Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định sự biến đổi vật chất và năng
lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosin triphosphate (ATP)…
là những chất cần thiết cho sự sống [2]. Ngoài ra lân còn đóng những vai trò khác như tạo
môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây. Đất chứa khối
lượng lớn chất chứa lân. Tuy nhiên không phải hợp chất chứa lân nào trong đất cũng được
cây sử dụng dễ dàng. Đặc biệt là đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên vốn rất giàu lân tổng số
nhưng lân dễ tan lại rất thấp.
Sự chuyển hóa lân xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của quá trình hóa học và sinh học
[1]. Quá trình chuyển hóa hợp chất phophat khó tan trong đất có phần đóng góp quan trọng
của các loại vi sinh vật. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa quặng phosphate khó tan thành
dễ tan để cây trồng hấp thụ được. Do vậy bón vi sinh vật phân giải phosphate khó tan sẽ
cung cấp một lượng lân dễ tan cho cây trồng và giúp cây hấp thụ các chất dinh dưỡng
trong đất tốt hơn [3].
Ngoài ra những vi sinh vật chuyển hóa hợp chất lân vừa có khả năng tạo các chất
dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật đồng thời cũng có
khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [7].
Theo Fridland (1973) đất bazan nâu đỏ là loại đất hình thành trên đất bazan, trong
điều kiện nhiệt đới ẩm, các bazơ bị rửa trôi mạnh, đất có phản ứng chua, sắt nhôm tích lũy
nhiều, đây là nguyên nhân chủ yếu của quá trình giữ chặt lân trên đất bazan [13].
Theo Đoàn Triệu Nhạn (1999): Đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lân
tổng số đạt 0,02% P
2
O
5
và lượng lân dễ tiêu là 4,12mg P
2
O
5
/ 100g đất [13].

Đak Lak với hơn 360.000 ha đất bazan nâu đỏ là một loại đất giàu lân tổng số rất
thích hợp cho việc phát triển các cây công nghiệp dài ngày [21]. Tuy nhiên các quá trình cố
định lân từ dễ tiêu thành dạng khó tiêu thường xuyên xảy ra nên lượng lân dễ tiêu luôn ở
mức nghèo. Đồng thời, nông dân trong thời gian qua thường chỉ dùng phân hóa học để bón
cho cây trồng thiếu bón phân hữu cơ cũng như phân vi sinh vật làm cho đất trồng bị thoái
hóa, chai cứng, vi sinh vật đất bị suy thoái, gây ô nhiễm môi trường.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu
phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu
đỏ ở Đak Lak.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải photphate khó tan cao
trên đất Bazan nâu đỏ tại Đak Lak.
1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phân làm sáng tỏ vai trò của vi sinh vật phân giải
lân khó tan . Các nghiên cứu của Việt Nam và thế giới về phân giải lân khó tan dạng
phosphate sắt, nhôm còn rất ít nghiên cứu. Đáng chú ý đề tài nghiên cứu, tuyển chọn và
phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân khó tan hiệu quả trên đất bazan nâu
đỏ trong điều kiện cụ thể ở Đak Lak và góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật bản địa hữu
ích.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh
vật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông, lâm nghiệp nhằm cung cấp lân dễ tan cho cây
trồng, giảm chi phí đầu tư, giảm sự thoái hóa đất, góp phần cải thiện đời sống của nông dân
và bảo vệ môi trường nông thôn ở Đak Lak.
1.4. Giới hạn của đề tài
Trong quá trình thực hiện do thời gian, trang thiết bị, hóa chất có hạn nên chúng tôi
chỉ tiến hành phân lập trên một số mẫu đất của tỉnh Đak Lak và chỉ theo dỏi một số chỉ tiêu
cơ bản. Mặc khác, là sinh viên lần đầu tham gia nghiên cứu nên không thể tránh khỏi thiếu
sót. Kính mong quý thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Các dạng lân trong đất
Lân rất quan trọng đối với cây trồng. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng lân bởi cây trồng
không quá 25%, trong khi đó một lượng lớn bị cố định trong đất và chuyển thành dạng khó
hấp thụ. Lượng dự trữ lân trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P
2
O
5
nhưng chúng tồn tại trong đất
ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ. Thành phần lân dễ tan và khó tan trong đất
được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ quyết
định [5].
Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng phosphate trung bình ở nhiều loại đất
thường từ 0.02 – 0.08%. Do quá trình tích lũy sinh học, hàm lượng phosphate trong lớp đất
mặt cao hơn ở lớp dưới [13].
Trong các loại đất khoáng , tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 – 65%. Các cỡ hạt thuộc
thành phần sét thường chứa nhiều lân hơn các cỡ thuộc thành phần cát. Do đó: Ở các chân
đất nhẹ, đất bạc màu… có ít keo sét, thì tỉ lệ phosphate thường thấp hơn các loại đất khác
[13].
Tỉ lệ lân trong đất khác nhau thùy theo tính chất của đá mẹ và những tầng phát sinh
từ đá mẹ như: Nai, mica, quartzit… thường tỉ lệ lân thấp hơn là đất phát sinh từ mẫu thạch
không chua như: Bazan, đá vôi,…[13]
Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn phosphate
quan trọng. Như vậy việc bổ sung chất hữu cơ vào đất giúp làm tăng cường hàm lượng lân
cho đất. Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng , phosphate tồn tại ở hai dạng chủ
yếu sau:
2.1.1 Lân hữu cơ
Tùy loại đất, tỷ lệ phosphate hữu cơ thường chiếm từ 20 – 80% phosphate tổng số
trong đất. Ở lớp đất mặt, phosphate chiếm khoảng 50% [5]. Phosphate hữu cơ trong đất chủ
yếu ở trong thành phần mùn. Đất càng giàu mùn thì càng giàu phosphate hữu cơ. Theo

