PHÂN lập và SÀNG lọc VI SINH vật BIỂN SINH ENZYM có KHẢ NĂNG cắt MẠCH FUCOIDAN

z

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CHẾ BIẾN








ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC
VI SINH VẬT BIỂN SINH ENZYM
CÓ KHẢ NĂNG CẮT MẠCH FUCOIDAN






Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA
TS. TRẦN THỊ THANH VÂN
Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN HÀ VY
Lớp: 48 CNSH

NHA TRANG, NĂM 2010





Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
i
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa-
giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và TS. Trần Thị Thanh Vân-
trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

Công nghệ Nha Trang đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện đồ án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp
đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và
sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và
hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã
quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này.


Trần Nguyễn Hà Vy
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
ii
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 5
1.1. Tổng quan về rong biển 5
1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển 5
1.1.2. Phân loại rong biển 6
1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong Nâu trên thế giới 6
1.1.4. Rong Mơ Việt Nam 7
1.2. Tổng quan về enzyme 8
1.2.1. Khái niệm chung về enzyme 8
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 9
1.2.3. Tính chất của enzyme 11
1.3. Giới thiệu về Fucoidan 14
1.3.1. Fucoidan 14
1.3.2. Hoạt tính sinh học của Fucoidan 16
1.3.3. Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó 19
1.3.3.1. Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên 19
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
iii
1.3.3.2. Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan 20
1.3.3.3. Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới 20
1.4. Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan 21
1.4.1. Enzyme fucoidanase 21
1.4.2. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật 21
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23
2.1. Chủng giống 23

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 23
2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 25
2.2.3. Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan 26
2.2.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch
fucoidan 28
2.2.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 28
2.2.4.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme 28
2.2.4.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 28
2.2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme 28
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn
mạch fucoidan 29
3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch
fucoidan 32
3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme 35

3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 35
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w

.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h

a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!

P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a

c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d

o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
iv
3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme 36
3.3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 36
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 38
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
4.1. Kết luận 40
4.2. Kiến nghị 41
PHỤ LỤC 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44


Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số ứng dụng của fucoidan chiết từ rong nâu. 19
Bảng 1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan. 20
Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 22

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan 23

Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập được. 30
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trường lỏng chứa
fucoidan từ rong S. mcclurei 33
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau. 35
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme. 36
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. 38


Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Một số loài rong có chứa fucoidan. 15
Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus 16
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển. 24
Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập. 25
Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. 26
Hình 2.4: Đường chuẩn fucose. 27
Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 32
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. 38

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C

h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
vii
BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate
DNA Deoxyribonucleic acid
Ex Extract
Fuc Fucose
Gal Galactose
HGF Human Hepatocyte Growth Factor
HIV Human immunodeficiency virus
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
CE Control enzym
CS Control substrate
Man Mannose
NITRA Nha Trang Institute of Technology Rearcher and Application
Rha Rhamnose
RNA Ribonucleic acid
Xyl Xylose


Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
1
MỞ ĐẦU
Với hơn 3200 km chiều dài bờ biển, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và
cận nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái động-thực vật thủy sinh là vô cùng đa dạng
và phong phú. Trong đó hệ thực vật tảo biển chiếm một lượng sinh khối lớn với
khoảng 1000 loài được dự đoán, 639 loài đã xác định bao gồm 151 loài rong lục,
269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam [13].
Ngay từ xa xưa nhiều loài rong tảo đã được con người sử dụng làm thức ăn
cho người và gia súc, một số nước tại vùng biển Châu Á, Châu Mỹ một số loài rong
còn được sử dụng để làm thuốc. Câu chuyện về tỉ lệ người chết thấp và tỉ lệ người
cao tuổi sống khỏe mạnh (trên 100 tuổi) khác thường ở đảo Tonga (Nam Thái Bình
Dương) vẫn hấp dẫn các nhà khoa học khi những người dân đảo này cho biết họ
sống được như vậy là nhờ rong nâu, loài thực vật mà họ đã thu hoạch và sử dụng
hơn 3000 năm nay. Người Tonga tin rằng rong nâu chính là nguồn dược liệu giúp
họ tăng tuổi thọ, sức khỏe và sinh lực. Vì một trong những lí do này mà các nhà
khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều
chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u, tăng cường khả
năng miễn dịch Đăc biệt là fucoidan được tìm thấy trong rong nâu là chất có rất
nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Ngoài fucoidan trong rong nâu còn có nhiều hợp

