasis.htm)

6









Hình 1.3. Giun Gnathostoma sp tạo thành khối U trong dạ dày chó

1.1.3. Sức đề kháng
Ấu trùng G. spinigerum có sức đề kháng cao đối với các tác nhân vật lý
và hóa học, ấu trùng có thể tồn tại 8 ngày trong dung dịch giấm (4% acide
acetic), 5 ngày trong nƣớc chanh, 8 – 9 ngày trong cồn 28% – 35%. Ấu trùng
nằm sâu 2cm trong cơ cá, phải đun sôi 2 phút mới làm vô hoạt đƣợc (Setasuban
P, 1981).
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng
Vật chủ cuối cùng mắc bệnh thƣờng biểu hiện: nôn mửa, kém ăn, rối
loạn tiêu hóa, gầy yếu, suy nhƣợc cơ thể kéo dài; giảm tăng trọng 20% so với
những con bình thƣờng. Một số trƣờng hợp bệnh nặng có thể chảy máu dạ dày.

Đối với ngƣời, ấu trùng di hành qua thành ruột, qua gan rồi đến các mô
ở da, thần kinh hay các cơ quan khác gây nên hiện tƣợng viêm nhiễm ở da, tăng
bạch cầu Eosinophil, ho ra máu, tiểu ra máu, giảm thị lực, viêm não tủy, viêm
màng não. Bệnh nhân có thể tử vong do xuất huyết hoặc hoại tử não (Robert W
Tolan, 2009).
1.1.5. Điều trị
Một số tác giả nghiên cứu điều trị bệnh cho thấy: thuốc Albendazol với
liều 90mg/kg thể trọng điều trị ở chuột nhiễm giun Gnathostoma có tác dụng
làm giảm số lƣợng giun rõ rệt (Maleewong và cộng sự, 1992). Thuốc Ivermetin

7

với liều 2mg/kg thể trọng làm giảm cƣờng độ nhiễm 83,3% ở chuột cống gây
nhiễm 20 ấu trùng (Anantaphruti MT và cộng sự, 2010).
1.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam và
trên Thế giới
1.2.1. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam
Theo các thông báo thì có 4 loài Gnathostoma đã đƣợc tìm thấy trên
động vật là G. spinigerum, G. hispidum, G. doloresi và G. vietnamicum (Le
VH và ctv, 1965).
Từ năm 1989 đến 1991, Phạm Sỹ Lăng và ctv đã khảo sát thú ăn thịt ở
vƣờn thú Thủ Lệ và chó cảnh đã phát hiện Gnathostoma sp trên thú họ mèo (1
hổ, 2 báo, 2 mèo rừng và 2 sƣ tử). Năm 1996, Ngô Huyền Thúy đã mổ khảm
516 chó và xét nghiệm 1092 mẫu phân chó ở Hà Nội nhƣng không phát hiện
chó nhiễm Gnathostoma sp. Lê Hữu Nghị và ctv (2000) đã khảo sát giun sán
ký sinh ở 130 chó tại Huế và cũng không phát hiện đƣợc loài này.
Tỷ lệ nhiễm Gnathostoma trên lợn tại vùng Đông Nam Bộ là 0,6%,
vùng miền Trung là 1,5%, vùng Đồng bằng sông Cửu Long là 39%. Tỷ lệ
nhiễm Gnathostoma ở lợn biến động khá lớn giữa các tỉnh: ở thành phố Hồ Chí
Minh là 4%, ở Thừa Thiên Huế là 7,5%, ở Minh Hải là 43%, và ở Kiên Giang

là 54,9% (Phạm Văn Khuê, Phan Lục, 1996).
Lê Thị Xuân, Rojekittikhun W (2000) cho biết lƣơn ở thành phố Hồ Chí
Minh nhiễm là 0,11%, cƣờng độ nhiễm 2,9 ấu trùng/lƣơn, tỷ lệ nhiễm cao nhất
ở tháng 10 và thấp nhất ở tháng 3 và tháng 4.
Nguyễn Văn Đề (2004) đã điều tra thực trạng nhiễm ấu trùng sán lá gan
nhỏ và ấu trùng Gnathostoma trên 10 loài cá nƣớc ngọt tại 5 chợ ở Hà Nội (cá
mè, cá rô phi, cá trắm, cá trôi, cá chày, cá chép, cá diếc, cá chuối, cá trê và
lƣơn). Kết quả phát hiện 7 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ và chỉ có lƣơn
nhiễm ấu trùng Gnathostoma spinigerum.
Năm 2007, Lê Hữu Khƣơng và Võ Hồng Cẩm Phƣơng đã tiến hành mổ
khảm trên 2448 chó tại 18 tỉnh thành phía Nam đã thu trên 370 mẫu giun ký