Kletcôpki và Petecbuaxki (1964) thì: Trong phosphate hữu cơ của đất, dạng phổ biến nhất
là dạng fytat, có thể chiếm đến 50% tổng số phosphate hữu cơ. Tùy theo môi trường acid
hay kiềm mà tồn tại các dạng fytat khác nhau. Ở đất chua, phosphate hữu cơ chủ yếu là
fytat Fe, Al; ở đất trung tính, kiềm tồn tại dạng fytat Ca, Mg [13].
Phosphate hữu cơ trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp các hợp
chất chủ yếu như fitin, phospholipide, acid nucleic. Điều đáng chú ý là phosphate ở vi sinh
vật không tham gia trực tiếp vào dinh dưỡng cây trồng mà phải đợi vi sinh vật chết đi, tế
bào bị khoáng hóa thì cây trồng mới hấp thu được [5].
Khi thực hiện khoáng hóa có sự tham gia của vi sinh vật phân giải phosphate, những
hợp chất hữu cơ (trong đó có lân hữu cơ) sẽ được khoáng hóa để giải phóng ra lân vô cơ
hay hữu cơ, là nguồn dinh dưỡng cung cấp thức ăn cho cây trồng. Có 70 – 80 tập đoàn vi
sinh vật tham gia vào quá trình phân giải phosphate [13]. Trong quá trình khoáng hóa chất
hữu cơ của đất, phosphate hữu cơ được giải phóng ra dưới dạng acid phosphoric và muối
dễ tan của nó. Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp phụ và vi sinh vật hút lại, nên trong
đất rẩ ít phosphate ở dạng hòa tan. Nhiều tác giả nghiên cứu cho rằng: Nếu chất hữu cơ vùi
trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate thì qua quá trình phân giải không những hàm
lượng phosphate hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm xuống (Ivanop 1955) [3].
Theo những công trình nghiên cứu của Kaila (1954): Nếu chất hữu cơ vùi xuống đất
chứa ít hơn 0.2 – 0.3% P
2
O
5
thì quá trình phân giải không tăng thêm về phosphate dễ
tancho cây vì vi sinh vật sẽ hút hết. Cường độ hút phosphate hữu cơ của đất thông qua sự
phân giải của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo Sepfe-Satsaben (1960)
trong điều kiện nhiệt độ bình thường, ở các nước ôn đới , sự khoáng hóa phosphate hữu cơ
tiến hành rất chậm và lượng phosphate cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu cơ không
đáng kể. Trái lại, ở nhiệt độ từ 35 – 50
o
C thì quá trình khoáng hóa tăng lên rất mạnh và

