Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà

25
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC



Nguyễn Duy Nhất



TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
POLYSACARIT TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở TỈNH KHÁNH HOÀ

Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ
Mã số: 62 44 27 01




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC






HÀ NỘI - 2008


26

Công trình được hoàn thành tại:.
VIỆN HOÁ HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
. GS.TSKH. TRẦN VĂN SUNG
TS. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG


Phản biện 1: PGS.TS. VĂN NGỌC HƯỚNG
Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội
Phản biện 2: PGS.TS. LÊ THỊ ANH ĐÀO
Trường ĐH Sư phạm Hà Nội
Phản biện 3: GS.TS.PHẠM THANH KỲ
Trường ĐH Dược Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: .
.
VIỆN HOÁ HỌC

Vào hồi 9 giờ 00 ngày 03 tháng 06 năm 2008



Có thế tìm hiểu luận án tại thư viện: THƯ VIỆN QUỐC GIA .






1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1.1 Tính cấp thiết của luận án:
Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay đổi môi trường sinh thái
rất đa dạng, phong phú. Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam thì
nguồn rong biển, đặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng. Theo thống kê
chưa đầy đủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước ta đã có hơn
70 loài với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm.
Trong số các chất polysacarit có hoạt tính sinh học quí từ rong nâu thì
fucoidan rất đáng được quan tâm nghiên cứu. Fucoidan là một polysacarit sulfat
có cấu tạo gồm mạch chính chứa α-L-fucose sulfat, ngoài ra có thể có D-
galactose, D-mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose và axít D-uronic.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy fucoidan có hoạt tính chống đông cục máu,
kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư,
chống viêm khớp, giảm mỡ máu, ức chế miễm dịch…
Fucoidan chiếm khoảng 4-8% trọng lượng rong nâu khô. Theo đó nước ta
có thể khai thác 400 đến 800 tấn fucoidan thô mỗi năm. Ngoài ra, trong rong nâu
còn có những chất polysacarit khác như alginat, laminaran. Đây cũng là những
sản phẩm quý dùng trong ngành chế biến thực phẩm và sản xuất mỹ phẩm. Đẩy
mạnh nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài rong biển
Việt Nam, trong đó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có hiệu
quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của Đảng và
Chính phủ. Đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế xã hội rất cao,
phù hợp với xu hướng phát triển của quốc tế.
Từ những lý do nêu trên, để hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về
fucoidan, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và để tạo ra những chế
phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề
tài:
“ Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit
trong một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà”

1.2.Mục tiêu của của luận án là:
- Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định của các hợp chất polysacarit từ một số loài thuộc ba
ngành rong biển là: rong đỏ, rong lục và rong nâu thu tại tỉnh
Khánh Hoà.
- Nghiên cứu thành phần polysacarit gồm: alginat, laminaran và
fucoidan của những loài rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà có
hoạt tính gây độc tế bào ung thư.
- Nghiên cứu xác định đặc điểm cấu trúc của phân đoạn fucoidan
có hoạt tính gây độc tế bào từ rong nâu thu ở tỉnh Khánh Hoà.



2
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
¾ Tìm ra một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà chứa fucoidan có
hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm định hướng sử dụng làm nguyên liệu
điều chế thuốc trị bệnh ung thư.
¾ Tổng hợp các phương pháp chiết tách fucoidan trên thế giới, khảo sát các đặc
tính hoá lý của fucoidan từ rong nâu Việt nam cung cấp các số liệu thực
nghiệm nhằm định hướng cho việc sản xuất fucoidan ở Việt Nam.
¾ Từ việc nghiên cứu xác định cấu trúc fucoidan, cung cấp những định hướng
về phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan và định lượng fucoidan từ rong
nâu Việt Nam.
¾ Qua nghiên cứu quan hệ cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của
fucoidan, cung cấp thêm cơ sở dữ liệu định hướng cho phương pháp sản xuất
fucoidan dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ rong nâu Việt nam.
1.4 Những đóng góp mới của luận án:
Luận án là công trình đầu tiên hoàn thành được các nghiên cứu sau:
¾ Đã phát hiện được 6 loài rong nâu phổ biến tại Khánh Hoà có hoạt tính gây

độc tế bào ung thư và đã xác định được thành phần hoá học bao gồm các
polysacarit (alginat, fucoidan, laminaran) của chúng.
¾ Đã hoàn thành qui trình chiết fucoidan thô và tách một số phân đoạn fucoidan
tinh hơn từ 5 loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà.
¾ Đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và gây độc tế bào với tế
bào ung thư màng tim, ung thư phổi và tế bào ung thư gan của một số loài
rong biển phổ biến của Khánh Hoà và một số phân đoạn fucoidan từ chúng.
¾ Đã sử dụng chương trình pascal và thiết bị LC-ESI-MS nhiều lần để nghiên
cứu xác định được cấu trúc của phân đoạn fucoidan từ sargassum swartzii và
sargassum polycystum.
¾ Xác định được khi fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào thì nhóm sulfat ở vị
trí axial (C-4) là chủ yếu và trong mạch có chứa đơn vị cấu trúc hexose-axít
glucuronic .
1.5 Bố cục của luận án:
Luận án dày 142 trang với 19 bảng số liệu, 37 hình vẽ và 138 tài liệu tham
khảo được kết cấu như sau:
Danh mục các từ viết tắt, danh mục bảng và hình vẽ: 8 trang. Đặt vấn đề:
2 trang. Tổng quan (chương I): 40 trang. Đối tượng nghiên cứu và thực nghiệm
(chương II): 23 trang. Kết quả và thảo luận (chương III): 56 trang. Danh mục các
công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến luận án: 1 trang. Tài liệu tham
khảo: 12 trang.
Ngoài ra luận án còn có phần phụ lục gồm 80 trang.





3
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN

Chương I: TỔNG QUAN
Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu tham khảo phần tổng quan trình bày các
vấn đề sau:
- Giới thiệu chung về rong biển, thành phần hoá học, phân bố, sản lượng của rong
biển trên thế giới.
- Các cấu trúc của fucoidan đã được nghiên cứu.
- Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của fucoidan.
- Các phương pháp chiết và sản xuất fucoidan trên thế giới.
- Các phương pháp xác định thành phần hoá học của rong nâu và xác định cấu
trúc của fucoidan đã được công bố.
- Nhận xét chung về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan đã công bố,
các khó khăn khi ứng dụng các phương pháp này vào nghiên cứu cấu trúc
fucoidan từ rong nâu Việt nam, đề xuất giải pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan từ
rong nâu Việt nam.

Chương II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM.
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Rong nâu gồm các loài phổ biến tại tỉnh Khánh Hoà, các loài rong khác ở Khánh
Hoà và các vùng lân cận .
Bảng 2.1 Tên loài rong và ký hiệu mẫu trong các thực nghiệm:
Loài rong
Ký hiệu polysacarit sulfat
trong khảo sát hoạt tính
Ký hiệu fucoidan có hoạt
tính gây độc tế bào ung thư
Sargassum polycystum
FA1 FC03
Sargassum mcclurei
FA2 FC01
Sargassum olygocystum

FA3 FC04
Sargassum xuanmaii
FA4
Sargassum ilicifolium
FA5
Sargassum swartzii
FA6 FC02
Sargassum denticarpum FA7 FC05
Sargassum emarginatum
W2
Turbinaria ornata
G1

Kappaphycus alvarezii
G2

Gracilaria bailiniae
G3
Ulva reticulata
G4
Eucheuma spp
G5
Ulva frenestrata
G6
Gracilaria tenuistipitata
G7
Gracilaria asiatica
G8

4
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
Chiết và tách phân đoạn các polysacarit:
Chiết các polysacarit :
Dựa vào các phương pháp chính để chiết polysacarit sulfat đã được công
bố, chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít loãng, kết
tủa fucoidan từ dịch chiết bằng dung dịch Cetavlon 10% trong nước. Kết tủa được
ly tâm, rửa với nước để tách laminaran và mannitol. Dịch sau khi tủa fucoidan
được cho chạy qua cột IRA-480, fucoidan còn sót lại sẽ được hấp phụ lên cột,
nước qua cột được kết tủa laminaran bằng cách thêm vào 8 lần thể tích EtOH,
dùng hệ thống màng siêu lọc (MWCO) ta xác định được trọng lượng phân tử
trung bình của laminaran tách chiết theo phương pháp này nhỏ hơn 10kDa. Với
loài S. polycystum ta thu được mẫu laminaran ký hiệu là 50down. Laminaran từ
loài S. swartzii ký hiệu là 50up, từ loài S. mcclurei ký hiệu là Revf. Kết tủa
cetavlon-fucoidan được cho vào dung dịch CaCl
2
3M, NaCl 3M và đun nóng
60
0
C khuấy liên tục trong 2 h, để yên qua đêm. Kết tủa Cetavlon-fucoidan bị phá
huỷ giải phóng ra fucoidan tan trong dung dịch, đồng thời canxi alginat được tách
ra dưới dạng kết tủa nếu có lẫn axít alginic.
Ly tâm để thu dịch có chứa fucoidan. Hai lần thể tích EtOH so với thể
tích dịch lọc được đưa vào và khuấy trộn trong 30 phút. Để yên qua đêm, kết tủa
fucoidan được tạo thành.
Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không
còn ion Cl
-
trong nước rửa, hút chân không đến khan nước và sấy kết tủa ở 45

