NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLYMANNURONIC AXÍT từ RONG nâu ở TỈNH KHÁNH HOÀ

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CHẾ BIẾN
====





====





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT POLYMANNURONIC AXÍT TỪ RONG NÂU
Ở TỈNH KHÁNH HỒ

GVHD : Nguyễn Duy Nhất
SVTH : Nguyễn Văn Long
MSSV : 47134271
LỚP : 47TP - 3





Nha Trang, tháng 06 năm 2009

2

LỜI CẢM ƠN


ðược sự ñồng ý của ban giám hiệu trường ñại học Nha Trang, ban chủ
nhiệm khoa chế biến tôi ñược giao thực hiện luận văn tốt nghiệp tại viện
nghiên cứu và ứng dụng Nha Trang.
Trong quá trình thực hiện luận văn tôi ñã nhận ñược sự gúp ñỡ của thầy
cô trong khoa, giáo viên hướng dẫn, các bộ công tác trong viện nghiên cứu và
ứng dụng nha trang. Tôi xin trân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhất, TS. Vũ
Duy ðô, thầy cô trong khoa chế biến, các bộ trong viện nghiên cứu và ứng
dụng Nha Trang ñã gúp tôi hòan thành luận văn tốt nghiệp.

3

MỤC LỤC

Trang
ðẶT VẤN ðỀ 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 9
1.1.
PHÂN LOẠI VÀ ỨNG DỤNG RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI 9
1.1.1.
TÌNH HÌNH Sử DụNG RONG BIểN 9
1.1.2.
PHÂN LOạI RONG BIểN 10
1.1.3.
PHÂN Bố CủA 3 NGÀNH RONG BIểN TRÊN THế GIớI : 12
1.1.4. SảN LƯợNG RONG BIểN TRÊN THế GIớI: 13
1.1.5.
RONG MƠ VIệT NAM: 14
1.2. XÁC ðỊNH POLYMANNURONIC AXÍT (MANNURONAN) 15
1.2.1.C
ấU TRÚC MANNURONAN 15
1.2.2.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU Sự CÓ MặT CủA NANNURONAN 16
1.2.2.1.Xác ñịnh thành phần mannuronic bằng phương pháp HPEAD: 16
1.2.2.2. Phổ NMR của mannuronan. 16
1.3.
PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MANNURONAN TỪ RONG NÂU 18
1.3.1
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT MANNURONAN THÔNG QUA TÁCH CHIếT ALGINATE 18
I.3.1.1 Phương pháp chiết alginate 18
1.3.1.2 Thủy phân từng phần alginate thu mannuronan 21
1.3.2
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT MANNURONAN KHÔNG QUA TÁCH CHIẾT

ALGINATE
22
1.4.
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MANNURONAN 24
CHƯƠNG 2: ðỐI TƯỢNG VÀ THỰC NGHIỆM 25
2.1.ðỐI
TƯỢNG NGHIÊN CỨU: 25
2.2. THỰC NGHIỆM: 26
2.2.1.
TÁCH CHIẾT MANNURONAN: SƠ ðỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT THỰC
NGHIỆM. 26
2.2.1.1. Bố trí khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate: 27
2.2.1.2. Khảo sát thời gian chiết: 28

4

2.2.1.3. Khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan ra khỏi dịch chiết nước
ban ñầu: 30
2.2.1.4. Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch: 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1:
KHảO SÁT NHIệT ðộ CHIếT ðể SảN PHẩM KHÔNG CHứA ALGINATE 33
3.2
KHảO SÁT THờI GIAN CHIếT: 34
3.2
KHảO SÁT NồNG ðộ ETHANOL ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DUNG DịCH: 35
3.3.
KHảO SÁT NồNG ðộ AXÍT ACETIC ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DịCH CHIếT NƯớC
BAN ðầU
35

3.5.
ðỀ XUẤT QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT POLYMANURONIC TỪ RONG NÂU 38
KẾT LUẬN 41
ðỀ XUẤT Ý KIẾN 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44





















5

DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3
ngành chính 10
Bảng 1.2: Các dạng hydratcacbon trong 3 ngành rong biển 11
Bảng 1.3 ñộ dịch chuyển hóa học trong phổ CNMR của mannuronan 17