cung cấp cho cây được nhiều phosphate từ những hợp chất hữu cơ. Vì thế, ở nước ta bón
phân chuồng cũng là giải pháp cung cấp phosphate cho cây trồng [13].
2.1.2. Lân vô cơ
Phosphate vô cơ tồn tại ở dạng muối của những nguyên tố Ca, Fe, Al. Ở đất trung
tính và đất kiềm thì phosphate Ca là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate Fe, Al là chủ
yếu. Phosphate Ca dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate Fe, Al. Sự
tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển đổi
hóa trị [13].
Môi trường chua: H
2
PO
4
-
HPO
4
2-
PO
4
3-
Trong thực tế, H
2
PO
4
-
là dạng cấy trồng dễ hấp thu nhất. Các dạng phosphate còn lại
thường là những loại khó hòa tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn cây trồng
sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan [13]. Cũng như các yếu tố
khác, phosphate trong tự nhiên luôn luôn tuần hoàn chuyển hóa. Nhờ vi sinh vật, lân hữu cơ
được vô cơ hóa biến thành dạng muối của acid phosphoric. Các dạng lân này một phần
được cây trồng sử dụng biến thành dạng lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng khó tan

như Ca
3
PO
4
, AlPO
4
, FePO
4
. Những dạng khó tan này trong các môi trường có pH thích hợp
sẽ chuyển thành dạng dễ tan. Trong quá trình này, vi sinh vật giữ vai trò quan trọng.
2.1.3 Vòng tuần hoàn của lân trong tự nhiên
Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi nitơ
luôn khan hiếm trong đất thì lân tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải [15, 18]. Nitơ
được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố định đạm từ không khí, còn đối với lân, chúng được
các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau. Vòng tuần hoàn của
lân được biểu diễn trong sơ đồ sau:
2.2. Sự chuyển hóa lân trong đất
2.2.1. Đối với lân hữu cơ
Trong đất có nhiều loại vi sinh vật khoáng hóa được lân hữu cơ. Các vi sinh vật này
tiết ra các enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate. Phản ứng enzyme
nhanh khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất và sau đó xảy ra chậm khi lân đã bị cải
biến. Lân sẽ tạo các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng cao và bị giữ
chặt trên các phần tử sét.
Tốc độ giải phóng lân phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Acid nucleic dễ khoáng hóa hơn phytin.
Nguyên nhân dohầu hết các vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ đều tiết ra các enzyme tương
ứng để phân giải acid nucleic [3].
- Nếu lượng C/P cao hơn 300 thì lân sẽ bị các vi sinh vật trong đất cố định. Còn ở
mức C/P nhỏ hơn 200, lân sẽ thừa nên được khoáng hóa [3].
Cây xanh Động vật

PO
4
3-
trong dung dịch đất
PO
4
3-
bị hấp thụ
Hòa tan
Lân vô cơ
Cố định tạm thời
Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật
Chất hữu cơ mùn hóa
Quá trình khoáng Quá trình cố định
- pH tối thích là 6 – 7. Ở môi trường kiềm lân vô cơ được phóng thích nhanh hơn lân
hữa cơ.
- Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ. Tối thích là 40 –
50
o
C. Do đó, trong mùa hè tốc độ khoáng hóa lân mạnh hơn các mùa khác.
2.2.2. Đối với lân vô cơ
Sự tồn tại các loại ion phosphate trong đất phụ thuộc vào pH đất. Do vậy, thực tế
trong đất, lân tồn tại chủ yếu ở hai dạng: H
2
PO
4
-
và HPO
4
2-

.
H
2
PO
4
-
HPO
4
2-
PO
4
3-
Ở pH = 7 tỷ lệ 2 loại ion này gần bằng nhau. H
2
PO
4
-
dễ đồng hóa hơn HPO
4
2-
, nên về
mặt lý thuyết ở pH = 5 – 6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất. Song trong đất do có mặt
của nhiều ion khác mà vấn đề trở nên phức tạp hơn.
2.2.2.1. Sự chuyển hóa lân ở đất chua
Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng hòa tan
phản ứng với H
2
PO
4
-

tạo thành hợp chất không tan cây không đồng hóa được [13].
Al
3+
+ H
2
PO
4
-
+ 2H
2
O 2H
+
+ Al(OH)
3
.H
2
PO
4
Ở các loại đất rất chua, Al
3+
và Fe
3+
vượt các ion H
2
PO
4
-
nhiều làm cho phản ứng
trên càng nghiêng theo chiều thuận, tạo thành lân không tan khiên cho chỉ còn một lượng
rất nhỏ H