0
C,
áp suất -1 bar trong 18 giờ ta thu được các fucoidan có trọng lượng phân tử khác
nhau, 9 fucoidan thô từ 9 mẫu rong nâu có ký hiệu là A1 đến A7, W2 và G1, 7
polysacarit sulfat từ 5 loài rong đỏ và 2 loài rong lục được ký hiệu là G2 đến G8.
Hiệu suất chiết trung bình của fucoidan khoảng 40g /kg rong khô đối với rong
khô.
Tách phân đoạn fucoidan:
5g fucoidan thô chiết từ rong nâu Sargassum swartzii được hoà tan vào 1lít nước.
Vừa khuấy vừa thêm cetavlon (cetyltrimetylammoniumbromid) 10% vào đến khi
không còn tủa tạo thành (khoảng 60-80ml). Khuấy tiếp tục qua đêm. Kết tủa được
ly tâm lấy ra. Hoà tan tủa trong 600ml NaCl 0.5M khuấy đều qua đêm, tủa được
tách riêng, Hai lần thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào dịch lọc và
khuấy trộn trong 30 phút. Để yên qua đêm, kết tủa fucoidan được tạo thành.
Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không còn ion
Cl
-
trong nước rửa, sau đó tiếp tục rửa kết tủa bằng aceton và sấy kết tủa ở 45
0
C,
áp suất -1 bar trong 30 phút ta thu được phân đoạn F05. Tương tự như vậy với
dung dịch 1, 1.5, 2, 2.5M NaCl thu được phân đoạn F10, F15, F20, F25. Fucoidan
từ Sargassum polycystum được giải phóng trên kết tủa với cetavlon bằng các dung
dịch NaCl 1M và 2M thu được hai phân đoạn PF10 và PF20.


5

FUCOIDAN + CETAVLON
(dung dịch) (dung dịch)
Dung dịch cetavlon dư


FUCOIDAN-CETAVLON

(k
ết tủa
)



Dung dịch NaCl 0.5M khuấy 24 giờ, ly tâm

Dung dịch 05 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 1)
Dung dịch 10 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 2)
Dung dịch NaCl 1M khuấy 24 giờ, ly tâm
Dung dịch 15 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 3)
Dung dịch NaCl 1.5M khuấy 24 giờ, ly tâm
Dun
g
dÞch 20
FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 4)
Dung dịch NaCl 2M khuấy 24 giờ, ly tâm
Dung dịch 25 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 5)
Dung dịch NaCl 2.5M khuấy 24 giờ, ly tâm

Thêm 2 lần thể tích EtOH, ly tâm, rửa kết tủa với EtOH 80%(v/v) cho đến
F05
h
ếtionCl
-
,lytâm,r
ửath
êm 1
l
ầnv
ơiaceton,s
ấy chân không ở 45
0
C.
F10
F15
F20
F25
(Nếu kết tủa còn thì tiếp tục rửa giải bằng dung dịch NaCl có nồng độ cao hơn)
Hình 2.2.1: Sơ đồ tách phân đoạn fucoidan trên kết tủa cetavlon
6
Sàng lọc hoạt tính:
Đánh giá hoạt tính kháng sinh (Antimicrobial assay)
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi đã tiến
hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu polysacarit trên phiến
vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietlinck. Mẫu thô
có MIC ≤ 200μg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50μg/ml là có hoạt tính.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity activity assay)
Chất có hoạt tính thì giá trị IC

50
≤20μg/ml đối với chế phẩm thô và ≤4 μg/ml đối
với chế phẩm tinh.
Xác định thành phần hoá học:
Xác định độ ẩm, hàm lượng protein thô, chất béo thô theo AOAC.
Chiết polysacarit từ rong nâu để xác định thành phần trong rong:
Thành phần các polysacarit của rong nâu được xác định theo các phương pháp
của A. I. Usov và Tatiana N. Zvyagintseva. Bột rong khô được khuấy với dung
dịch HCl 0.2M ở 70
0
C trong 1giờ (tỉ lệ rong:dung dịch axít=1:200 w/v), ly tâm
tách bã rong và chiết lại thêm một lần nữa điều kiện như lần trước. Ly tâm tách
dịch lọc trộn chung với lần chiết trước, thẩm tách với nước cất bằng MWCO
1kDa. Dung dịch này dùng phân tích thành phần fucoidan và laminaran (ddA).
Bã rong còn lại nấu với dung dịch Na
2
CO
3
3M cũng với tỉ lệ nước : rong như trên,
đun ở 70
0
C 1giờ dung dịch thu được dùng xác định hàm lượng alginat (ddB).
Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu:
Đưa vào 1ml dung dịch sau khi thuỷ phân với H
2
SO
4
0.5M ở 95
0
C trong

2.5 giờ có chứa ít nhất 50μg methylpentose được đựng trong ống thử
(16x150mm) đã làm lạnh với nước đá 4,5ml hỗn hợp 1 thể tích nước và 6 thể tích
axít sulfuric đậm đặc. Hỗn hợp sau đó được làm ấm lên 20-22
o
C trong vài phút,
giữ 3phút trong nước đang sôi, cuối cùng được làm lạnh bằng nước máy. Đưa vào
dung dịch để nguội 0.1ml dung dịch cystein hydrochloride (3% w/w trong nước),
lắc đều. Một màu vàng xanh nhạt xuất hiện và bền vững trong 24h.
Hiệu số hấp thụ E
3960
-E
4300
tỉ lệ với nồng độ methylpentose trong dịch đo,
nồng độ methylpentose được tính theo chuẩn là dung dịch fucose.
Hàm lượng fucoidan trong mẫu rong bằng tỉ số hàm lượng fucose trong mẫu rong
chia cho hàm lượng fucose trong fucoidan chuẩn.

% fucose trong dịch chiết (w/w)
% fucoidan trong dịch chiết (w/w)=
% fucose trong fucoidan chuẩn (w/w)



(fucoidan chuẩn được chuẩn bị ở phần chiết và phân đoạn polysacarit)
Xác định hàm lượng laminaran.
Tách laminaran ra khỏi dung dịch chứa polysacarit ion âm:
Dung dịch A chứa laminaran polyuronan và fucoidan được đưa qua cột
polyteflon. Laminaran bị giữ lại trên cột, rửa nước qua cột đến khi hết tạo kết tủa

7

với cetavlon. Dung dịch EtOH 15-20% được dùng để giải hấp laminaran, dung
dich rửa giải đươc thêm 8 lần thể tích EtOH để kết tủa laminaran. Ly tâm loại
EtOH, sau đó acetone được đưa vào rửa tiếp hai lần nữa, kết tủa được sấy khô
trong chân không, đây chính là lượng laminaran có trong dung dịch A
Xác định hàm lượng alginat:
Dung dịch B, polyuronat được tách khỏi dung dịch hỗn hợp polysacarite của rong
nâu bằng kết tủa với axít acetic, tỉ lệ dung dịch: acid =50:30. Tủa keo axít alginic
được ly tâm lấy ra, rửa bằng axít acetic40%, trung hoà bằng NaOH 1M, sau đó
kết tủa alginat bằng 2 lần thể tích ethanol so với dung dịch alginat hoà tan, rửa kết
tủa bằng ethanol 80%, tiếp theo aceton, sấy chân không ta thu được natri alginat .
Xác định hàm lượng polyphenol trong rong biển:
6-10g bột rong được chiết với 250ml EtOH 80%(v/v) trong Soxhlet 32
giờ. Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp so màu với
thuốc thử Folin-Ciocalteau. 1ml dịch chiết, 2.5ml thuốc thử Folin-Ciocalteau
được thêm vào trong ống 50ml. Sau khi khuấy và để yên 3 phút; 7.5ml dung dịch
Na
2
CO
3
20% được đưa thêm vào. Sau khi lắc mạnh và để yên hai giờ ở nhiệt độ
phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch màu xanh trong cuvét có độ dày 0,5 cm tại
bước sóng 765nm, đối chứng với mẫu trắng trên máy quang phổ UV-VIS. Hàm
lượng các hợp chất polyphenol được tính theo tanic axít.
Phân tích thành phần đường của fucoidan:
a. Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02mg
inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120
o
C. Cho bay hơi đến khô trong
dòng khí ở nhiệt độ 40
o