6

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1: phổ CNMR của mannuronan 17
Hình 1.2 phổ HNMR và CNMR của alginate gồm khối G và khối M 18
Hình 1.3 : Sơ ñồ chiết alginate từ rong nâu 20
Hình 1.4 : Sơ ñồ tách chiết mannuronan từ alginate 22
Hình 2.1: Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát thực nghiệm 26
Hình 2.2: sơ ñồ khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate. 27
Cách tiến hành: 27
Hình 2.3. Sơ ñồ khảo sát thời gian nấu chiết 28
Hình 2.4: Sơ ñồ khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan 30
Hình 2.5: Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch 31
Hình 3.1: sơ ñồ quy trình chiết polymannuronic axit từ rong nâu 38

7

ðẶT VẤN ðỀ
Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay ñổi môi trường sinh thái
rất ña dạng, phong phú. Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam
thì nguồn rong biển, ñặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng. Theo
thống kê chưa ñầy ñủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước
ta ñã có hơn 70 loài với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm .

Các hợp chất trong rong nâu có nhiều tính chất hóa lý, hoạt tính sinh
học quí như alginate, fucoidan, laminaran, mannitol, iod hữu cơ, các hợp chất
chuyển hóa thứ cấp …, ñược sử dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm,
mỹ phẩm, dệt, nhuộm, in, thức ăn gia súc, dược liệu …Ngoài những thành
phần ñó, rong nâu còn chứa một lượng tương ñối lớn polymannuronic axít
(mannuronan), thông thường ñể có ñược mannuronan, người ta phải tách chiết
alginate sau ñó thủy phân trong môi trường axít mạnh thành các khối
mannuronan (block M), guluronan (block G) và block MG. Tuy nhiên, trong
một vài nghiên cứu gần ñây các nhà khoa học ñã cho thấy mannuronan thực
tế là một thành phần riêng biệt có mặt trong rong nâu, có thể tách chiết khỏi
các polysacarit khác mà không cần phải thủy phân từ alginic axít.
Mannuronan có hoạt tính sinh học rất quí ñó là có khả năng sử dụng ñể ñiều
trị bệnh ung thư. Khác với các polysacarit khác có hoạt tính kháng ung thư
trong rong nâu như fucoidan, alginate (heteropolysaccharide), laminaran (có tỉ
lệ liên kết 1→3 và 1→6 biến ñổi tùy theo loài rong), mannuronan có cấu trúc
rõ ràng, thành phần ñơn phân tử chỉ có mannuronic axít, các ñơn phân tử liên
kết với nhau theo mạch thẳng. ðó chính là ñặc ñiểm cần thiết ñể ổn ñịnh hoạt
lực và là ñiều kiện kiên quyết ñể sử dụng làm thuốc trong y học. ðẩy mạnh
nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài rong biển
Việt Nam, trong ñó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có
hiệu quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của

8

ðảng và Chính phủ. ðây là vấn ñề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế
xã hội rất cao, phù hợp với xu hướng phát triển của ñất nước.
Từ những lý do nêu trên, ñể hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về rong
nâu, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và ñể tạo ra những chế
phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng ñồng chúng tôi ñặt vấn ñề thực hiện
ñề tài:

“ Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà sử
dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ ñiều trị bệnh ung thư”

Với nhiệm vụ của luận án là:
- Nghiên cứu các phương pháp tách chiết polymannuronic axít
ñã ñược công bố, từ ñó rút ra phương pháp chiết
polymannuronic axít, phù hợp với ñiều kiện sử dụng làm thực
phẩm chức năng.
- Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ñộc lập với tách
chiết alginic axít.
- Xác ñịnh sự có mặt và hàm lượng của polymannuronic axít
trong sản phẩm.
- Phân tích các chỉ tiêu hóa, lý, sinh và tìm tài liệu ñã công bố
polymannuronic axít có khả năng ñiều trị bệnh ung thư ñể
chứng minh sản phẩm ñủ ñiều kiện làm thực phẩm chức năng.