8

sinh ở dạ dày chó. Kết quả định danh cho thấy chỉ có một loài G. spinigerum,
10 trong số 18 tỉnh có sự hiện diện của loài giun này, đã phát hiện 101 chó
nhiễm G.spinigerum, tỷ lệ nhiễm trung bình là 4,12%.
Theo Lê Thị Xuân và cộng sự (2004) thì động vật nhiễm Gnathostoma
đã đƣợc báo cáo ở Việt Nam từ năm 1914. Ngƣời nhiễm Gnathostoma đầu tiên
đƣợc ghi nhận vào năm 1965, nhƣng cho đến năm 1999 cũng chỉ ghi nhận thêm
4 trƣờng hợp. Tuy nhiên, từ năm 1999 đến năm 2004 khoa Ký sinh trùng, Đại
học Dƣợc và Y khoa, thành phố Hồ Chí Minh dùng kỹ thuật miễn dịch học đã
phát hiện trên 600 ngƣời có huyết thanh dƣơng tính với Gnathostoma.
Trần Phú Mạnh Siêu và cộng sự (2009) cho biết, lƣơn ở Củ Chi và Long
An nhiễm G.spinigerum từ 0,8% – 19,6%, tỷ lệ nhiễm cao nhất là vào các
tháng 9, 10 và thấp nhất vào tháng 2, 3.
1.2.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma trên Thế giới
Giun trƣởng thành G. spinigerum ký sinh ở chó, mèo; ấu trùng có khả
năng gây bệnh Gnathostoma ở ngƣời và ở nhiều loại động vật khác; tỷ lệ nhiễm
đƣợc thông báo chủ yếu ở Châu Á và Nam Mỹ (Daengsvang, 1981).

Vật chủ trung gian thứ nhất của Gnathostoma gồm 4 loài Cyclops
(Mesocyclops leuckarti, Eucyclops agilis, Cyclops varicans và Thermocyclops
sp). Cyclops sau khi nhiễm ấu trùng Gnathostoma, giai đoạn đầu ấu trùng xuất
hiện trong dạ dày và thoát vỏ trở thành ấu trùng giai đoạn thứ 2, sau 0,5 – 2 giờ
ấu trùng di hành đến xoang bụng (kích thƣớc 293 x 13 µm), 24 giờ (kích thƣớc
260 x 17 µm), đến ngày thứ 6 ấu trùng phát triển thành ấu trùng giai đoạn 3
(L3) (kích thƣớc 460 x 45 µm). Ở nhiệt độ 29 – 31
o
C trong 7 ngày hầu hết ấu
trùng phát triển thành ấu trùng L3, nếu nhiệt độ 25 – 29
o
C thì thời gian phát
triển chậm hơn. Ở nhiệt độ 29 – 31
o
C trong 8 – 9 ngày toàn bộ ấu trùng phát
triển thành ấu trùng L3 và đến ngày thứ 10 ấu trùng có kích thƣớc 274 – 445 x
46 – 69 µm (Daengsvang, 1980).
Có khoảng 30 loài động vật có xƣơng sống là vật chủ trung gian thứ 2
của Gnathostoma sp, trong đó gồm có 2 loài cá nƣớc ngọt (Channastriata,

9

Clarias macrocephalus), 5 loài động vật lƣỡng cƣ (frogs và toads), 5 loài động
vật có xƣơng sống (ground lizard, tree lizard, gecko, skink và turtle), 3 loài
chim (domestic fowl, domestic duck và quail), 13 loài động vật có vú (Norway
rat, white rat, black rat, little house rat, white mouse, hamster, guinea pig, tree
shrew, squirrel, domestic pig, Macaque monkeys và leafmonkey), 2 loài giáp
xác (fresh – water crab: Paratelphusa sexpunctatum và Potamon smithanus)
(Daengsvang, 1980).
Năm 1889, Levinsen đã báo cáo ngƣời nhiễm Gnathostoma đầu tiên ở