C rồi thêm 0.5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần.
b. Cho vào trong ống nghiệm, có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml
NaBH
4
0.25M vừa pha xong trong NH
4
OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20
o
C. Thêm
vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol, cho bay hơi đến khô,
lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai
lần.
c. Axetyl hoá các đường bằng 0.2ml dung dịch Ac
2
O:pyridin = 1:1(v/v) ở 100
o
C
trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0.5ml toluen, cho bay
hơi đến khô, lặp lại hai lần. Chiết sản phẩm đã axetyl hoá bằng axetat etyl. Xác
định thành phần đường bằng sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu, với các
đường chuẩn Fuc, Rha, Xyl, Man, Glc, Gal được xử lý tương tự như xỷ lý mẫu.
Xác định dạng của axít uronic.
a. Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02
mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120
o
C. Cho bay hơi đến khô
trong dòng khí ở nhiệt độ 40
o
C rồi thêm 0.5 ml MeOH, cho bay hơi, lặp lại hai
lần.

b. Cho vào ống nghiệm có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH
4

0.25M vừa pha xong trong NH
4
OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20
o
C. Thêm vào hỗn
hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp lại
lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần.

8
URONIC AXIT
+C¸C ALDOSE
ALDONIC AXIT
+C¸C ALDITOL
ALDONIC AXIT
+NHùA
ALDONIC AXIT
+HCl
ALDONOLACTON
NHùA ANIONIT
HCl
NHùA
HCl
C¸C ALDITOL
ALDITOL1
NaBH
4
NaBH

4
C¸C ALDITOL ACETAT
ACETYL HO¸
ACETYL HO¸
ALDITOL1 ACETAT
fucoidan
H
+
Hình 2.2.2: Sơ đồ xác định dạng của axít uronic

c. Sản phẩm khô trong ống nghiệm được hoà tan bằng 3ml nước cất, dung dịch
đó được đưa vào cốc có chứa sẵn khoảng 0.3g nhựa trao đổi ion dạng acetat,
khuấy đều trong một giờ, tách lấy phần dịch, lặp lại một lần nữa với khoảng 0.2g
nhựa mới. Nhựa của hai lần khuấy gom lại, rửa với nước cất khoảng 5 lần khối
lượng nhựa.
d. Lacton hoá axít aldonic.Nhựa đã hấp thụ axít aldonic được rửa giải với 2ml
HCl 1N khuấy 30 phút ở nhiệt độ phòng, nhựa đã giải hấp được lọc bỏ bằng giấy
lọc Whatman GFA. Dịch lọc được cho bay hơi đến khô ở 40
0
C trong dòng khi đã
được lọc sạch. Giai đoạn bay hơi dung dịch HCl 1N này đã chuyển hoá axít
aldonic thành aldonolacton. Phần khô trong ống nghiệm được tiếp tục sấy khô
trong chân không khoảng12 giờ có mặt KOH để loại bỏ hoàn toàn HCl.
e. Aldonolacton được hoà tan bằng vài giọt natri borat 10mM, pH=7.5 và 10mg
NaBH
4
trong 0.5ml đệm borat. Phản ứng khử mở vòng lacton diễn ra trong 1giờ ở
nhiệt độ phòng. NaBH
4
được loại bỏ bằng cách cho bay hơi với axít acetic băng
đến khô, sau đó thêm 1ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp
lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần.
f. Acetyl hoá giống như trong phần phân tích thành phần đường.
Xác định thành phần acetat alditol bằng sắc ký khí trên máy GC-17A
Shimadzu FID với cột không phân cực. Chế độ nhiệt: 160
0
C, giữ 2 phút. Tăng đến
280
0

C, 10
0
C/phút, giữ 20 phút để rửa cột. Các pic đường sẽ ra hết sau khoảng 7

9
phút, glucosamin nếu có sẽ ra ở hơn 8 phút.
Trong luận án này, mẫu hỗn hợp fucoidan của Sargassum polycystum và
Sargssum swartzii được trộn chung theo tỉ lệ 1:1 (w/w) để xác định thành phần
đường. Cũng mẫu đó chuẩn bị mẫu để xác định axít uronic, tuy nhiên khi chạy sắc
ký khí ta chạy thành phần đường một lần, sau đó đưa chung mẫu xác định thành
phần đường và mẫu xác định axít uronic vào cùng một lần chạy nữa. Sự tăng lên
của loại đường nào trong mẫu hỗn hợp so với mẫu xác định thành phần đường sẽ
cho ta biết loại axít uronic nào có mặt trong fucoidan.
Sự có mặt của alditol1 làm cho pic acetate alditol1 trong sắc ký đồ các
thành phần đường của fucoidan có diện tích tăng lên, điều đó chúng tỏ dạng của
axít uronic trong fucoidan chính là dạng của aldose1.
Phương pháp phenol- axít sulfuric (Dubois-1956) xác định tổng cacbon hydrat
Đưa 1ml dung dịch có hàm lượng cacbon hydrat khoảng 10-100μg vào
ống so màu, thêm 1ml phenol 4%, 5ml axít sulfuric đậm đặc khoảng 95.5%
(d=1.84) được thêm nhanh vào (khoảng 10-20 giây), để yên 10 phút, sau đó lắc
ống so màu và tiếp tục để yên 10-20 phút trong nước 25-30
0
C, đo mật độ quang ở
487nm. Chuẩn dùng dung dịch glucose hoặc galactose.
Xác định hàm lượng sulfat và axít uronic
Phương pháp chuẩn độ đơn giản của Scott rất hữu dụng trong phân tích
hàm lượng sulfat trong các polysacarit. Phương pháp xác định được tiến hành như
sau: fucoidan (0.5 mg) được hoà tan trong nước khử ion, chuẩn độ bằng dung dịch
cetyl pyridium chlorid (cpc) 1% với microburet và quan sát trên nền đen. Độ đục
của dung dịch tăng dần lên đến khi kết tủa xuất hiện đột ngột. Chuẩn độ song

song hai mẫu: với fucoidan (0.5 mg) hoà tan trong dung dịch nước ta cần A ml
dung dịch cpc, với fucoidan (0.5 mg) hoà tan trong dung dịch H
2
SO
4
0.025M ta
cần B ml cpc. Hàm lượng sulfat được tính theo B và hàm lượng axít uronic được
tính theo hiệu A - B.
Các thiết bị phân tích hoá lý sử dụng trong các thí nghiệm
Phổ
1
H-NMR (500 MHz) và
13
C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker
AVANCE 500 tại Viện Hóa học. Tetrametylsilan (TMS) (cho 1H) hoặc tín hiệu
dung môi (cho
13
C) được dùng làm nội chuẩn. Các mẫu fucoidan được đo với
D
2
O/0.1% CF
3
COOD. Phổ hồng ngoại đo trên máy IMPACT 410 của hãng
NICOLET (Mỹ). Mẫu được hoà tan lượng rất nhỏ trong methanol và phổ ESI-MS
được đo trên thiết bị LC/MSD iontrap 1100 tại Viện Hoá học.
2.3.Xác định cấu trúc fucoidan theo dữ liệu phổ khối ESI-MS nhiều lần:
Xác định cấu trúc đại diện của phân đoạn bằng dữ liệu phổ ESI-MS nhiều lần
dạng ion dương, trên cơ sở các mảnh tạo thành từ phép đo MS
3
phải có công thức

phân tử và công thức cấu tạo chứa trong mảnh từ phép đo MS
2
tương ứng. Tương
tự các mảnh từ phép đo MS
2
phải có công thức phân tử và công thức cấu tạo chứa
trong mảnh từ phép đo MS tương ứng. Giải pháp có thể tóm tắt theo các ví dụ sau
Xét phân tử:


10

H
OH
OH
O
OH
O
CH
3
O
OH
O
OH
OHOH
OH
H
OH
O
OH

OH
O
OH
H
O
OOH
O
S
fuc(SO
3
H)-hex-uro
98
164
180 194
18
Trọng lượng phân tử bằng: 98+164+180+194-3.18