chất có giá trị kinh tế như: laminaran, mannitol, gibberelin, cytokinin, auxin, iod,
khoáng, axit béo … và nhiều loại vitamin.
Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lượng ước tính trên 10000 tấn
khô/năm, nhưng đa số người dân thường thu hoạch rong này để làm phân bón và
thức ăn chăn nuôi. Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công
Nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một
hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn [1],[2].
Fucoidan, một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc
biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống
đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w

.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
2
ung thư và kháng virus kể cả virus HIV … và hơn nữa nguồn cung cấp chủ yếu là
rong nâu tự nhiên có trữ lượng lớn tại các vùng biển nước ta.
Tuy nhiên mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của chúng vẫn
chưa được giải thích rõ ràng do cấu trúc phức tạp và không theo quy luật của
fucoidan từ các nguồn gốc loài rong khác nhau mà nó được chiết ra. Trong mạch

phân tử của chúng chứa chủ yếu các gốc fucose được sulphat hóa ở các vị trí khác
nhau và liên kết với nhau thông qua một số liên kết như (1-3) (1-4), (1-2) glycosit ít
theo quy luật. Ngoài ra trong phân tử còn có mặt một số đường đơn khác như:
galactose, manose, xylose, glucose và các mạch nhánh có chứa gốc fucosyl,
galatosyl …Chính vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố cấu trúc lên
hoạt tính sinh học của fucoidan là một thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa
học.
Điều này chỉ được giải quyết hiệu quả nhất khi sử dụng các loại enzyme có
khả năng cắt mạch fucoidan như là một công cụ để nghiên cứu cấu trúc cũng như
tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan.
Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra 2 loại ezyme O-glycosyl
hydrolase có hoạt tính với fucoidan đó là fucoidanase và α-L-fucosidase. Hoạt tính
của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn
cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase
được giải thích bởi hai kiểu bẻ gãy liên kết glycosit. Fucoidanase có thể bẻ gãy các
liên kết glusosit bên trong phân tử polysaccharide làm giảm nhanh chóng trọng
lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số
phân tử oligosaccharide làm cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase)
[23],[46].
Do fucoidan được chiết từ các loài rong khác nhau thì khác nhau nên các
nghiên cứu về cơ chế tác động của fucoidanase còn rất hạn chế và khó để so sánh
các kết quả thực nghiệm với nhau.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h

a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!

P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a

c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d

o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w

e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n

g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
3
Các nhà khoa học Pháp và Nhật đã công bố tìm thấy một số loại fucoidanase
từ một số loại động vật thân mềm biển như: bào ngư Haliotis sp, điệp
Pectenmaximus, động vật thân mềm Pectinidae Patinopecten Yessoensis. Các
enzyme này có khả năng thủy phân fucoidan một cách rất hiệu quả để tạo thành các
oligosaccharide [7],[8]. Tuy nhiên việc tiềm kiếm enzyme từ động vật thân mềm
biển chỉ có ý nghĩa về mặt nghiên cứu nhưng khó có thể đưa vào ứng dụng ở quy
mô sản xuất công nghiệp. Vì vậy, người ta đặc biệt quan tâm đến enzyme cắt mạch
fucoidan có nguồn gốc vi sinh vật là vì các lí do sau: thứ nhất tốc độ sinh trưởng và
sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất cao, thứ
hai có thể kiểm soát được điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật sinh tổng hợp các chất
theo định hướng của chúng ta, thứ ba nuôi cấy vi sinh vật ta có thể thu toàn bộ sinh
khối vi sinh một cách dễ dàng và ít tốn diện tích nuôi cấy. Một số nhóm các nhà
khoa học Nhật Bản [9],[10] đã phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch
fucoidan từ trầm tích biển và nước biển. Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều
nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố.
Chẳng hạn, Sakai và cộng sự [43],[44] đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn
Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các
loài rong Laminariales, Kiellmaniella crassifolia, Lessonia nigrescens và Undaria
pinatifida. Cho đến năm 2004, chúng tôi chưa tìm thấy một công bố nào trong nước
đề cập một cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Việt Nam cũng như việc cắt
mạch chúng thành oligosaccharide sử dụng enzyme từ vi sinh vật biển [1],[2].
Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên tế bào sinh vật
và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định cấu trúc hóa học của