Thái Lan, sau đó ở các nƣớc Ấn Độ, Nhật Bản, Australia, … Hầu hết ngƣời
nhiễm bệnh đều đƣợc xác định là loài G. spinigerum, một số ít là loài G.
hispidum (Beaver và cs 1984).
Theo Niti – Uthai S, (1974) cho biết, nếu cá ăn phải cyclops có chứa
mầm bệnh Gnathostoma sp, sau 1 – 2 ngày tìm thấy ấu trùng kỳ 3 trong dạ dày
và ruột, sau đó tìm thấy ở cơ, gan và ấu trùng tạo kén trong thời gian 6 – 61
ngày sau khi nhiễm. Cá nƣớc ngọt, nƣớc lợ Mugil sp, Chanos đều tìm thấy ấu
trùng G. spinigerum trong tự nhiên và gây nhiễm nhân tạo, tỷ lệ nhiễm lần lƣợt
56.0% và 80.0% ở gây nhiễm nhân tạo và 53.3%, 30.0% nhiễm tự nhiên.
Sau khi vật chủ cuối cùng (chó, mèo, lợn) nhiễm bệnh, ấu trùng di hành
đến dạ dày, ruột, gan, sau đó đến cơ. Ấu trùng phát triển thành Gnathostoma
spp trƣởng thành ở thành dạ dày, tại đây giun tác động đến vật chủ và tạo nên
các khối u ở thành dạ dày (thƣờng là 1 khối u, ít khi là 2 hoặc hơn). Thời gian
phát triển thành giun trƣởng thành tùy từng vật chủ và đƣờng gây nhiễm : nếu
mèo nhiễm ấu trùng L3 G. spinigerum bằng đƣờng da, thời gian phát triển
khoảng 2 – 7 tháng (59 – 227 ngày), cƣờng độ nhiễm 52 Gnathostoma sp/mèo
và tỷ lệ nhiễm 29% – 94%, nếu mèo nhiễm qua đƣờng tiêu hóa, thời gian phát
triển khoảng 2,7 – 12 tháng (84 – 247 ngày), trứng Gnathostoma sp tìm thấy ở
tháng 1,2 – 7,4 (37 – 223 ngày). Ở chó nếu nhiễm qua đƣờng tiêu hóa thời gian
phát triển khoảng 3 – 8 tháng (84 – 247 ngày), tỷ lệ nhiễm 63% (Daengsvang,
1980), khi gây nhiễm qua da thời gian phát triển khoảng 160 – 273 ngày (5,3 –
9,1 tháng), trứng tìm thấy ở ngày 103 – 232 (3,4 – 7,7 tháng) (Rojekittikhun W

10

et al., 1996).
Maleewong (1992) điều tra ở Thái Lan cho thấy tỷ lệ nhiễm
Gnathostoma spinigerum ở chó là 4,1%, tỷ lệ nhiễm cao ở mùa mƣa và đầu
mùa đông (tháng 8 đến tháng 10) và thấp ở mùa hè (tháng 3, tháng 4).
Woon Mok Sohn (1993) đã phân lập đƣợc 6 ấu trùng L3 G. nipponicum

từ 376 con cá chạch nhập khẩu từ Trung Quốc. Ấu trùng L3 có kích thƣớc
trung bình 614 x 114 µm, không màu, ruột có màu hơi nâu, bao quanh cơ thể
có lớp biểu bì, phần đầu có 3 hàng móc.
Ogata K và cộng sự (1998) cho thấy ở Mexico trƣờng hợp ngƣời bị bệnh
đầu tiên đƣợc phát hiện vào năm 1970, từ đó đến nay số bệnh nhân tăng lên
nhanh chóng.
Roberto J. Almeyda–Artigas và cộng sự, (2000) đã giải trình tự gen
ITS–2 rDNA cho thấy loài Gnathostoma spinigerum ở Thái Lan khác với loài
Gnathostoma binucleatum ở Mexico và Ecuador. Loài Gnathostoma turgidum,
Gnathostoma sp.I chính là loài Gnathostoma procyonis (Almeyda–Artigas,
1994). Ở Mexico Gnathostoma gây bệnh cho ngƣời đƣợc xác định là loài G.
spinigerum và G. binucleatum.
Rojekittikhun và cộng sự (2002) nghiên cứu ở Thái Lan cho thấy tỷ lệ
nhiễm trứng giun Gnathostoma ở phân chó giao động từ 1,6%–6,9%, ở phân
mèo từ 1,9%–8,3%. Cƣờng độ nhiễm cao nhất là 72 ấu trùng/chó và 10 ấu
trùng/mèo. Trong các cơ quan thì u kén cao nhất là ở dạ dày (17,2%), thực
quản (0,6%) và ruột (0,2%). Và từ năm 1985–1988 hàng năm có khoảng 300–
600 bệnh nhân nhiễm giun Gnathostoma và từ 1989 đến nay hàng năm số bệnh
nhân tăng lên thêm từ 100–400 ca/năm.
Rojekittikhun W và cộng sự (2002) cho thấy tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3
Gnathostoma sp ở Nakhon Nayok, Thái Lan là 30,1%, cƣờng độ nhiễm trung
bình 10 ấu trùng/lƣơn, trong đó tỷ lệ nhiễm cao nhất là tháng 8 (44,1%) và thấp
nhất là tháng 3 (10,7%).