Nếu mảnh có cấu trúc như trên bị bắn phá trong q trình chạy phổ ESI-MS, mất
đi e phân tử nước, kết hợp với n proton và f ion Na
+
tạo thành mảnh có điện tích
bằng (n+f)

+
, số khối của mảnh được tính:
m/z = [98+164+180+194 –(4-1)x18 –e.18+1.n+23.f]/(n+f)
(hệ số 4-1 có nghĩa là 4 phân tử kết hợp với nhau tạo thành 3 liên kết, mỗi liên kết
tạo thành làm mất đi khối lượng 1 phân tử nước, 3 liên kết mất đi 3.18=48).
Thành phần đường của fucoidan đang khảo sát gồm có: fucose, rhamnose,
glucose, galactose, mannose, glucuronic axít, sulfat. Trong đó glucose, galactose,
mannose có cùng khối lượng phân tử được ký hiệu tên gọi chung là hex, fucose,
được ký hiệu là fuc (nếu thành phần đường có Rha thì ở cấu trúc tìm được một số
vị trí của fuc sẽ thay bằng Rha), axít uronic ký hiệu là uro, axít sulfuric ký hiệu là
sul. Một đoạn mạch gồm x phân tử fuc, y phân tử hex, z phân tử uro và t phân tử
sulfuric axít, có số khối là m/z bị bắn phá trong q trình chạy phổ ESI-MS, mất
đi e phân tử nước, kết hợp với n proton và f ion Na
+
tạo thành mảnh có điện tích
bằng (n+f)
+
, số khối của mảnh được tính như sau:
m/z = [x.164+y.180+z.194+t.98 –(x+y+z+t-1)x18 –e.18+1.n+23.f]/(n+f)
để tìm được các giá trị x, y, z, t, e, n, f ta lập bảng sau:
Bảng 2.1: bảng tính thành phần mảnh cho số khối 358.
Khối lượng phân tử của đoạn mạch đầy đủ
điện
tích
Stt
x y z t
x.164+y.180+z.194+t.98 –
(x+y+z+t-1)x18
e n f
(n+f)

số
khối
01 0 0 0 1 98 0 0 1 1 121.1
……
n1 1 0 3 0 692.528 0 1 1 2 358.2
……
n2 2 1 1 1 728.626 2 1 1 2 358.2
……
Thực tế khi tính tốn các khối lượng phân tử đường đơn là:
164.156: phân tử lượng của fuc.
180.156: phân tử lượng của hex.
194.139: phân tử lượng của axít uronic.

11
98.079: phân tử lượng của H
2
SO
4
.
18.015: phân tử lượng của H
2
O.
Trong bảng chỉ ghi phần nguyên cho đơn giản.
Cho các giá trị của x, y, z, t, e, n, f thay đổi từng đơn vị sẽ thu được hết các thành
phần để mảnh có số khối 358. Tuy nhiên vấn đề rất khó khăn là số phép thử quá
lớn và đôi khi đến vài năm cũng không đủ thời gian để tìm ra nghiệm. Giải quyết
vấn đề này luận án sử dụng chương trình pascal chạy trên máy vi tính tương đối
mạnh để tìm hệ nghiệm. Với một mảnh có số khối m/z, nếu xét đến mảnh có điện
tích không quá 3 thì x không thể vượt quá q1=(3.m/z)/164, y không thể vượt quá
q2=(3.m/z)/180, z không thể vượt quá q1=(3.m/z)/194 và t không thể vượt quá 2.x

(chỉ xét gốc fucose nhiều nhất có 2 nhóm sulfat, tuy nhiên có thể thay đổi các giá
trị này, đó là trường hợp mỗi fucose có đủ 2 sulfat ngoài ra sulfat còn có mặt ở
các gốc hexose và axít uronic).
Đoạn chương trình pascal tính toán x, y, z, t cho một mảnh có số khối m/z được
viết như sau :
For x:=0 to q1 do
For y:=0 to q2 do
For z:=0 to q3 do
For t:=0 to 2x do
For e:=0 to 3 do
For n:=1 to 3 do
For f:= -(n-1) to 3 do
{đặt f:=-(n-1) to 3 để khi n bắt đầu từ 0 thì f phải bắt đầu từ 1 nếu không mảnh sẽ
có điện tích ban đầu bằng không và chương trình bị lỗi chia cho 0}
Begin
U:=(x*164+y*180+z*194+t*98-(x+y+z+t-1)*18 –e*18+n+f*23)/(n+f) ;
If (u ≤ trunc(m/z)+1) and (trunc(m/z)≤u) and (n+f≤3) then
Begin
Writeln(x, y, z, t, e, n, f) ;
a :=a+1 ;
End;
End;
Write(“co tat ca: “,a, “ nghiem”);
Readln;
Kết quả cho ra tất cả các tổ hợp nghiệm (x, y, z, t, e, n, f) có thể có, tương ứng với
một số khối trong điều kiện bài toán đặt ra, đồng thời cho biết đã tìm được tổng số
có bao nhiêu tổ hợp nghiệm.
Sau khi tìm được các hệ nghiệm tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo:
Ví dụ:
Tìm "công thức cộng" :

Mảnh có số khối 358 bị bắn phá →341.3 + 283.2 + 209.2 +192.2 + 143.8
Mảnh 358.2 có 3 thành phần:

12
[2fuc, sul, hex, uro –2H
2
O + H + Na]
2+
[fuc,3uro +Na + H]
2+

[2fuc, 2hex, sul + 2H]
2+
(Ký hiệu [2fuc, sul, hex, uro –2H
2
O + H + Na]
2+ gọi là ‘công thức cộng’ mô tả
một đoạn mạch gồm có 2 phân tử fuc 1 phân tử H
2
SO
4
1 phân tử hex, 1 phân tử
uro đã tạo thành liên kết với nhau, trong khi bị bắn phá trong phép đo phổ khối
đoạn mạch mất thêm 2 phân tử nước kết hợp với 1 proton và 1 ion Na
+
)

m/z=209.2 chỉ có 1 thành phần: [fuc, sul –2H
2
O + H]

+
m/z=341.3 chỉ có 1 thành phần: [fuc, uro + H]
+

m/z=143.8 chỉ có 1 thành phần: [fuc,hex,sul+2H + Na]
3+

Cả 3 mảnh này đều phải chứa được trong mảnh có số khối 358, vì vậy mảnh có số
khối 358 phải có đủ các thành phần fuc, hex, uro, SO
3
H và chỉ có thể là:
[2fuc, sul, hex, uro –2H
2
O + H + Na]
2+
Tìm cấu trúc mảnh:
Xét mảnh có số khối 358: [2fuc, sul, hex, uro –2H
2
O + H + Na]
2+

Sự tồn tại duy nhất 1 thành phần mảnh 209.2: [fuc, sul –2H
2
O + H]
+

với cấu trúc đầy đủ duy nhất: fuc(SO
3
H) cho thấy: trong mảnh có số khối 358.2,
hex và uro không liên kết với nhóm sulfat (vì trong mảnh 358 chỉ có 1 nhóm

SO
3
H và nhóm này đã liên kết với fuc).
Từ “cấu trúc đầy đủ" của các mảnh tách ra từ mảnh 358:
m/z=341.3: [fuc,uro+H]
+
: uro-fuc
m/z=143.8: [fuc,hex,sul+2H+Na]
3+
: hex-fuc(SO
3
H)
m/z=283 : [fuc,hex,uro,sul-H
2
O+2H]
2+
hex-fuc(SO
3
H)-uro
m/z=192.2 : [2fuc,sul,uronic –2H
2
O+2Na+H]
3+
: fuc(SO
3
H)-uro-fuc
Mảnh 358 chỉ có thể nhận cấu trúc đầy đủ: hex-fuc(SO
3
H)-uro-fuc

Kết luận: Mảnh fucoidan có số khối 358 phải có cấu trúc đầy đủ là:
hex-fuc(SO
3
H) uro-fuc
Để tiếp tục tìm mảnh lớn hơn cho đến khi có cấu trúc đại diện ta cố định các giá
trị đã tìm được của mảnh con, bài toán sẽ đơn giản hơn.