2
PO
4
-
trong đất.
Ở đất chua, ion H
2
PO
4
-
không những phản ứng với Fe
3+
, Al
3+
hòa tan mà còn phản
ứng với các oxit ngậm nước của các nguyên tố đó như gibbsit (Al
2
O
3
.3H
2
O) và goethit
(Fe
2
O
3
.3H
2
O). Ở đất chua số lượng lân bị các oxit sắt, oxit nhôm ngậm nươc cố định còn
vượt quá cả số lượng lân bị kết tủa với Fe, Al và Mn hòa tan.

Dung dịch acid
Dung dịch kiềm
Không tan
Al(OH)
3
+ H
2
PO
4
-
Al(OH)
2
.HPO
4
-
+ H
2
O
Điều đáng lưu ý là hầu hết các loại đất đều chứa oxit sắt, nhôm ngậm nước nên đây
cũng là kiểu cố định khá nhiều lân và diễn ra trên phạm vi rộng.
Trong môi trường chua còn có hai quá trình cố định lân liên quan tới sét. Đó là do sự
tồn tại các ion OH
-
lộ trên bề mặt khoáng sét. Sự cố định này đi kèm với việc giải phóng
kiềm theo phản ứng sau:
Sét – OH + Ca(H
2
PO
4
)

2
sét – H
2
PO
4
-
+1/2Ca(OH)
2
Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự sau đây:
Illit > Kaolinit > Montmorillonit.
[Al] + H
2
PO
4
-
+ 2H
2
O 2H
+
+ Al(OH)
2
.H
2
PO
4
Vai trò của sắt và nhôm thể hiện qua thực tế là việc cố định các anion mạnh lên khi
tỉ lệ SiO
2
/seoquioxit giảm, với các loại đất đã mất vôi nếu các seoquioxit cũng mất đi thì
khả năng cố định lân cũng giảm.

Còn về vôi, người ta thấy khi để cho sét hấp thụ Ca
2+
, tỉ lệ anion phosphate được hấp
thu tăng lên, bất chấp ngưỡng kết tủa canxi phosphate. Điều đó chứng tỏ rằng : Đây là quá
tình cố định ion chứ không phải bằng con đường hóa học. Tính ổn định của quá trình giữ
chặt này phụ thuộc vào điều kiện môi trường và việc giải phóng anion có thể xảy ra khi
điều kiện môi trường thay đổi và đặc biệt là nếu sét bị giải keo.
Ở đất chua, các hydroxit sắt, nhôm lương tính có thể mất 1 nhóm OH
-
trở thành keo
dương tính tham gia hấp phụ trao đổi anion:
Al(OH)
3
+ H
+
= Al(OH)
2
+
+ H
2
O
2.2.2.2. Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm
Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H
2
PO
4
-
phản ứng mạnh với Ca tạo thành các
hợp chất ít tan hơn theo các phản ứng lần lượt như sau [13]:
Ca(H

2
PO
4
)
2
+ CaCO
3
+ H
2
O → 2CaHPO
4
.2H
2
O + CO
2
6CaHPO
4
.2H
2
O + 2CaCO
3
+ H
2
O → Ca
8
H
2
(PO
4
)

6
.5H
2
O + 2CO
2
Ca
8
H
2
(PO
4
)
6
.5H
2
O + CaCO
3
→ Ca
3
(PO
4
)
2
+ CO
2
+ 6H
2
O
Lân trở nên kém hòa tan hơn khi gặp điều kiện thuận lợi và đủ thời gian Ca
3