9

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1. PHÂN LOẠI VÀ ỨNG DỤNG RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI

1.1.1. Tình hình sử dụng rong biển.
Rong biển ñã ñược sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công
nguyên ở Trung quốc, 600 năm trước công nguyên, rong biển ñã ñược chế
biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa. Thuốc “trường sinh bất tử”
ñược vị hoàng ñế ñầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ Hoàng sử dụng vào
năm 200 trước công nguyên ñã ñược khoa học hiện ñại chứng minh ñó chính
là hợp phần của rong nâu sau hơn 2000 năm. Trong mười năm gần ñây, chính
quyền Trung Quốc ñã chi phí ñến 12 triệu USD ñể phát triển một loại thuốc
trị AIDS từ rong nâu với tên thương phẩm là FUCOIDAN-GLYCOCALYX
(F-GC). Loại thuốc tự nhiên này có khả năng diệt virus HIV, tăng sức chịu
ñựng của phân tử miễn dịch. Ngày 01 tháng 01 năm 2003 loại thuốc này ñã
ñược chính phủ Trung Quốc cấp phép cho sản xuất và ñưa vào sử dụng.
Tại Nhật rong nâu ñã ñược sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V. Cuối
năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ ñã xem xét và
xác nhận các sản phẩm thực phẩm chức năng ở Nhật ñược bổ sung thêm
thành phần fucoidan có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol,
giảm mỡ máu, các sản phẩm này ñã trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan y
phổ biến của nước Nhật .
Rong biển ñã ñược dùng làm thực phẩm trên toàn thế giới rất quen
thuộc với chúng ta (rong ñỏ: agar, carrageenan, rong nâu: alginat), chúng
cũng là nguồn bổ sung dưỡng chất (protein, vitamin, khoáng vi lượng) cho
thức ăn nuôi tôm, thức ăn gia súc, ñược dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm,
mực in, sơn, hàn ñiện, lọc và hấp phụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong
kỹ thuật nuôi cấy vi sinh, ñiện di. Sản phẩm từ rong biển còn là nguyên liệu
không thể thiếu cũng như trong công nghiệp nước giải khát và ñồ hộp, socola,

10
mỹ phẩm cao cấp (carrageenan). Ngoài ra rong biển còn dùng làm chất kích
thích sinh trưởng với chất oligo alginat, laminaran (rong nâu) cùng các hợp
chất như auxin, gibberelin, cytokinin, thường có trong hầu hết các ngành

rong. Rong biển còn ñược sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia
truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác và polyphenol trong rong
nâu cũng ñược dùng làm trà chống lão hoá. ðặc biệt trong thời gian gần ñây
ñã có sáng chế ñăng ký tại Mỹ về nghiên cứu rong biển ñể sản xuất nhiên liệu
sinh học (biodiesel).
1.1.2. Phân loại rong biển.
Hiện nay, rong biển ñược phân thành 3 ngành chính :
1. Ngành rong ðỏ (Rhodophyta)
2. Ngành rong Nâu (Phaeophyta)
3. Ngành rong Lục (Chlorophyta)
Thành phần hoá học của rong biển chủ yếu là nước, các dạng polysacarit
của 3 ngành rong ñược ñưa trong bảng 1.2, thành phần các polysacarit trong
các loài rong ñược thể hiện trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3
ngành chính

Ascophyllum

nodosum
Laminaria
digitata
Alaria
esculenta

Palmaria
palmata
Porphyra sp.

Porphyra
yezoensis

Ulva
species
Ngành rong Nâu Nâu Nâu ðỏ ðỏ ðỏ Lục
Nước (%) 70-85 73-90

73-86

79-88 86 Nd 78
Tro 15-25 73-90

73-86

15-30 8-16 7.8 13-22

hydratcacbon - - - - 40 44.4 42-46


Axít polyuronic
15-30 20-45

21-42

0 0 0 0
Xylan 0 0 0 29-45 0 0 0
Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0

11
Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0
Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 0 0

Floridosid 0 0 0 2-20 Nd nd 0
Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43.6 15-25

Chất béo 2-7 1-2 1-2 0.3-0.8

0.7 2.1 0.6-0.7

Tannin 2-10 c. 1 0.5-6.0

nd Nd nd nd
Kali 2-3 1.3-3.8

nd 7-9 3.3 2.4 o.7
Natri 3-4 0.9-2.2

nd 2.0-2.5

Nd 0.6 3.3
Magie 0.5-0.9

0.5-0.8

nd 0.4-0.5

2.0 nd nd
Iod 0.01-0.1

0.3-1.1

0.05 0.01-0.1

0.0005 nd nd

ðể thấy rõ hơn sự khác nhau về các dạng hydratcacbon trong các ngành
rong ta xem thành phần có mặt của chúng theo bảng 1.2.
Bảng 1.2: Các dạng hydratcacbon trong 3 ngành rong biển
Carbohydrat ðỏ Lục Nâu
Cellulose Cellulose Cellulose Dạng không tan
trong nước
Xylan Xylan
Mannan Mannan
Dạng tan trong nước