chúng là điều kiện tiên quyết. Các phương pháp sử dụng hóa lý hiện nay (thủy phân,
đề-sulphat hóa, đề-actyl hóa) trước khi phân tích thường đòi hỏi điều kiện acid hoặc
kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của polysaccharide
[7],[8],[9],[11]. Các phương pháp enzyme đặc hiệu có thể được sử dụng để điều chế
các oligosaccharide thích hợp cho các nghiên cứu sinh học cũng như các mẫu đơn
giản hóa, từ đó có thể suy luận ra cấu trúc của fucoidan ban đầu. Ngoài ra việc cắt
ngắn mạch fucoidan bằng enzyme vi sinh vật còn tạo ra các tổ hợp oligosaccharide
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
4
mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu và hiệu lực cao hơn so với fcoidan ban đầu, đây
là xu hướng phát triển trên thế giới [22].
Chính vì vậy, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này tôi chọn đề tài nghiên
cứu là “Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch
fucoidan”.
Nội dung luận văn bao gồm:
 Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan.
 Sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme cắt mạch fucoidan.

 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme
fucoidanase.














Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C

h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy

5
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về rong biển
1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển
Rong biển là kho chứa gồm: thực phẩm, thuốc chữa bệnh, nguyên liệu cho
công nghiệp, nông nghiệp. Đã bao đời nay trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và
đang sử dụng rong biển là thực phẩm trực tiếp trong bữa ăn hằng ngày.
Rong biển (marine algae) là một loại thực vật bậc thấp sống ở biển hoặc
vùng nước lợ ven biển. Sự có mặt trong thủy vực của chúng đóng hai vai trò quan
trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn và còn là nguồn cung cấp thức ăn cho
các loài động vật ven biển [6].
Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước
hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình
sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Hằng năm đại dương cung cấp cho con
người khoảng 200 tỷ tấn rong. Trong 90% cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng
năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% từ rong biển [33],[38].
Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo như: agar, alginat,
carrageenan dùng cho thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học
Các polysaccharide từ rong biển được coi là những chất hữu cơ không được
thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông,
làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định. Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm
bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV nhiều hợp chất
hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây
trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [6].
Giá trị dinh dưỡng của rong biển là cung cấp đầy đủ các chất khoáng, các
acid amin cần thiết, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt
tính sinh học có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh tật. Vì vậy, ngày nay
rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và ngày càng được sử dụng rộng
rãi trên thế giới.
Click to buy NOW!

P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a

c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d

o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w

e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n

g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
6
Theo Algorythme (2000) sản lượng thu hoạch rong biển kinh tế thế giới đạt 8
triệu tấn. Doanh thu hằng năm từ kinh tế rong biển trên thế giới ước tính vào
khoảng trên 8 tỷ USD [38].
1.1.2. Phân loại rong biển
Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà
rong biển được chia làm 9 ngành sau đây:
1) Ngành rong lục (Chlorophyta)
2) Ngành rong nâu (Phaeophyta)
3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta)
4) Ngành rong trần (Englenophyta)
5) Ngành rong giáp (Pyrophyta)
6) Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)
7) Ngành rong kim (Chrysophyta)
8) Ngành rong vàng (Xantophyta)
9) Ngành rong lam (Cynophyta)
Rong đỏ và rong nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và

được ứng dụng nhiều trong nghành công nghiệp và đời sống. Đối với rong lục thì
loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang
được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [6].
1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong nâu trên thế giới
Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là
Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile,
Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong
đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ
Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận
nhiệt đới.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w