(PO
4
)
2
có thể chuyển thành các hợp chất không tan hơn nữa như hydroxy, carbon và ngay cả
fluoro apatit.
2.3 Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân
Vi sinh vật (microorganisms) là tên chung dùng để chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏ bé
mà muốn thấy chúng, người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Theo Hoàng Lương Việt
(1978) trung bình một gam đất khô có đến gần 200 triệu tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật có
các nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi tảo, virus [6]. Các nhóm
có khả năng phân giải phosphate là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc [5]. Nghiên
cứu của Puneet và cộng sự cho thấy: Việc nhiểm một số chủng nấm sợi có khả năng hòa
tan phosphate như Aspergillus flavus và Asp. niger với vi khuẩn cố định nitơ
Azotobacter sp đã tăng năng suất hạt 17.7%, trong khi chỉ nhiễm Azotobacter sp chỉ làm
tăng 9% [18]. Kopoor và cộng sự cũng đạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp
giữa chủng Azotobacter sp với các vi khuẩn phân giải phosphate thuộc các chi
Asgrobacterium sp, Bacillus sp và Pseudomonas sp…[20]
Vi sinh vật phân giải lân được chia thành hai nhóm: Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ
và vi sinh vật phân giải lân vô cơ.
2.3.1 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ
Sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H
3
PO
4
(Stoklaza – 1991,
Menkina – 1952) theo sơ đồ sau [1, 5]:
1. Nucleoprotein Nuclein acid nucleic Nucleotic H
3
PO

4
2. Lơxitin Glixerphosphate H
3
PO
4
Sơ đồ của quá trình phân giải nucleoprotein cụ thể như sau:
Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas.
Ngoài ra còn có một số xạ khuẩn và nấm khác. Đáng chú ý là B. megaterium var
phosphatsum có khả năng phân giải lân hữu cơ cao [13]. Đồng thời B. megaterium còn có
khả năng hình thành bào tử nên sức sống rất mạnh [4].
2.3.2. Vi sinh vật phân giải lân vô cơ
Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,
Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả năng
phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ liên quan mật thiết tới sự
sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ yếu thúc
đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ [3].
Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2

CO
3
+ H
2
O → Ca(PO
4
)
2
H
2
O + Ca(HCO
3
)
2
Nucleoprotein
protein
Acid nucleic
4C
5
H
10
O
5
C
6
H
5
O
5
C

5
H
5
O
5
O
C
5
H
5
O
5
O
2
C
4
H
5
O
5
O
Acid amin
4H
3
PO
4
Chất khác
H
2
OH

2
SCO
2
NH
3
Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng
quan trọng trong việc phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
. Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích
lũy trong đất HNO
3
và H
2
SO
4
. Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phương trình sau:
Ca
3
(PO4)
2
+ 4 HNO
3
= Ca(H
2
PO
4

)
2
+ 2 Ca(NO
3
)
2
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2 H
2
SO
4
= Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2CaSO
4
Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất. Ngoài ra
còn có một số chủng khác như Penicillin, Rhizopus…
2.3.3. Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật
- Độ pH: nhìn chung pH ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân. Tuy nhiên pH
trong khoảng 7.8 – 8.0 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân [5].
- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân là

khác nhau. Nhìn chung khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40
o
C [9].
- Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó
khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên.
- Độ ẩm: ở những nơi có độ ẩm cao, do hoạt động của vi sinh vật mạnh nên tạo ra
nhiều acid hữu cơ làm tăng phân giải lân.
- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó phân giải
lân cũng được tăng cường. Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất độc ngăn cảng
sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật.
- Tỷ lệ N và C trong môi trường: N, C là những thành phần cần thiết cho sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tỉ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năng
phân giải lân.
2.4. Tổng quan về đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak
Theo hệ thống phân loại đất của FAO – UNESCO (1995), Đak Lak có 11 nhóm và
84 đơn vị đất đai. Trong đó, nhóm đất xám chiếm diện tích lớn nhất 44%. Nhưng nhóm đất
sám thường phân bố ở những vùng đất dốc, về bản chất có độ phì thấp, chua, hàm lượng
lân tổng số và lân dễ tiêu thấp. Như vậy, nhóm đất xám không thuận lợi cho việc trồng các
loại cây trồng. Nhóm đất chiếm diện tích nhiều thứ 2 ở Đak Lak là đất bazan đỏ
(Ferrasols). Diện tích đất bazan đỏ khoảng 311.340ha, chiếm 23.7% diện tích đất tự nhiên.
Phân bố tập trung tại các khối bazan Buôn Ma Thuột. Nhóm đất này có các đơn vị phân
loại: Nâu đỏ trên Bazan (Fk), nâu vàng trên bazan (Fu), là nhóm đất có tầng B tích tụ nhôm
rõ nhất. Đất được phân bố tập trung ở khối bazan Buôn Ma Thuột chảy từ bắc xuống Nam,
từ Đông sang Tây. Phía Bắc cao nguyên (Ea H'Leo) có độ cao 800m, phía Nam độ cao 400
m, phía Tây cao 300m (khu vực huyện Cư M'gar). Bề mặt cao nguyên rất bằng phẳng [21].
Đất bazan nâu đỏ hình thành và phát triển trên các cao nguyên Ba zan phần lớn có
độ dốc thấp, tầng đất mịn dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi ẩm,
độ xốp trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt... Rất thích hợp với các
loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao: cà phê, cao su, tiêu và những cây ăn
quả khác... [21]. Tuy nhiên, điểm hạn chế của nhóm đất này là hàm lượng lân dễ tiêu thấp,