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT POLYSACARIT TỪ CÁC LOÀI RONG VÀ TÁCH PHÂN
ĐOẠN FUCOIDAN TỪ KẾT TỦA GIỮA FUCOIDAN VỚI CETAVLON.
Các sản phẩm polyscarit sulfat đã chiết được từ một số loài rong biển, một số
phân đoạn từ chúng và các laminaran được liệt kê trong bảng 3.1:



13
Bảng 3.1: Các ký hiệu mẫu khảo sát trong luận án.
Ký hiệu polysacarit sulfat Loài rong tương ứng dùng chiết polysacarit sulfat
FA1
Sargassum polycystum
FA2
Sargassum mcclurei
FA3
Sargassum olygocystum
FA4
Sargassum xuanmaii
FA5
Sargassum ilicifolium
FA6
Sargassum swartzii

FA7 Sargassum denticarpum
W2
Sargassum emarginatum
G1
Turbinaria ornata
G2
Kappaphycus alvarezii
G3
Gracilaria bailiniae
G4
Ulva reticulata
G5
E
ucheuma spp
G6
Ulva frenestrata
G7
Gracilaria tenuistipitata
G8
Gracilaria asiatica
F05
F10
F15
F20
F25
Các phân đoạn tách từ fucoidan của loài rong
Sargassum swartzii
(Dựa theo nồng độ dung dịch NaCl giải hấp
fucoidan trên kết tủa với cetavlon tăng dần)
PF10

PF20
Các phân đoạn tách từ fucoidan của loài rong
Sargassum polycystum
Ký hiệu laminaran Loài rong tương ứng dùng chiết laminaran
50down
S. polycystum
50up
S. swartzii
Rfu
S. mcclurei

3.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACARIT SULFAT TỪ MỘT SỐ
LOÀI RONG.
Qua kết quả từ bảng 3.2.1 đã xác định được 10 loài rong chứa polysacarit
sulfat có hoạt tính gây độc tế bào ung thư bao gồm 6 loài rong Nâu (Sargassum
polycystum, Sargassum mcclurei, Sargassum oligocystum, Sargassum swartzii,
Sargassum denticaprum và Turbinaria ornata), 3 loài rong đỏ (Gra. bailinea, G.
tenuispitata và G. asiatica) và 1 loài rong lục (Ulva fenestrata). Có 8 loài có hoạt
tính kháng 2 dòng ung thư (S. polycystum, S. oligocystum, S. denticarpum,
Turbinaria ornata, G. bailiniae, G. tenuispitata, G. asiatica và Ulva. fenestrata);
1 loài có hoạt tính kháng 1 dòng ung thư (S. mcclurei). Với các phân đoạn

14
fucoidan, chỉ có 2 phân đoạn fucoidan tách từ Sargassum swartzii có hoạt tính. 3
mẫu laminaran (50 up, 50 down, Rfu) đều cho kết quả âm tính. (Do đó luận án
không tiếp tục nghiên cấu trúc laminaran).
Bảng 3.2.1: Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Hep-2 RD
Ký hiệu
Polysacarit

Tên loài rong
Cell surviral
IC
50
Cell
IC
50
Kết
quả
DMSO
100.0±0.0

100.0±0.0


Chứng (+)
2.05±0.02
0.003
1.1±0.0
0.004

Polysacarit sulfat
FA1 S.
p
ol
y
c
y
stum
29.7

±
2.6
5.5
11.8
±
0.6
5.7
+ +
FA2 S. mcclurei
39.3
±
1.6
14.2
68.4
±
2.1
>20 + -
FA3 S. ol
yg
oc
y
stum
35.3
±
1.3
15.8
11.2
±
1.04
11.4

+ +
FA4 S. xuanmaii
97.5
±
3.2
>20
94.0
±
0.1
>20
- -
FA5 S. ilici
f
olium
64.4
±
1.6
>20
94.0
±
0.1
>20
- -
FA6 S. swartzii
31.0
±
1.3
5.8
16.5
±

0.6
18.7
+ +
FA7 S. denticar
p
um
37.5
±
3.9
7.3
27.9
±
1.3
15.9
+ +
W2 S. emar
g
inatum
100.0
±
1.9
>20
97.0
±
1.7
>20
- -
G1 Turbinaria ornata
21.8
±

1.6
3.1
-4.5
±
0.8
1.6
+ +
G2
K
a
pp
a. alvarezii
112.4
±
0.9
>20
120.4
±
2.7
>20
- -
G3 Gra. bailiniae
35.1
±
2.6
15.4
8.8
±
1.5
16.36

+ +
G4 Ulva. reticulata
100.1
±
0.9
>20
93.9
±
1.8
>20 - -
G5 Eucheuma s
pp
93.6
±
1.1
>20
106.1
±
0.0
>20 - -
G6 Ulva
f
renestrata
50.0
±
0.0
20
2.03
±
1.3

15.4
+ +
G7 Gra. tenuisti
p
itata
26.6
±
0.0
1.28
8.1
±
0.6
1.98
+ +
G8 Gra. asiatica
37.9
±
2.4
5.9
8.1
±
02
2.2
+ +
RD LU
Phân đoạn
fucoidan
Tách từ fucoidan
của các loài rong
Cell surviral

IC
50
Cell
IC
50
Kết
quả
DMSO
100±0.0

100±0.0


Chứng (+)
1.5±0.02
0.1
2.35±0.07
0.32
Phân đoạn fucoidan
F05
100.6
±
0.07
>20
89.2
±
0.1
>20 - -
F10
89.5

±
0.5
>20
99.4
±
1.8
>20 - -
F15
89.5
±
1.7
>20
69.3
±
1.08
>20 - -
F20
46.5
±
0.5
16.6
44.1
±
0.7
13.4
+ +
F25
Sargassum
swartzii
53.5

±
0.6
>20
43.2
±
0.6
13.8
- +
PF10
99.7
±
1.1
>20
100.9
±
0.6
>20 - -
PF20
Sargassum
p
ol
y
c
y
stum
98.5
±
0.5
>20
100.1

±
1.2
>20 - -
Laminaran
50down S.
p
ol
y
c
y
stum
71.1
±
1.0
>20
67.3
±
1.08
>20 - -
50u
p
S. swartzii
57.5
±
1.5
>20
54.9
±
0.7
>20 - -

Rf S. mcclurei
97.4
±
1.4
>20
65.1
±
0.0
>20 - -
Trong đó: IC
50
có đơn vị là μg/ml,
Hep-2:tế bào ung thư gan. RD:tế bào ung thư màng tim. LU: tế bào ung thư phổi.

15
Qua kết quả được thể hiện qua bảng 3.2.2 xác định được các polysacarit
sulfat chiết từ rong biển với dung dịch axít loãng đều có hoạt tính kháng vi khuẩn
G(+), một số có khả năng kháng vi khuẩn Gr(-) như polysacarit sulfat chiết từ
Turbinaria ornata, Kappaphycus alvarezii, Gracilaria bailiniae, Eucheuma
spp.,một số kháng nấm mốc như Turbinaria ornata, Kappaphycus alvarezii, Gra.
bailiniae,Gra. Tenuistipitata, Gra. asiatica tuy nhiên không mạnh, không có loài
nào kháng nấm men. Các phân đoạn fucoidan có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn
các polysacarit thô. Các phân đoạn F20, F25 có hoạt tính kháng vi khuẩn Gr(+) và
Gr(-) mạnh hơn các polysacarit sulfat và các phân đoạn khác.
Kết quả thử nghiệm cho thấy polysacarit sulfat của cả 3 ngành rong đều
có hoạt tính gây độc tế bào và kháng vi sinh vật kiểm định . Điều này phù hợp với
các nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính sinh học của rong đỏ và rong lục.
Bảng 3.2.2: kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng sinh các polysacarit sulfat.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:μg/ml)
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men

Số
tt
Ký hiệu
mẫu
E.coli P.aeruginosa B.subtilis S.aureus Asp.niger F.oxysporum C.albicans S.cerevisiae
1
G1 200
(-)
200
(-) (-)
200
(-) (-)
2
G2 200
(-)
200
(-) (-)
200
(-) (-)
3
G3 200
(-)
200
(-) (-)
200
(-) (-)
4
G4
(-) (-)
200

(-) (-) (-) (-) (-)
5
G5
(-)
200 200
(-) (-) (-) (-) (-)
6
G6
(-) (-)
200
(-) (-) (-) (-) (-)
7
G7
(-) (-)
200
(-) (-)
200
(-) (-)
8
G8
(-) (-)
200
(-)
200 200
(-) (-)
Các phân đoạn fucoidan
9
F05
(-) (-)
200 200

(-) (-) (-) (-)
10
F10
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
11
F15
(-) (-) (-)
100
(-) (-) (-) (-)
12
F20 50
(-)
50 50
(-) (-) (-) (-)
13
F25 50
(-)
50 50
(-) (-) (-) (-)
14
PF10
(-) (-)
100
(-) (-) (-) (-) (-)
15
PF20
(-) (-)
(-)
(-) (-) (-) (-) (-)
Laminaran

16
50down
(-) (-)
200
(-) (-) (-) (-) (-)
17
50up
(-) (-)
100
(-) (-) (-) (-) (-)
18
Rf
(-) (-)
100
(-) (-) (-) (-) (-)
3.3. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CHÍNH CỦA 6 LOÀI RONG NÂU CHỨA
FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ:
Kết quả phân tích hàm lượng các chất chính của 6 loài rong nâu được đưa
ra trong bảng 3.2.3. Bảng 3.2.3 cho thấy đối với 6 loài sargassum đang khảo sát,
hàm lượng alginic axit dao động từ 11 đến 20%, fucoidan từ 2.9 đến 4%,
laminaran từ 3.6 đến 5% so với trọng lượng khô. Với hàm lượng tổng các
polysacarit từ 18 đến 28% nếu tách chiết để làm dược liệu thì đây là nguồn
nguyên liệu quý cho công nghiệp dược phẩm của nước ta.