.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
7
Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ. Tuy nhiên, tuỳ theo
diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau
của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong.
Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên
667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc

khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000
tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng
27.000 tấn.
Ngành rong nâu có khoảng 190 chi, trên 900 loài phần lớn sống ở biển, số
chi, loài tìm thấy trong nước lợ và nước ngọt không nhiều lắm. Rong có màu nâu
đậm, nâu vàng. Màu sắc khác nhau ở các loài phụ thuộc vào thành phần và tỉ lệ của
các loại sắc tố có trong rong. Rong nâu được coi là nguồn polysaccharide có ứng
dụng rộng lớn nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng như: axit
alginic, fucoidan, laminaran. Trước tiên axit alginic và các muối của chúng được sử
dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học.
Laminaran được biết đến như là những chất kháng ung thư, chất bảo vệ phóng xạ và
chất đông lạnh. Fucoidan và những chất chuyển hóa phân tử thấp như mannitol, các
axit tự do, polyphenol, các hợp chất iod, các vitamin và các acid béo được ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm và nghiên cứu y sinh học.
1.1.4. Rong Mơ Việt Nam
Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ
Fucales, ngành rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố
khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu
và huyện Hà Tiên).
Đây là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài 6-8m, sinh lượng 12kg
rong tươi/m
2
, hình dạng rất giống thực vật bậc cao. Chúng có khả năng phân bố
rộng mọc trên các bờ biển đá, san hô chết…thích hợp từ khoảng phía trên mực triều
thấp cho đến vài ba mét sâu. Từ lâu rong mơ được nhân dân ta sử dụng làm phân
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C

h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
8
bón, nấu lấy nước uống để chữa bệnh hoặc làm thức ăn cho gia súc, ngày nay rong
mơ được dùng để chiết các polysaccharide dùng trong nhiều ngành công nghiệp
thực phẩm và dược phẩm. Sinh lượng trung bình từ 2000-4000g/m
2
, có nơi đến
7000g/m
2
như ở Hòn Chồng, Nha Trang [6].
1.2. Tổng quan về enzyme [3],[5]
1.2.1. Khái niệm chung về enzyme
Định nghĩa
- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein.
- Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật.
- Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng
hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao
đổi chất trong cơ thể sinh vật) gọi là in vivo mà còn xúc tác phản ứng
ngoài cơ thể gọi là in vitro.
- Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật
không thể sống, sinh sản, phát triển bình thường được. Sự sống của sinh
vật sẽ không tồn tại.

Phân loại enzyme
Hội Nghị Sinh Hóa quốc tế lần thứ 5 tiến hành phân loại enzyme thành 6 nhóm
lớn.
- Nhóm 1: Oxydroreductase: xúc tác phản ứng oxy hóa khử.
Ví dụ: Dehydrogenase, oxydase, peroxydase…
- Nhóm 2: Transferase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị một nhóm nào đó
từ chất này sang chất khác.
Ví dụ: Photpho – transferase. Amoniac – transferase.
Metyl – transferase, Cacboxyl – transferase.
- Nhóm 3: Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w

.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
9
Ví dụ: Esterase: xúc tác thủy phân liên kiết este.
Glucosidase: thủy phân liên kết glucoside trong glucid và
glucoid.
Peptidase: thủy phân liên kết peptid trong protein.
Amidase: phản ứng thủy phân các amin.

- Nhóm 4: Lyase: enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra
khỏi hợp chất mà không cần có sự tham gia của nước.
Ví dụ: Decacbonxylase.
- Nhóm 5: Izomerase: xúc tác sự đồng phân chuyển hóa, chuyển dạng đồng
phân này sang dạng đồng phân khác.
- Nhóm 6: Ligase: xúc tác sự tổng hợp các chất hữu cơ nhờ năng lượng
ATP và các chất tương tự.
Ví dụ: Aspagagin – synthetase: enzyme tổng hợp Aspagagin.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của
enzyme.
Thường thì enzyme hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, khi tăng
nhiệt độ quá giới hạn( thường 60
0
C), phân tử protein trong enzyme bắt đầu biến
tính, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, vận tốc phản ứng giảm theo.
Nhiệt độ mà tại đó v = v
max
gọi nhiệt độ tối ưu t
op
. Mỗi enzyme có một t
op
.
Trong phản ứng do enzyme xúc tác, chừng nào enzyme chưa bị biến tính thì
vận tốc phản ứng tăng lên gấp 2 khi nhiệt độ tăng 10
0
C.
Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính enzyme giảm, ở 0
0