Agar Hetero-complex

Alginat
Carrageenan Ion/trung tính Fucoidan
Carragar
Xylan sulfat hoá
Các loại khác
Trong dịch tế bào Tinh bột Floridean

Tinh bột Laminaran
Floridosid ? ? ? Mannitol
Iso-Floridosid
Dạng trọng lư
ợng
phân tử thâp
Sorbitol

12
Từ thành phần các polysaccharide trên bảng 1.1 cho thấy polyuronan chỉ có
trong rong nâu
1.1.3. Phân bố của 3 ngành rong biển trên thế giới :
Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới
chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là
Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài Caulerpa racemosa,
Ulva reticulata, Ulva lactuca. Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các
nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel,
Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar, Bồ ðào Nha, Thailan….
Rong ñỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam bao gồm một số loài
như: Betaphycus gelatinum, Calaglossa leprieurii, Gelidiella acerosa,
Gigartina intermedia, Gloiopeltis spp., Gracilaria spp., Gracilaria asisatica,
Gracilaria coronopifera, Gracilaria eucheumoides, Gracilaria firma,
Gracilaria heteroclada, Gracilaria salicornia, Gracilaria tenuistipitata var.
liui, Hypnea muscoides, Hypnea valentiae, Kappaphycus cottonii, Porphyra
crispata, Porphyra suborbiculata, Acanthophora spicifera. Sau Việt Nam là
Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc cùng số lượng loài
tương ñương nhau, tiếp theo sau là Thailan, Brazil, Pháp, Bồ ðào Nha, Trung
Quốc, Hawaii, Myanmar, Nam Phi, ít hơn nữa là Anh, Bangladesh, Caribbe,
Ireland, Peru, Tây Ban Nha, Achentina, ấn ðộ, Italy, Malaysia, Mexico, New
Zealand, Mỹ. Ngoài ra rong ñỏ còn rải rác có mặt ở Iceland, Alaska, Kenya,
Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Ma rốc, Namibia, Tanzania.
Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là
Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, ấn ðộ, kế tiếp là
Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ ðào Nha.
Trong ñó bộ Fucales, ñối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu ñại

13
diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ

yếu ở vùng cận nhiệt ñới.
Hệ thống phân loại Sargassum trtên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba
loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F. acinarius và F. lendigerus do
Linnaeus mô tả lần ñầu tiên nay ñược thay thế bằng chi Sargassum. Giữa
những năm 1808 ñến 1819, 36 loài rong thuộc chi Fucus ñược mô tả ngày nay
cũng ñược chuyển sang chi Sargassum, năm 1820 J.Agardh giới thiệu chi
Sargassum với số loài lúc này là 62 loài. Sau thời gian ñó rất nhiều tác giả
khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như Yendo (1907), Reinbold (1913),
Grunow (1915, 1916) and Setchell (1931). Số loài Sargassum lên ñến 230.
Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở Úc,
cùng với các tác giả ñương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như
Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của
Philippin, ñến nay tổng số loài của chi Sargassum ñã lên ñến hơn 500.
Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (thực vật chí Việt Nam),
số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay ñổi theo các nghiên
cứu gần ñây nên khó có thể kết luận hiện nay Sargassum phân bố nhiều nhất
ở nước nào. Riêng tính ñến 1998 thì nhiều nhất là ở ấn ðộ, Philippin và Việt
Nam.
Phân bố về số loài rong biển tuy ñã ñược tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ
theo diện tích lãnh hải, ñiều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng
khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân
bố các loài rong.
1.1.4. Sản lượng rong biển trên thế giới:
Rong lục chủ yếu là của Nhật Bản khoảng 4.000 tấn khô với các chi
như Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong ñó nuôi trồng khoảng 2.500
tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippines

14
khoảng 800 tấn chi Caulerpa, gần như toàn bộ do nuôi trồng.
Rong ñỏ chủ yếu là Pháp khoảng 600.000 tấn, chi Maerl, tiếp theo là