11

Sakamoto Mitsuo và cộng sự (2004) đã phát hiện một bệnh nhân ở Nhật
Bản nhiễm Gnathostoma spinigerum, bệnh nhân có hiện tƣợng tăng bạch cầu
Eosinophil, có phản ứng huyết thanh dƣơng tính với Gnathostoma và tìm thấy
ấu trùng giun ở vết thƣơng bàn tay phải.

Florencia Bertoni – Ruiz (2005) cho biết: Gnathostoma lamothei đƣợc
tìm thấy ở dạ dày động vật ăn thịt. Sự khác nhau về cấu tạo ở phần đầu và bề
mặt cơ thể giữa các loài Gnathostoma, giải trình tự gen ITS2 loài G. lamothei
cho thấy sai khác (<50%) so với các loài khác đã đƣợc phát hiện tại Mexico
(Gnathostoma binucleatum, Gnathostoma turgidum) và tƣơng đồng cao với
Gnathostoma sp (99,2%).
Jimenez et al., (2009), điều tra 74 mẫu cá ở chợ và ngoài đồng tại
Guayas Province, Ecuador, tỷ lệ nhiễm Gnathostoma sp là 69%, cƣờng độ
nhiễm trung bình của 2 vùng là 1,7 ấu trùng/cá.
1.3. Đặc điểm sinh học của các ký chủ nghiên cứu
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Mesocyclops leuckarti (Claus, 1857)
Loài Mesocyclops leuckarti, Rylov, 1948, thuộc họ Cyclopidae, giống
Mesocyclops.
Chuẩn đoán: đốt cuối cùng ngọn râu 1 có tấm trong suốt hình lƣợc, 2
nhánh chạc đuôi dài, túi nhận tinh ở con cái hình chữ T, 2 đầu ngọn thẳng
ngang.




Hình 1.4. Hình thái Mesocyclops leuckarti

Con cái: Phần đầu ngực dài hơn phần bụng, hình bầu dục, 2 nhánh chạc
đuôi gần song song, chiều dài gần gấp 3 – 3,5 lần chiều rộng, cạnh ngoài nhẵn.

12

Tơ trong ngọn chạc đuôi không vƣợt quá nửa rơ giữa trong. Tơ bên đính ở gần
giữa cạnh ngoài (2/5 tơ ngọn). Túi nhận tinh hình chữ T, thân hình túi lớn,
nhánh ngang có viết lõm rộng ở chính giữa, 2 đầu bên nhọn, thẳng ngang. Râu