C hoạt tính enzyme không còn
đáng kể, khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính enzyme tăng trở lại, vì vậy ứng dụng bảo
quản enzyme ở nhiệt độ lạnh( -20
0
C đến -30
0
C).
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
10
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Bất cứ sự thay đổi nhỏ nào của
pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất. Do đó pH tác dụng
rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme.
Mỗi enzyme có một pH mà tại đó vận tốc phản ứng của enzyme đạt cực đại.
Người ta gọi đó là pH tối ưu của enzyme. Thông thường pH
op
của enzyme nằm ở

vùng acid yếu hay kiềm yếu hay trung tính. Đặc biệt có một số enzyme có pH
op
nằm
ở vùng rất acid như pepsin có pH
op
≈ 1.5 - 2.5 hoặc rất kiềm như tripsin ≈ 8 – 9.
Lý do pH ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme.
Enzyme có nhóm định chức ion hóa (-) hoặc (+) như –COOH, -NH
2
, -OH do
đó pH môi trường thay đổi sẽ làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm chức
này, vì vậy làm thay đổi điện tích của enzyme, khi đó ái lực giữa enzyme và cơ chất
giảm.
Trong một số trường hợp các ion H
+
và OH
-
có thể tham gia trực tiếp vào
phản ứng làm pH môi trường thay đổi, điện tích H
+
và OH
-
thay đổi, vận tốc phản
ứng giảm xuống.
Sau khi enzyme kết hợp với cơ chất sẽ tạo hợp chất trung gian ES. Sự biến
đổi từ chất trung gian đến sản phẩm thì ứng với một dạng ion hóa đặc biệt của phức
ES. Do đó nếu pH môi trường thay đổi sẽ ảnh hưởng đến dạng ion hóa của phức ES
làm vận tốc phản ứng giảm.
Ảnh hưởng của sự oxy hóa và bức xạ
Một số enzyme trong cấu tạo có nhóm –SH, nhóm này rất quan trọng đối với

phản ứng của enzyme. Nó là nhóm định chức ở trung tâm hoạt động và giữ cho
enzyme có cấu hình thích hợp. Tuy nhiên –SH rất dễ bị oxy hóa bởi không khí tạo
cầu S-S làm cho cấu hình của enzyme không còn phù hợp nữa, enzyme mất hoạt
tính.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
11
Enzyme còn bị ảnh hưởng bởi tia bức xạ, đặc biệt rất nhạy cảm với bức xạ có
độ dài sóng thấp (năng lượng cao). Tia UV ảnh hưởng đến hiệu ứng của DNA, ảnh
hưởng đến sự tổng hợp enzyme, dẫn đến hiệu ứng enzyme bị ảnh hưởng và vận tốc
phản ứng thay đổi.
1.2.3. Tính chất của enzyme
Tính chất lý hóa chung
- Enzyme có cấu tạo là protein do đó chúng có đầy đủ tính chất của protein:
dễ biến tính, dễ kết tủa, dễ mất hoạt tính sinh học…
- Enzyme không thẩm tích qua màng bán thấm.
- Enzyme không chịu được nhiệt độ cao, dễ biến tính bởi nhiệt độ cao và có
thể mất hoạt tính xúc tác.

- Tan trong nước, dung môi có cực khác, dung dịch muối loãng, glycerin.
- Khối lượng phân tử lớn.
Cƣờng lực xúc tác và cơ chế tác dụng của enzyme
Cường lực xúc tác
- Enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều so với xúc tác vô cơ.
Ví dụ: phản ứng thủy phân H
2
O
2
: H
2
O
2
 H
2
O + O
2.