Anh khoảng 200.000 tấn, chi Maerl (t ww), ít hơn là Chile khoảng 75.000 tấn
gồm các chi Gracilaria, Gigatina, Gelidium. Nhật Bản khoảng 65.000 tấn,
trong ñó khoảng 60.000 tấn là do nuôi trồng, gồm các chi Porphyra và
Gelidium. Philippines khoảng 40.000 tấn do nuôi trồng bao gồm chi
Euchuema và Kapaphycus. Hàn Quốc cũng có sản lượng tương ñương với
chi Porphyra, tiếp ñến là Trung Quốc với khoảng 31.000 tấn chủ yếu là
Porphyra, Indonesia khoảng 26.000 tấn chi Euchuema và Gracilaria…Việt
Nam khoảng 2.000 tấn chi Gracilaria.
Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên
667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum . Korea
khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng
51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile
khoảng 27.000 tấn…
1.1.5. Rong mơ việt nam:
Năm 1790 Loureiro là tác giả ñầu tiên ñể ý ñến một số loài rong mơ
nhưng chỉ mô tả sơ lược, không hình vẽ trong thực vật chí ðông Dương
“Flora Cochinchinensis”. Năm 1837 cuộc thám hiểm bờ biển Việt Nam ñược
thực hiện trên tàu “La Bonite”, Gaudichaud ñã thu ñược một loài Turbinaria
và 4 loài Sargassum, sau ñó Busseuil thu thêm 4 loài nữa. Mãi ñến năm 1954
Dawson ñến làm việc tại Viện Hải Dương Học Nha Trang có mô tả thêm 2
loài. Toàn bộ các mẫu vật ñó hiện nay ñều không còn lưu giữ tại Việt Nam.
Giáo sư Phạm Hoàng Hộ năm 1961 trong luận án ñã mô tả 15 loài, ñến năm
1967 mô tả ñược 41 loài. ở miền bắc, Nguyễn Hữu Dinh trong luận án năm
1972 mô tả ñược 22 loài, so với rong miền nam ñã bổ sung ñược 9 loài. Năm

15
1992 Nguyễn Hữu ðại trong luận án ñã mô tả 52 loài và trong “Rong mơ Việt
Nam nguồn lợi và sử dụng” 1997 ñã mô tả 68 loài.
Hầu hết các loài rong Mơ sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám,
thích hợp với ñiều kiện sinh thái môi trường có ñộ mặn cao, nước trong và có

sóng. Vì vậy rong Mơ phân bố phổ biến ở các bãi triều ñáy cứng (ñá tảng, ñá,
san hô chết, các rạn ngầm ) ven biển và các ñảo. Do ñặc ñiểm của ñịa hình
có nhiều núi ở ven biển hoặc lấn ra sát biển, ñộ muối ổn ñịnh và cao quanh
năm, các dòng sông ngắn và có nhiều ñảo, nên vùng biển ðà Nẵng (chân ñèo
Hải Vân, bán ñảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng
Ngãi (Bình Châu, ñảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình ðịnh (Phù Mỹ, Qui Nhơn),
Phú Yên (vịnh Xuân ðài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Văn Phong, Hòn
Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh
Phước) có nhiều rong Mơ. Còn vùng bờ biển từ Bình Thuận ñến Bà Rịa-
Vũng Tàu, ven biển có nhiều bãi triều ñáy cát, chỉ có một ít mũi bãi triều ñáy
ñá ở mũi Né, Long Hương (Bình Thuận), Long Hải, Vũng Tàu (Bà Rịa -
Vũng Tàu) nên rong Mơ không nhiều. ðoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh
Kiên Giang chỉ từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) ñến thị xã Hà Tiên,
Mỹ ðức, giáp biên giới Campuchia, xuất hiện nhiều bãi triều ñáy ñá và các
ñảo, ñộ muối cao và ổn ñịnh mới có rong Mơ phát triển. Nhìn một cách tổng
quan vùng ven biển và ñảo từ ðà Nẵng ñến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ
xã Bình An ñến Mỹ ðức Hà Tiên) là hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt
Nam rong Mơ phân bố tập trung.
1.2. XÁC ðỊNH POLYMANNURONIC AXÍT (MANNURONAN).
1.2.1.Cấu trúc mannuronan

Mannuronan hay polymannuronic axít là một polyme mạch thẳng thành
phần là các ñơn phân tử liên kết với nhau bằng liên kết ñường β)1→4