16
Bảng 3.3. Thành phần hóa học chính của 6 loài rong nâu có hoạt tính gây độc tế bào.
Thành phần
hóa học
chính
(%)

S.polycystum. Mont
(Vịnh Nha Trang)
S.mcclurei Setch
(Vịnh Nha Trang)
S.oligocystum
C.Ag
(Vịnh Nha Trang)
S.swartzi
(turn)C.Ag
(Vịnh Nha Trang)
S.denticaprum Ajis
(Vịnh Nha Trang)
Turbinaria ornata
(Vịnh Nha Trang)
Độ ẩm 25,86 32,41 25,38 26,97 26,52 34,34
Protein 7,52 7,66 7,2 7,54 9,72 7,51
Chất béo 3,90 3,14 4,12 3,31 3,54 3,82
Alginic axít 11,11 20,16 13,58 12,17 9,80 13,90
Laminaran 4,32 4,82 4,30 4,48 5,22 3,64
Fucoidan 2,94 3,56 3,92 2,88 3,74 4,22
Polyphenol 0,51 0,54 0,61 0,8 0,49 0,12

3.4. ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA 5 FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ
BÀO VÀ CỦA 7 PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN TÁCH TỪ 2 TRONG 5 FUCOIDAN.
Khảo sát trọng lượng phân tử các fucoidan và một số phân đoạn tách ra từ
chúng, kết quả (bảng 3.4.1) cho thấy cùng phương pháp chiết bằng dung dịch axít
loãng, các giá trị trọng lượng phân tử khác nhau ở fucoidan của các loài rong khác
nhau gần như chỉ là sai số của phương pháp phân tích. Đồng thời, qua việc phân
đoạn phân tử lượng fucoidan, ta nhận thấy phần chủ yếu tập trung ở vùng
>100kDa, một ít ở vùng 50-100kDa.

Bảng 3.4.1 Trọng lượng phân tử của các fucoidan và các phân đoạn
fucoidan <10kDa 10-30kDa 30-50kDa 50-100kDa >100kDa
FC01 0.50% 0.18% 1.45% 16% 82%
FC02
0.36% 0.12% 1.56% 16% 82.4%
FC03
0.45% 0.16% 1.40% 15.40% 82%
FC04
0.50% 0.16% 1.33% 16.60% 81.4%
FC05
0.17% 0.18% 1.50% 16.10% 82%
Các phân đoạn fucoidan tách trên kết tủa fucoidan-cetavlon
F05 0.79% 0.79% 3.94% 47.24% 47.24%
F10
0.29% 0.29% 2.29% 22.86% 74.29%

17
F15
0.12% 0.18% 1.83% 18.35% 79.51%
F20
- - 0.9% 9.01% 90.09%
F25
- - 0.16% 3.22% 96.62%
PF10
0.5% 0.5% 2.98% 33.11% 62.91%
PF20
- - 0.7% 6.01% 92.29%
FC01 : fucoidan chiết từ S. mcclurei, (FA2)
FC02 : S. swartzii (FA6)
FC03 : S. polycystum (FA1)

FC04 : S. oligocystum (FA3)
FC05 : S. denticarpum (FA7)
Kết quả phân tích thành phần đường trong bảng 3.4.2 cho thấy tất cả các
polysacarit sulfat từ các loài rong mơ trên đều có tỉ lệ đáng kể L-fucose, chiếm
khoảng 28-50 % tổng cacbohydrat. Trong đó fucoidan từ loài S. mcclurei có hàm
lượng đường fucose lớn nhất với 50,51 %. Hàm lượng D-galactose chiếm tỉ lệ gần
bằng của L-fucose trong bốn loài S. polycystum, S. swartzii, S. oligocystum và S.
denticarpum, trừ mẫu fucoidan từ rong S. mcclurei. Các đường D-xylose và D-
glucose chiếm tỉ lệ nhỏ hơn (2-9 %) so với đường D-rhamnose và D-manose với
khoảng 9-17%. Hàm lượng đường D-xylose lớn nhất ở loài S. denticarpum (9.24
%), nhỏ nhất ở loài S. mcclurei (2.53%). Đường D-rhamnose lớn nhất ở S.
mcclurei (25.25%), nhỏ nhất ở loài S. polycystum (9.71%). Đường D-manose
nhiều nhất ở loài S. oligocystum (17.76 %), và ít nhất ở loài S. polycystum
(9.71%). Hàm lượng đường D-glucose dao động không nhiều, lớn nhất ở S.
denticarpum (9.83%), nhỏ nhất ở S. mcclurei (4.04%). Hàm lượng sunphát dao
động trong khoảng 20-33% (w/w) so với tổng lượng mẫu phân tích, lớn nhất ở S.
mcclurei (33%), nhỏ nhất ở S. swartzii (20.4%). Hàm lượng uronic axít dao động
trong khoảng 14-23%. Như vậy, fucoidan từ năm loài rong mơ trên đều có tỉ lệ
sulfat và uronic axít khá cao. Thành phần đường có bốn loại đường chính với tỉ lệ
khác nhau, trong đó đường fucose chiếm ưu thế. Cũng chính vì đặc điểm này mà
việc xác định đặc điểm cấu trúc fucoidan từ rong mơ Sargassum là khá phức tạp
và khó khăn.
Bảng 3.4.2: Thành phần đường của fucoidan và các phân đoạn fucoidan:
Thành phần mol đường
Fucoidan từ các
loài rong
Fuc Xyl Rha Man Glu Gal
SO
3
Na

(%)
w/w
Axít
Uronic
(%)w/w
1 0.24 0.44 0.39 0.34 1.05
S. denticarpum
28.9% 6.94% 12.72%
11.27%
9.83% 30.35%
25.69 21.20
1 0.05 0.5 0.24 0.08 0.11
S. mcclurei
50.51% 2.53% 25.25% 12.12% 4.04% 5.56%
33.15 17.87
S. oligocystum
1 0.15 0.36 0.54 0.18 0.81 22.46 21.54

18
32.89% 4.93% 11.84% 17.76% 5.92% 26.64%
1 0.19 0.27 0.27 0.13 0.92
S. polycystum
35.97% 6.83% 9.71% 9.71% 4.68% 33.09%
25.6 23.74
1 0.19 0.48 0.54 0.22 1
S. swartzii
29.15% 5.54% 13.99% 15.74% 6.41% 29.15%
20.40 14.28
Các phân đoạn fucoidan tách trên kết tủa cetavlon-fucoidan
Thành phần đường trung tính (mol)

Phân đoạn
fucoidan
Fuc Xyl Rha Man Glu Gal
Tổng
Carbohyd.
(%)
SO
3
Na
(%)w/w
Axít
Uronic
(%)w/w
1 0 0.72 1.16 0.55 1.23
F05
21.46% 0% 15.45% 24.89% 11.8% 26.39%
87.3 8.69 19.94
1 0.07 0.35 0 0.04 0.17
F10
61.35% 4.29% 21.47% 0% 2.45% 10.43%
71.2 22.68 12.99
1 0.04 0.31 0.38 0.06 0.26
F15
48.78% 1.95% 15.12% 18.54% 2.93% 12.68%
69.5 25.24 13.88
1 0.04 0.24 0.38 0.07 0.49
F20
45.05% 1.8% 10.81% 17.12% 3.15% 22.07%
70.1 25.42 14.74
1 0.15 0.22 0.4 0.18 2.07