I dài tới cạnh sau đốt ngực V. Đốt cuối cùng ngọn râu I có 1 tấm trong suốt
hình lƣợc, với vết lõm sâu ở 1/3 chiều dài tơ ngọn. Chân ngực IV có đốt 3
nhánh trong hẹp, dài, 2 gai nhọn đốt này dài xấp xỉ bằng nhau. Tấm nối giữa có
2 núm, đầu núm có 1 gai nhỏ. Chân ngực V có 2 đốt, đốt ngọn có 1 tơ ở đầu
ngọn và 1 gai đính ở khoảng giữa cạnh trong, tơ ngọn dài gần gấp 2 lần tơ giữa.
Con đực: râu I cong lại ở 2 đầu ngọn, chân VI ở đốt bụng I gồm 1 tơ
ngoài dài, 1 tơ giữa ngắn và 1 gai trong. Các chi tiết khác giống con cái.
L(cái): 0,9 – 1,3
L(đực): 0,7 – 1,0
Phân bố: trên toàn thế giới và ở Việt Nam chúng phân bố ở các thủy vực
nƣớc ngọt và nƣớc lợ nhạt vùng đồng bằng, trung du và vùng núi phía Bắc.
1.3.2. Đặc điểm sinh học của lƣơn
Môi trƣờng sống của lƣơn rộng, từ mƣơng rãnh chật hẹp đến ruộng sâu,
ruộng cạn, ao hồ. Lƣơn thích nghi đƣợc với môi trƣờng nƣớc tù đọng, nƣớc lợ,
nƣớc nhiễm phèn nhẹ, miễn là nguồn nƣớc không quá dơ bẩn, hôi thối. Lƣơn
thích sống ở nơi có nhiều bùn, đất thịt hoặc sét pha.
Lƣơn là loài ăn tạp, nhƣng ăn động vật có chất tanh là chính. Khi còn
nhỏ, lƣơn ăn sinh vật phù du, giai đoạn tiếp ăn côn trùng bọ gậy, ấu trùng
chuồn chuồn, đôi khi ăn cả các cá thể hữu cơ vụn nhỏ ( rễ lúa, các tạo sợi…).
Lƣơn lớn ăn giun, ốc, tôm, tép, cá con, nòng nọc và những động vật trên cạn
gần mép nƣớc nhƣ: giun, dế…
Khi thiếu thức ăn, lƣơn có thể ăn thịt lẫn nhau, lƣơn tìm thức ăn nhờ vào
khứu giác là chủ yếu. Mùa lƣơn đẻ, chúng hầu nhƣ không ăn. Nhiệt độ sống
thích hợp là 22 – 28
0
C , lúc nhiệt độ xuống thấp dƣới 10
0
C lƣơn ngừng kiếm ăn

13

và đào hang sâu để sống qua đông. Cƣờng độ ăn mạnh vào tháng 5 – 7, lƣơn
béo vào mùa thu và mùa xuân trƣớc khi lƣơn đẻ.
1.3.3. Đặc điểm sinh học của cá lóc
Cá lóc thƣờng gặp và phân bố rộng có 2 loài là : Ophiocephalus
maculatus và Ophiocephalus arbus, nhƣng đối tƣợng nuôi quan trọng nhất là
loài O.maculatus.
Môi trƣờng sống: Cá lóc thích sống ở những nơi đồng sâu, những nơi có
mực nƣớc sâu cả mét. Ngoài ra cá lóc còn thích nơi yên tĩnh có nhiều rong cỏ
để làm nơi trú ẩn và rình mồi, đồng thời đến mùa sinh sản cũng dùng nơi này
để đẻ.
Cá quả thuộc loại cá dữ. Thức ăn là chân chèo và râu ngành; thân dài 3 –
8 cm ăn côn trùng, cá con và tôm con; thân dài trên 8 cm ăn cá con. Khi trọng
lƣợng nặng 0,5 kg có thể ăn 100 g cá. Trong điều kiện nuôi nó cũng ăn thức ăn
chế biến. Mùa đông không bắt mồi.
Tính thích nghi với môi trƣờng xung quanh rất mạnh, nhờ có cơ quan hô
hấp phụ nên nó có thể hít thở đƣợc O
2
trong không khí. ở vùng nƣớc hàm
lƣợng O
2
thấp cũng vẫn sống đƣợc, có khi không cần nƣớc chỉ cần da và mang
cá có độ ẩm nhất định vẫn có thể sống đƣợc thời gian khá lâu.
Nhiệt độ sống thích hợp từ 20
0
C – 30
0
C, có khả năng chịu nóng hơn là
chịu lạnh.
1.3.4. Đặc điểm sinh học của ếch

Ếch đồng sống ở khắp nơi ao hồ, đồng ruộng, sông ngòi, mƣơng máng,
những nơi ẩm ƣớt và có nguồn nƣớc ngọt. Ếch thích sống ở những nơi thực sự
yên tĩnh, ít ngƣời qua lại, và những nơi nƣớc béo, có nhiều thức ăn thiên nhiên:
ruồi, muỗi, giun, ốc, trai, hến, các loại ấu trùng côn trùng.
Ngoài thức ăn tự nhiên nói trên, ếch còn ăn các loại cám gạo, bột ngô,
bột ngũ cốc trộn với cá, tôm, tép, lƣơn, chạch. Khi còn nhỏ, chúng rất thích ăn
cám gạo (có Canxi giúp cho nòng nọc phát triển bộ xƣơng), ốc, cua, cá giã nhỏ
và các ấu trùng côn trùng ếch có khả năng nhảy xa, bơi lội giỏi, song thực chất