16

1.2.2. Phương pháp nghiên cứu sự có mặt của nannuronan

Trong khuôn khổ của luận văn về chế biến thực phẩm chúng tôi không
trực tiếp tiến hành tiến hành xác ñịnh sự có mặt của mannuronan trong sản
phẩm. Dựa vào kết quả do Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha
Trang xét nghiệm sản phẩm chúng tôi có ñưa ra phần sơ lược giải trình các
kết quả phân tích như sau:
1.2.2.1.Xác ñịnh thành phần mannuronic bằng phương pháp HPEAD:
Mẫu mannuronan ñược thủy phân trong axít trichloacetic thành
monomer sau ñó ñược xác ñịnh trên sắc ký trao ñổi ion hiệu năng cao
(HPEAD) với detector xung ampe ñiện hóa (ñiện cực chuẩn Ag/AgCl ñiện
cực làm việc là ñiện cực Au) chất rửa giải là dung dịch NaOH 0.1N, chất
chuẩn là mannuronic axít.
1.2.2.2. Phổ NMR của mannuronan.
Phổ NMR của mannuronan ñược tác giả T.N. Zvyagintseva mô tả trong
công bố ở tạp chí Journal of Experimental Marine Biology and Ecology vào
năm 2005 có các tín hiệu ñộ dịch chuyển hóa học của carbon trong bảng 1.3



n


17

Bảng 1.3 ñộ dịch chuyển hóa học trong phổ CNMR của mannuronan[3]

với phân bố các pic phổ như hình 1.1















Hình 1.1: phổ CNMR của mannuronan
Tác giả Riki Shiroma năm 2007 trên tạp chí The Japanese society of applied
glycoscience cũng ñã ñưa ra phổ alginate với các tín hiệu khối G (guluronic
axít) và khối M (mannuronic axít) riêng biệt trong hình 1.2


18

Hình 1.2 phổ HNMR và CNMR của alginate gồm khối G và khối M
Từ các dữ liệu phổ nêu trên ta có thể xác ñịnh ñược sự có mặt và ñộ sạch của
polymannuronic axít trong sản phẩm ñiều chế ñược dựa trên phổ NMR.
1.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MANNURONAN TỪ RONG NÂU
1.3.1 Phương pháp tách chiết mannuronan thông qua tách chiết alginate.
I.3.1.1 Phương pháp chiết alginate.
Cho ñến nay, trên thế giới cũng như trong nước ñã có rất nhiều bài viết
công bố về phương pháp chiết alginat. Hầu hết các phương pháp ñều dựa vào
tính tan của alginate sodium và kết tủa của alginic axít ở pH<2 hoặc kết tủa

19
của muối calcium alginate. Ví dụ như các phát minh của Clack & Green
(1936), Lee Gloahec & Hecter (1938), Stanford (1884)… Ở Việt Nam Vào
những năm 70, Bộ Thủy sản ñã nghiên cứu ban hành quy trình sản xuất
Alginate bằng phương pháp formol, Trường ðại Học Thủy sản năm 1997 ñã

nghiên cứu ñưa ra quy trình sản xuất Alginate bằng phương pháp CaCl
2
trên
các loài rong Nâu ở vùng biển Nha Trang và quy trình sản xuất Alginate bằng
phương pháp xử lý Formol trên hai loại rong S.mcclurei và S.kjellmanianum
vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa.
Trước hết, rong nâu phơi khô ñược chiết với HCl loãng ở pH=2 ñể loại
bỏ phần lớn fucoidan và laminaran tan trong dịch chiết. Tiếp theo ñó, bã rong
còn lại ñược rửa hết axít và nấu với dung dịch Na
2
CO
3
3% trong 3 giờ ñể
chuyển alginic axít có trong rong thành dạng alginate tan, phần lớn các kim
loại ngoài kiềm kết hợp với carbonate tạo thành kết tủa ñược giữ lại trong bã
rong. Quá trình chiết ñược tiến hành 2 lần ñể tận thu alginate. Dịch chiết ñược
tách khỏi bã rong bằng máy ly tâm và chạy qua lọc rây phân tử ñến còn lại
khoảng 1/10 thể tích ban ñầu, axít alginic ñược tách khỏi các thành phần khác
bằng cách ñưa HCl vào dịch chiết ñến pH=1, kết tủa alginic acid ñược ly tâm
tách rửa với HCl 0.1M, sau ñó hòa tan lại bằng dung dịch NaOH loãng thu
alginate sodium.