F25
24.88% 3.73% 5.47% 9.95% 4.48% 51.49%
68.3 27.62 9.66
1 0.05 0.55 0.6 0.35 0.7
PF10
30.77% 1.54% 16.92% 18.46% 10.77% 21.54%
75.5 20.64 10.1
1 0.1 0.3 0.3 0 0.3
PF20
50% 5% 15% 15% 15%
72.6 21.78 10.5

Đặc tính liên kết giữa các gốc đường fucose trong fucoidan được thể hiện
qua tín hiệu độ dịch chuyển hoá học của nhóm metyl trong phân tử fucose trên
phổ HNMR. Qua bảng 3.4.3, kết quả cho thấy toàn bộ các fucoidan từ 5 loài rong
nâu đang khảo sát đều có liên kết đường trong mạch chủ yếu là 1→2 hoặc 1→3.
Fucoidan chứa toàn bộ các phân đoạn (FC02 và FC03) chỉ có Liên kết glucosit
1→2 và 1→3 không có 1→4
Bảng 3.4.3: Tín hiệu nhóm metyl trong phổ HNMR của các fucoidan:
Số TT
Fucoidan Tên loài rong
δ
TFA
ppm
δ
D2O
ppm
Liên kết của fuc
01 FC01
Sargassum mcclurei

1.52 1.12 Chỉ có liên kết

19
02 FC02
Sargassum swartzii
1.65 1.25
03 FC03
Sargassum polycystum
1.59 1.19
04 FC04
Sargassum oligocystum
1.68 1.28
05 FC05
Sargassum denticarpum
1.63 1.23
1→2 hoặc 1→3
không có liên
kết 1→4
Các phân đoạn fucoidan tách trên kết tủa cetavlon-fucoidan
01 F05
Sargassum swartzii
1.66 1.26
02 F10
Sargassum swartzii
1.66 1.26
03 F15
Sargassum swartzii
1.68 1.28
04 F20
Sargassum swartzii

1.68 1.28
05 F25
Sargassum swartzii
1.63 1.23
06 PF10
Sargassum polycystum
1.66 1.26
07 PF20
Sargassum polycystum
1.63 1.23
Chỉ có liên kết
1→2 và 1→3
không có liên
kết 1→4
Từ tín hiệu phổ hồng ngoại trên bảng 3.4.4, cả 5 mẫu fucoidan đều có hấp
thụ ở giữa 845 và 820 cm
-1
chứng tỏ trong các polysacharit đó đều hiện diện cả
hai vị trí thế của nhóm sulfat là equatorial và axial.
Bảng 3.4.4. Vị trí nhóm sunphát trong các fucoidan dựa trên dữ kiện phổ IR
Số
TT
fucoidan Tên loài rong
Hấp thụ
(cm
-1
)
Vị trí nhóm sulfat

01 FC01

Sargassum mcclurei
830.5 C2,C3 tương đương C4
02 FC02
Sargassum swartzii
Không rõ ràng
03 FC03
Sargassum polycystum
843.3 C4 nhiều hơn C2,C3
04 FC04
Sargassum oligocystum
Không rõ ràng
05 FC05
Sargassum denticarpum
822.5 C2,C3 nhiều hơn C4
Các phân đoạn fucoidan tách trên kết tủa cetavlon-fucoidan
06 F05 821.32 C2,C3 nhiều hơn C4
07 F10 830.21 C2,C3 tương đương C4
08 F15 827.22 C2,C3 nhiều hơn C4
09 F20 845.01 C4 nhiều hơn C2,C3
10 F25
Sargassum swartzii
842.98 C4 nhiều hơn C2,C3
11 PF10 820.6 C2,C3 nhiều hơn C4
12 PF20
Sargassum polycystum
824.07 C2,C3 nhiều hơn C4
Đặc điểm của các phân đoạn fucoidan khi khảo sát phổ IR cho ta thấy
được với các phân đoạn rửa giải với dung dịch NaCl từ 0.5 đến 1.5M các gốc
sulfat trong phân tử fucoidan nằm ở vị trí equatorial (vị trí của C-2 hoặc C-3). Đối
với fucoidan phân đoạn rửa giải với dung dịch NaCl 2M nhóm sulfat nằm ở cả vị

trí equatorial và axial. Tuỳ theo loài rong mà vị trí nhóm sulfat ở vị trí axial chiếm
ưu thế hoặc ở equatorial chiếm ưu thế. Dựa trên bảng kết quả xác định hoạt tính
độc tố tế bào và bảng xác định vị trí nhóm sulfat theo phổ IR của các phân đoạn
fucoidan tách trên nhựa lỏng cetavlon ta nhận thấy:


20
a) với phân đoạn fucoidan có nhóm sulfat ở vị trí axial chiếm ưu thế thì hoạt
tính gây độc tế bào ung thư được thể hiện còn đối với phân đoạn fucoidan có
nhóm sulfat ở vị trí equatorial chiếm ưu thế thì hoạt tính này không có.
b)
Các phân đoạn vùng rửa giải với dung dịch NaCl lớn hơn 2M hầu như chỉ
có fucoidan phân tử lượng trung bình > 100.000Da
3.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN PHÂN ĐOẠN PF20 CHIẾT
TÁCH TỪ RONG NÂU Sargassum polycystum:
Độ dịch chuyển hoá học nhóm metyl trong phổ
1
HNMR của PF20 bằng 1.24ppm
chứng tỏ fucose trong mạch chủ yếu liên kết 1→2 hoặc 1→3 không có 1→4.
Tín hiệu tương tác giữa các proton trong phổ H-HCOSY của PF20 cho thấy
H4(~5ppm) luôn ở về phía trường thấp hơn H3(4.1ppm) chứng tỏ nhóm sulfat chủ
yếu ở C2 liên kết đường ở vị trí C3. Ngoài ra tín hiệu tương tác rất nhỏ của
H4(4.6ppm) trong phổ H-HCOSY cùng với vai hấp thụ nhỏ trong phổ IR của
PF20 tại 840cm
-1
(bên cạnh hấp thụ mạnh 824cm
-1
cho thấy sulfat trong PF20 chủ
yếu ở vị trí equatorial C2 hoặc C3) cho thấy có 1 phần nhỏ sulfat ở C4.
Cấu trúc đại diện của fucoidan phân đoạn PF20 từ Sargassum polycystum được

xác định là:
n>1
uro
⎜
⎯hex⎯fuc(SO
3
H)⎯uro⎯fuc⎯
⎜
fuc⎯fuc(SO
3
H)
⎜
fuc(SO
3
H)
2








Hình 3.5.1: C
ấ
u trúc của PF20

H
O
H
O
O
H
O
O
OH
Me
OH
O
O
OH
OH
CH
2
OH
O
OO

O
O
Me
OH
O
O
O
OSO
3
H
Me
OH
O
OH
COOH
O
OH
CH
3
OH
COOH
O
Me
OSO
3
H
O
OSO
3
H

Me
OH
OSO
3
H
Y0 Z0
Y1 Z1
Y2 Z2
Y3 Z3
Y4 Z4
Y5 Z5
Y6 Z6
Y7 Z7
Y8 Z8
Y9 Z9
B0 C0 B1 C1
B2 C2
B3 C3 B4 C4
B5 C5
B6 C6
B7 C7
B8 C8
B9 C9
Hình 3.5.2: Sơ đ

ồ

p
hân mảnh của fucoidan từ PF20

21
Thành phần mảnh tương ứng với tín hiệu phổ khối của fucoidan từ PF20:
Y3, Y8, Y9, C6: 537.5: [3fuc,sul+H]
+

Y6, C6, Z8: 522.8: [fuc:5 hex:1 uro:2 sul:4 -HOH + 3H]
3+

Z6, Z7, Z8, Z9, C5: 453.4: [fuc:3 hex:1 uro:1 sul:2 -4 HOH + Na+H]
2+
Y5, Z8, C4: 374.3: [fuc:2 uro:2 sul:1 -HOH +Na+H]
2+

Y6, Y8, Z7, B4: 358.4: [fuc:2 hex:1 uro:1 sul:1 -2H
2
O+Na+H]
2+
Z3, Z8, Y5, C9: 337: [fuc:2 sul:1 -3H
2
O+H]
+
Y6, Y7, C3: 303: [fuc:1 hex:1 uro:1 sul:1 +Na+H]
2+
Z5, C3: 272.2: [fuc:1 uro:2 -1 HOH + 2Na]
2+