- Khi không có xúc tác thí năng lượng cần để hoạt hóa H
2
O
2
là 18000
calo/phân tử gam.
- Khi có xúc tác vô cơ (platin) năng lượng này là 11700 calo/ptg.
- Khi có xúc tác là enzyme catalase năng lượng này là 5500 calo/ptg.
- Người ta có thể khẳng định rằng enzyme tham gia vào vai trò chất xúc tác,
có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa và làm cho phản ứng xảy ra
nhanh chóng, dễ dàng.
Cơ chế xúc tác của enzyme

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
12
- Enzyme tiếp xúc với cơ chất tạo thành phức chất trung gian E-S.
- Khi tạo phức E-S, dưới tác dụng của enzyme, cấu tạo cơ chất bị biến đổi,
phân tử cơ chất S bị phân cực, các điện tích bị phân phối lại do đó làm
thay đổi sự phân bố điện tích, giảm độ bền các liên kết trong phân tử cơ
chất, làm giảm năng lượng hoạt hóa, tăng tốc độ phản ứng.
E + S  E-S  E + P.
 Fise: thuyết chìa khóa với ổ khóa.
Trung tâm hoạt động của enzyme phải có cấu trúc không gian tương ứng,
phù hợp với cấu trúc không gian của S.
 Kosland bổ sung thêm thuyết của Fise.
Sự trùng khớp enzyme và cơ chất về cấu trúc không hoàn toàn tĩnh và cứng
nhắc như chìa khóa với ổ khóa mà giữa cơ chất và enzyme có sự linh đông khi
tương tác giữa cơ chất và enzyme. Giả thuyết này được gọi là thuyết “tiếp xúc cảm
ứng”.
Một số enzyme tiêu hóa như pepsin, trypsin, chimotrypsin … khi mới tiết ra

ở dạng không hoạt động gọi là tiền enzyme (zimogen) có tên là pepsinnogen,
trypsinogen, chymotrypsinogen … chúng chỉ hoạt động khi được hoạt hóa. Trong
quá trình hoạt hóa, sự cắt bỏ một số peptid, các peptid này là các “peptid kìm hãm”
hoạt động enzyme. Nhờ sự cắt bỏ này mà có sự sắp xếp lại nội tại phân tử enzyme,
kết quả dẫn tới sự hình thành trung tâm hoạt động của enzyme có khả năng hoạt
động.
Tính đặc hiệu xúc tác của enzyme
Enzyme chỉ tác dụng lên một loại cơ chất nhất định hoặc chỉ một cơ chất duy
nhất, hoặc chỉ xúc tác một kiểu phản ứng hóa học nhất định. Tính chất này gọi là
tính đặc hiệu của enzyme, đây là một trong những tính chất đặc trưng của enzyme
khác xa chất xúc tác thông thường. Người ta thường phân biệt các dạng đặc hiệu
sau:
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
13
 Đặc hiệu quang học.
 Đặc hiệu tương đối.
 Đặc hiệu nhóm.

 Đặc hiệu tuyệt đối.
Đặc hiệu quang học
Đa số chất hóa học trong tự nhiên là chất hoạt quang có các dạng đồng phân
quang học khác nhau. Mỗi enzyme chỉ tác động lên một trong những đồng phân
quang học sau: dạng D, dạng L, dạng cis, dạng trans …
Ví dụ: Fumarat-hydratase chỉ tác dụng lên dạng L-acid malic mà không tác
dụng lên dạng D-acid malic.
Đặc hiệu tương đối
Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong
cơ chất mà không phụ thuộc vào bản chất hóa học của các cấu tử tham gia hình
thành liên kết đó.
Ví dụ: Lypase thủy phân liên kết ester trong các chất béo mà không phụ
thuộc vào các gốc R1, R2, R3.
Đặc hiệu nhóm
Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định và cấu
tạo một trong 2 cấu tử tham gia hình thành liên kết đó phải xác định.
Ví dụ: Cacbonxyl peptidase thủy phân liên kết peptid, liên kết này phải
nằm gần gốc –COOH tự do.
Aminopeptidase thủy phân kiên kết peptid, liên kết này phải nằm ở
gần gốc –NH
2
tự do.
Đặc hiệu tuyệt đối
Enzyme chỉ tác dộng lên một chất nhất định.
Ví dụ: Urease chỉ tác động lên ure.
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C