20

Hình 1.3 : Sơ ñồ chiết alginate từ rong nâu
Rong cắt ñến kích thước mm
chiết trong HCl 0.2M 24 giờ
Bã rong 1
Ly tâm Dung dịch 1
Na
2
CO
3
3%
Nấu trong 3 giờ
Dung dịch 2
Ly tâm Bã rong 2

Kết tủa
Trung hòa ñến pH=7
Lọc rây phân tử 100 kDa ñến 1/10 thể tích ñầu ñầu
HCl ñậm ñặc
Dung dịch 3
(ñến pH<2)
Ly tâm, rửa
Dung dịch 4
Dung dịch
NaOH
rất loãng
Sấy phun
Lọc rây phân tử 100 kDa loại muối thử ñến hết Cl
-

Alginate sodium

21
1.3.1.2 Thủy phân từng phần alginate thu mannuronan
Alginate (A) ñược thủy phân trong HCl 0.3M ở 100
0
C kéo dài 5 giờ.
Dung dịch thủy phân và kết tủa ñược ly tâm tách riêng ra, dịch thủy phân là
mạch polymer hỗn hợp bao gồm guluronic axít và mannuronic axít hay còn
gọi là khối MG. Kết tủa ñược hòa tan một phần bằng dung dịch NaOH 0.1M
ñến pH=3.5. Dung dịch và kết tủa ñược ly tâm tách thành 2 phần, dung dịch
A1 chứa khối mannuronate sodium, phần kết tủa ñược hòa tan hoàn toàn
trong NaOH 0.1M và dung dịch A2 sau này chứa khối guluronate sodium.
Uronan trong 2 dung dịch A1 và A2 ñược kết tủa bằng cách thêm vào một thể
tích ethanol bằng với thể tích từng dung dịch, kết tủa ñược ly tâm, rửa vài lần

với ethanol 50% (v/v), ñông khô, phun sấy, hoặc sấy trong chân không ñều
cho thu ñược AlgG và algM. (Phun sấy ở dạng huyền phù trong EtOH ñể
nhiệt ñộ sấy thấp).











22

Hình 1.4 : Sơ ñồ tách chiết mannuronan từ alginate

1.3.2 Phương pháp tách chiết mannuronan không qua tách chiết alginate.
Một phần mannuronan nằm ñộc lập bên ngoài khối alginate có thể chiết thẳng
từ rong nâu bằng phương pháp như sau:
Rong nâu yêu cầu cần phải sạch sẽ không mốc, không thối, không giòn
gãy. ðem rong ngâm rửa trong nước ngọt từ 1,5-2 giờ cho sạch tạp chất muối
còn lại. Rong sau khi ñã ngâm rửa sạch ở trên cho vào ngâm trong dung dịch
Axit alginic
Thuỷ phân ở 100
0
C, HCl 0.3M
Lọc
MG – (dịch thủy
phân)
khối M + khối G
(kết tủa)
Hòa tan kết tủa bằng NaOH 0.1N ñến
pH = 3.5
khối M dạng dung
dịch mannuronate
khối G ở thể rắn Ly tâm
khối G dạng dung
dịch guluronate
Hòa tan kết tủa bằng NaOH 0.1M ñến pH = 7
Kết tủa với EtOH nồng ñộ 50% (v/v), lọc rửa, làm khô.

Mannuronate Na
rắn
Guluronate Na
rắn

23
Formol với hàm lượng 1%. Lượng dung dịch gấp 20 lần lượng rong khô. thời
gian ngâm từ 20-24 giờ, ngâm ở nhiệt ñộ thường luôn luôn nhấn chìm rong
trong dung dịch Formol sau khi kết thúc ñem rửa sạch, ñể ráo và cắt nhỏ.
Rong sau khi ngâm nước ngọt và ngâm formol, polyphenol sẽ bị trùng hợp
thành nhựa phenol-fomaldehyte không tan trong nước nằm lại ở bã rong.
Protein cũng bị formol làm biến tính, ñông tụ nằm lại trong bã rong.
Rong ñược cho vào nồi nấu, cho lượng nước gấp 10-12 lần lượng rong
khô vào nồi nấu. Giữ nhiệt ñộ nồi nấu bằng ở 70°C, thời gian nấu 5 giờ. Sau
khi nấu dịch nấu ñược lọc thô nhằm loại bỏ cặn rong còn lại sau khi nấu.
Dịch lọc sau khi ñã lọc thô, sẽ ñược tiếp tục lọc tinh và cô dịch qua máy
lọc, dịch lọc ñược lọc và cô bằng máy siêu lọc với màng siêu lọc có kích
thước 30.000 Da, tốc ñộ bơm nhu ñộng 100 v/ph. Các phân tử tạp chất, ñộc tố
và các loại muối của kim loại nặng trong dịch lọc có khối lượng phân tử nhỏ
hơn 30.000 kDa sẽ ñược loại bỏ ra ngoài, cô dịch tới khi bằng 1/10 thể tích
ban ñầu.
Cho từ từ axít acetic vào dịch lọc ñến khoảng 40% (v/v) kết tủa
polymannuronic ñược tạo thành. Thu kết tủa bằng máy ly tâm, tốc ñộ máy
2600v/ph, trong thời gian 1h, các polysaccharide khác sẽ nằm lại trong phần
dịch không kết tủa.
Kết tủa sau khi ly tâm tách loại các polysaccharide và tạp chất khác ñược
ñiều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH cho tới trung tính. Ly tâm tách loại phần
kết tủa, polymanuronic ñược tách ra khỏi dịch lọc bằng cách tạo kết tủa trong
ethanol, kết tủa ñược rửa bằng etanol 80% (v/v) ñể loại bỏ muối NaCl tạo
thành do trung hòa, sau ñó rửa tiếp bằng ethanol tuyệt ñối ñể rút bỏ phần nước