14

chúng sống khá thụ động, chỉ quanh quẩn gần nơi ở. Ếch thƣờng ngồi một chỗ
để quan sát những con mồi di động.
1.4. Phản ứng PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerasa Chain Reaction (Phản ứng
chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen). Đây là kỹ thuật của sinh học phân
tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể
sinh vật thành nhiều bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt, kỹ thuật này đƣợc nhà
khoa học ngƣời Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty
Cetus; mặc dù nguyên tắc này đã đƣợc mô tả chi tiết trƣớc đó một thập niên bởi
Khorana và cộng sự, (Panet và cộng sự, 1974), và đƣợc giới thiệu lần đầu tiên
tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận
đƣợc giải thƣởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. Kể từ đó đã tạo nên một
tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.
Phản ứng PCR đƣợc hoàn thiện vào giữa những năm 80 và đã đƣa lại
một cuộc cách mạng trong nghiên cứu di truyền học phân tử. PCR là một kỹ
thuật phòng thí nghiệm tƣơng đối dễ làm, mặc dù đó là một kỹ thuật rất đa
năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là DNA có
chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn DNA. Không phải lúc nào cũng cần thiết
phải tách chiết và tinh khiết DNA khuôn, vì việc đó đã đƣợc các đoạn mồi

dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu DNA làm khuôn đƣợc tinh khiết
thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lƣợng DNA khuôn cần cho
phản ứng PCR rất nhỏ.
1.4.1. Nguyên lý của phản ứng PCR
 Nguyên lý nhân gen trong tế bào:
DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định đặc tính của cơ thể
(ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với những sinh
vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dƣới dạng kết hợp
với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan
khác nhƣ ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid.

15

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thƣờng chỉ đƣợc nhân
lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện đƣợc quá trình này,
đòi hỏi phải có mặt enzyme DNA polymerasa, sự tham gia của các đoạn mồi có
trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTP làm nguồn cung cấp
nucleotit. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép đƣợc mở
xoắn tách thành các sợi DNA sợi đơn. Dƣới tác dụng của enzyme DNA
polymerase, quá trình tổng hợp DNA đƣợc xảy ra theo cách gắn lần lƣợt các
nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA
khuôn.
 Nguyên lý của kỹ thuật PCR
Nguyên lý của PCR là dùng mồi nucleotide lai bổ sung vào một đầu của
đoạn DNA cần tìm rồi men DNA polymerase sẽ khuếch đại và nhân bội lên
theo một dây chuyền phản ứng, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình
thành mạch mới từ đó dễ dàng cho việc quan sát và xét nghiệm.
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ
bản của sao chép DNA trong cơ thể nhƣng có sự khác biệt:
+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.

+ Kết hợp với enzyme DNA polymerasa chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới
trong môi trƣờng thích hợp.
+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi đƣợc thiết kế
chuyên biệt, chủ động.
Phƣơng pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn
DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phƣơng pháp hiện đại và thuận tiện cho việc
xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phƣơng pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ
cao của DNA polymerasa đƣợc tìm thấy trong các sinh vật ƣa nhiệt (vi khuẩn
sống trong các suối nƣớc nóng). Phần lớn các DNA polymerasa chỉ làm việc ở
nhiệt độ thấp. Nhƣng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerasa
không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhƣng
các polymerasa chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến

16

100
0
C. Ở nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở
dạng thẳng). Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo
dài.
* Chu kỳ nhiệt
Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng đƣợc lặp đi lặp lại
nhiều lần (chu kỳ) (thƣờng từ 25 đến 75 chu kỳ).
Giai đoạn biến tính (denaturation):
Tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 –
96°C để tách hai sợi DNA ra. Bƣớc này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ
phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trƣớc chu kỳ 1, DNA thƣờng đƣợc
biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi đƣợc phân tách

hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 – 2
phút.
Giai đoạn bắt cặp (annealing):
Gắn cặp mồi đặc trƣng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách
ra, nhiệt độ đƣợc hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai
đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thƣờng thấp hơn nhiệt độ biến tính
khoảng 45 – 60°C. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn
mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian
bắt cặp từ 1 – 2 phút.
Giai đoạn kéo dài (extension):
Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerasa gắn
tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt
độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerasa. Thời gian của bƣớc này phụ thuộc vào
cả DNA-polymerasa và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Nhƣ một quy tắc
1000bp/1 phút. Các đoạn DNA mới đƣợc hình thành lại đƣợc sử làm khuôn để
tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Nhƣ vậy số lƣợng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau
mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lƣợng bản sao là 2n.