h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
14
Arginase chỉ thủy phân L-agrinin tạo L-ornitin + ure.
Maltase chỉ thủy phân malto.
vv
Sử dụng enzyme trong nghiên cứu polysacharide.
Để thu nhận những thông tin về cấu trúc của polysacharid, đặc biệt là
fucoidan sẽ rất hiêu quả nếu sử dụng enzyme.
Ví dụ: Enzyme 1,6-L-fucoidanse sử dụng để xác định fucose trong liên kết 1,6.
Enzyme L-fucoidanase được sử dụng để chuyển hóa fucoidan thành các
oligo fucan sulphat hóa.
1.3. Giới thiệu về Fucoidan
1.3.1. Fucoidan
Fucoidan là một polysaccharide sulphate được Kylin mô tả đầu tiên vào năm
1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata và ông điều chế được chúng vào năm
1915 với tên gọi là Fucoidin [13]. Sau gần 100 năm kể từ khi Kyllin phát hiện ra,
fucoidan được mô tả là một polysaccharide sulphat hóa dị hợp, trong đó fucose
chiếm từ 18,6% đến 60% [30],[31], sulphat chiếm từ 17,7% đến 32,9% [30],[48],
ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose,
xylose, rhamnose và acid uronic. Các liên kết glycosit là liên kết (1-3), (1-2) hoặc
(1-4) và các liên kết này có thế là liên kết mạch thẳng hoặc mạch nhánh. Vị trí
nhóm sulphat có thể ở 3 vị trí đó là C

2
, C
3
và C
4
. Những năm sau này fucoidan
không chỉ được tìm thấy ở các loài rong nâu mà còn được tìm thấy ở một số loài
động vật thân mềm biển như Dưa chuột biển, Cầu gai biển tuy nhiên đáng kể nhất
vẫn là fucoidan chứa trong rong nâu với hàm lượng lên tới 6,5% trọng lượng khô.
Một số loài rong chứa fucoidan được chỉ ra trên hình 1.1.



Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w

e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n

g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
15

Hình 1.1: Một số loài rong có chứa Fucoidan.
1. Fucus vesiculosus, 2. Laminaria digitata, 3. Fucus evanescens, 4. Fucus serratuss, 5. Asscophyllum
nodosum, 6. Pelvetia canaliculata, 7. Cladosiphon okamuranus, 8. Hizikia fusiforme, 9. Laminaria japonica,
10. Sargassum horneri, 11. Nemacystus decipiens, 12. Padina gymnospora, 13. Stichopus japonicas[35].

Đặc biệt fucoidan không được tìm thấy ở động thực vật trên cạn. Fucoidan từ
các nguồn chiết khác nhau thì có cấu trúc khác nhau. Hơn thế nữa, cùng một nguồn
fucoidan nhưng phương pháp tách chiết khác nhau sẽ thu được fucoidan có thành
phần khác nhau. Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu khác nhau để chiết được
fucoidan có hiệu suất cao sẽ có phương pháp chiết đặc biệt để chiết chúng. Do đó,
cho đến nay mới chỉ có duy nhất một loại fucoidan được bán trên thị trường đó là
fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m

Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy
16


Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.

1.3.2. Hoạt tính sinh học của Fucoidan
 Hoạt tính chống đông tụ
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính chống đông tụ của fucoidan có thể
có mối quan hệ với vị trí của nhóm sulphat, trọng lượng phân tử và thành phần
đường. Fucodan có chứa nhóm sulphat cao hơn thường có hoạt tính chống đông tụ
cao hơn so với fucoidan không có nhóm sulphat (E. kurome, H. fusiforme, etc.)
[21], [36].
 Hoạt tính kháng u
Năm 1937, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã chiết các hợp chất
trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến acid, đem thử hoạt tính kháng
ung thư và họ cho rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-

X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c

o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m