còn lại trong polymannuronic, sấy khô trong chân không, xay nhỏ trong cối
mã não ta thu ñược sản phẩm polymannuronic.

24

ðể thu ñược kết tủa và sản phẩm dạng bột, ngoài việc rửa với cồn tuyệt
ñối ta có thể tiến hành bằng cách khác: sau khi hòa tan polymannuronic axít
bằng NaOH, tách bỏ muối NaCl bằng lọc rây phân tử và rửa với nước cất vài
lần ñến khi nước rửa ra không còn ion Cl
−
, thêm ethanol vào dịch ñến nồng
ñộ 50% (v/v), sấy phun huyền phù thu ñược, ở nhiệt ñộ 60°C trên máy sấy
phun.
1.4. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MANNURONAN.
Trong một công trình ñã công bố vào năm 1993 của Marit Otterlei,
trên tạp chí Infection and immunity, tác giả ñã chứng minh ñược mannuronan
thúc ñẩy nhanh quá trình sản xuất tế bào TNFα (tumor necrosis factor alpha),
ñây là loại tế bào có khả năng “lập trình” giáng hóa (tự chết” cho tế bào, ngăn
chặn quá trình phát triển của các khối u, ung thư, ngăn chặn quá trình tái tạo
virut. Polymannuronan hoặc alginate giàu khối mannuronic gây sản xuất tối
ña TNFα ở khối lượng phân tử 50.000Da, sau ñó nhiều tác giả khác cũng ñã
nghiên cứu về hoạt tính hoạt tính này của mannuronan ví dụ như công bố của
Goril Berntzen, trên tạp chí Clinical and diagnostic laboratory immunology,
hoặc Hilde Kristin Hoidal, năm 1999 trên tạp chí The journal of biological
chemistry. Từ kết luận của Marit Otterlei rong qui trình ñiều chế này chúng
tôi ñã sử dụng màng lọc rây kích thước 30.000Da ñể thu ñược mannuronan có
hoạt tính kháng ung thư từ rong nâu.

25
CHƯƠNG 2: ðỐI TƯỢNG VÀ THỰC NGHIỆM
2.1.ðối tượng nghiên cứu:
ðối tượng nghiên cứu là một số loài rong nâu trong họ sargassum khai
thác tại vịnh nha trang, khánh hòa. Rong nâu sau khi ñược thu hoạch ñược
phơi khô tới ñộ ẩm
≤
22% và ñược bảo quản dùng làm nguyên liệu thực
nghiệm.
Rong nâu thu ở vịnh nha trang gồm các loài:
sargassum polycystum
Sargassum denticarpum
Sargassum oligocystum
Sargassum duplicatum
Sargassum mcclurei
Sargassum microcystum
Hóa chất:
- HCHO 34
÷
35%, M= 36,05
- HCL 35
÷
38%, M=36,46
- CH
3
COOH 99,5%, M=60,05
- C
2

H
5
OH 80%
÷
90% (v/v)
- NaOH 96
÷
98%, M=40
Thiết bị phân tích:
- Thiết bị nấu chiết.
- Máy ly tâm.
- Máy lọc rây.
- Máy ño phổ cộng Hưởng NMR Bruker avance 500 MHz.