Y6, Y9, Z7, C5, Y8: 246.2: [fuc:3 hex:1 uro:1 sul:2 -HOH + 2Na+2H]
4+

Y5, Z7, C3: 213: [fuc:1 uro:1 sul:1 -H
2
O+2H]
2+
:
Y2, C5, Z9: 187: [fuc:2 sul:1-H
2
O+2H]
2+
:
Y8, Z4, B4: 161.1:[fuc:1 uro:2 -2HOH +3H]
3+
:
3.6 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN PHÂN ĐOẠN F20 CHIẾT
TÁCH TỪ RONG NÂU: Sargassum swartzii.
Phổ IR của phân đoạn F20 có hấp thụ mạnh tại 845cm
-1
cho thấy nhóm sulfat
trong phân đoạn F20 chủ yếu ở vị trí C4, tín hiệu lệch về 820 cm
-1
cho thấy có
một phần sulfat ở vị trí C2 hoặc C3
Tín hiệu H4 (4.2ppm) luôn ở trường thấp hơn H2,H3 chứng tỏ sulfat ở vị trí C4,
tín hiệu H2 (3.9ppm) luôn ở trường thấp hơn H3 (3.6ppm) chứng tỏ tồn tại đồng
thời liên kết đường tại C2 và C3 hoặc C2 có sulfat và C3 có liên kết đường hoặc
fuc cuối mạch.
Cấu trúc đại diện của fucoidan phân đoạn PF20 từ Sargassum swartzii được xác
định là:
fuc
|

hex-fuc(SO
3
H)
2
-fuc(SO
3
H)-hex-hex-hex-fuc(SO
3
H)
2
-fuc(SO
3
H)-hex-hex
|
uro-uro
n
≥
1

O
O
O
OSO
3
H
Me
OSO
3
H
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
O
OH
CH
2
OH
O
Me
OSO
3
H
O
O

OH
Me
OH
OH
O
O
O
OH
OH
CH
2
OH
O
O
O
OSO
3
H
Me
OSO
3
H
O
O
OH
OH
CH
2
OH
O

OH
OH
CH
2
OH
O
OH
Me
OSO
3
H
O
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
O
O
OH
OH
OH
COOH
O
OH
OH
COOH

Y1 Z1
Y2 Z2
Y3 Z3Y4 Z4Y5 Z5Y6 Z6
Y7’ Z7’
Y7 Z7
Y8’ Z8’

Y8’’ Z8’’
Y8 Z8 Y9 Z9
B1 C1
B2 C2
B3 C3
B1’’ C1’’

B1’ C1’
B2’ C2’
B4 C4
B5 C5
B6 C6
B7 C7
B8 C8
B9 C9
Hình 3.6.1 C
ấ
u trúc của F20
Hình 3.6.2: Sơ đ
ồ

p
hân mảnh của fucoidan từ F20

22

Thành phần mảnh tương ứng với tín hiệu phổ khối của fucoidan từ F20:

Y8’’, C7 : 940.8: [fuc:3 hex:4 uro:2 sul:5 +Na+H]
2+

Y8’’, Y8, Y7’ : 794.7: [fuc:3 hex:5 sul:4 + 2H]
2+

Z7’, B6 : 765.6: [fuc:3 hex:4 uro:1 sul:3 -2HOH +2 Na]
2+
Y8’’Y8, Y7’, B8 : 726.6: [fuc:3 hex:4 uro:0 sul:4 -HOH +2Na]
2+
Y8’’Y8, B6 : 690.6: [fuc:2 hex:4 uro:1 sul:3 -HOH +Na +H]
2+
Z3 : 557.5: [fuc:2 hex:1 sul:1 -HOH +Na]
1+
Z8, B5 : 516.4: [fuc:2 hex:2 uro:2 sul:1 -2HOH +2H]
2+
Z8’’, Z7’, B8 : 479.9: [fuc:4 hex:4 uro:1 sul:6 -2HOH +2Na +2H]
4+
Y8, C3 : 413.4: [fuc:2 sul:1 +Na]
1+
Z8’’, Z7’, B7 : 374.8: [fuc:3 hex:4 sul:5 -3HOH +2Na +2H]
4+
Z7, B5 : 330.3: [hex:2 uro:2 -2HOH +2H]
2+
Y8, Y7’, C4 : 277.3: [fuc:2 hex:1 sul:1 +2H]

2+
Z8’’, Z8’, Z8, B5 : 232.5: [fuc:1 hex:2 uro:1 sul:1 -4HOH +Na +2H]
3+
Y9, C2 : 185.1: [fuc:1 sul:2 +2Na]
2+


KẾT LUẬN
Các kết luận rút ra từ luận án:
1- Đã sàng lọc các polysacarit chiết từ 9 loài rong nâu, 5 loài rong đỏ, 2 loài rong
lục thu ở tỉnh Khánh Hoà và 7 phân đoạn fucoidan, 3 laminaran kết quả cho thấy
có 5 loài rong nâu (S. polycystum, S. mcclurei, S. oligocystum, S. swartzii, S.
denticaprum và Turbinaria ornata), 3 loài rong đỏ (Gra. bailinea, G. tenuispitata
và G. asiatica) và 1 loài rong lục (Ulva fenestrata) có hoạt tính gây độc 2 dòng tế
bào ung thư: ung thư màng tim và ung thư gan 1 loài rong nâu có hoạt tính gây
độc 1 dòng tế bào ung thư gan (S. mcclurei). 1 Phân đoạn fucoidan từ S. swartzii
F20 có hoạt tính gây độc 3 dòng tế bào ung thư : ung thư gan, ung thư màng tim,
ung thư phổi và 1 phân đoạn F25 có hoạt tính gây độc 1 dòng tế bào ung thư
màng tim cũng được chiết tách từ S. swartzii
2- Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy: polysacarit chiết từ
Turbinaria ornata, Kappaphycus alvarezii, Gracilaria bailiniae, ức chế B.subtilis,
E.coli, F.oxysporum, polysacarit chiết từ Gra. asiatica ức chế B.subtilis, Asp.
Niger, F.oxysporum, polysacarit chiết từ Eucheuma spp ức chế P. aeruginosa,
B.subtilis, polysacarit chiết từ Gra. Tenuistipitata ức chế B.subtilis, F.oxysporum,
polysacarit chiết từ Ulva reticulata và Ulva frenestrata chỉ ức chế B.subtilis
không có loài nào kháng nấm men. 3 laminaran chỉ ức chế B.subtilis. Các phân
đoạn fucoidan có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn các polysacarit thô. Các phân
đoạn F20, F25 ức chế B.subtilis, S.aureus và E.coli tương ứng mạnh hơn các
fucoidan và các phân đoạn khác, F05 ức chế B.subtilis và S.aureus, F15 chỉ ức
chế S.aureus và F10 không có hoạt tính nào.

3- Đã xác định được thành phần hoá học chính của 6 loài rong nâu chứa fucoidan
có hoạt tính gây độc tế bào ung thư , thành phần gồm: protein (7.2 – 9.72%), chất

23
béo (3.14 – 4.12%), axít alginic (9.80 – 20.16%), laminaran (3.64 – 5.22%),
fucoidan (2.88 – 3.92%), polyphenol (0.12 – 0.8%) so với trọng lượng khô.
4- Đã xác định đặc tính cấu trúc của 5 fucoidan chiết từ 5 loài rong nâu:
S. mcclurei, S. swartzii, S. polycystum, S. oligocystum, S. denticarpum và 5 phân
đoạn fucoidan tách từ fucoidan tổng số của S. swartzii, 2 phân đoạn tách từ
fucoidan tổng số của S. polycystum. Toàn bộ các fucoidan từ 5 loài rong nâu đã
khảo sát đều có thành phần đường bao gồm Fuc, Rha, Gal, Glc, Man và GlcA,
liên kết đường trong mạch chủ yếu là 1→2 hoặc 1→3, nhóm sulfat có mặt ở cả 2
vị trí equtorial và axial.
5- Đã xác định cấu trúc của fucoidan phân đoạn PF20 chiết từ rong nâu
sargassum polycystum và phân đoạn F20 chiết từ sargassum swartzii.
Sơ bộ nhận xét mối liên quan giữa hoạt tính gây độc tế bào ung thư và cấu trúc
của fucoidan là:
Phân đoạn fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thì trong phân tử có đơn
vị cấu trúc hex-uro và nhóm sulfat có mặt ở vị trí C-4 chiếm ưu thế.
KIẾN NGHỊ
Cần có thêm các chương trình, dự án nghiên cứu sâu rộng về fucoidan từ nguồn
rong biển của Việt nam và hướng sử dụng fucoidan trong các ngành y sinh học và
công nghiệp.