lượng P
2
O
5
dễ tan nhỏ hơn 1,0 mg/100 g đất. Trong khi đó, lân tổng số của nhóm đất này
lại cao, P
2
O
5
tổng số trên 0.2% [21].
2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy người ta tìm cách để tăng
lượng lân dễ tan trong đất bằng cách bón phân. Nhưng 2/3 lượng lân bón vào đất bị chuyển
hóa trở thành lân khó tiêu khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rữa trôi đi. Do đó
hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều. Các vi sinh vật phân giải lân khó tan đã
giải quyết được vấn đề này. Chúng vừa giảm được lượng phân lân bón cho cây, đồng thời
huy động được cả lượng lân khó tiêu trong đất. Với những lợi ích như vậy, các vi sinh vật
phân giải lân được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Nhiều công trình nghiên cứu ở châu
Âu, Mỹ và Ấn Độ đã cho thấy hiệu quả to lớn của các vi sinh vật phân giải lân.
Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957 , Katznelson và Bose,1967; Ostwal và Bhide,
1999 cho thấy: các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus, các chủng
nấm thuộc loài Penicillium, Aspergillus có khả năng chuyển hóa photphat không tan thành
dạng dễ hòa tan ở trong đất nhờ tiết ra các acid hữu cơ như formic, acetic, lactic, propionic,
fumaric, glucolic và acid succinic. Những acid này làm giảm pH và hòa tan các dạng
photphate khó tan [20].
Ở Liên xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với sự
có mặt của B. megateirum var phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên xô và các
nước Đông Âu , làm tăng năng suất cây trồng 5 – 10% so với đối chứng.Viện nghiên cứu
nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng đã cho kết
quả tăng đáng kể so với đối chứng. Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phân giải lân có

tác dụng tương đương với việc bón 50kg P
2
O
5
/ha [3].
Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada cho thấy bón vi sinh vật phân giải lân có thể
thay thế 50 – 75% lượng lân cần bón bằng quặng nghèo P
2
O
5
mà năng suất, chất lượng
không hề thay đổi (Gaur, 1992). Sử dụng chủng Pseudomonas striata khi bón quặng
phosphate và superphosphate cũng làm tăng đáng kể năng suất khoai tây (Gaur và Negi,
1980) [16].
Perez (2007) đã nghiên cứu phân lập được 130 chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải phosphat khó tan ở Venezuela. Tuy nhiên, không có chủng nào có hoạt tính phân giải
phosphate Fe và Al. Tác giả cũng chọn được 10 chủng có tiềm năng để nghiên cứu tiếp
thuộc các chi Raltonia, Pantoea, Serratia [15].
Alvaro (2009) đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ rễ cỏ ở Tây Ban Nha có hoạt
tính phân giải phosphate và kích thích sinh trưởng đối với cây trồng thuôc chi mới là
Acenitobacter [17].
Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụng
công nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp, ứng dụng trên
hàng chục triệu ha [3].
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững. Việt Nam đã có khá
nhiều nghiên cứu về vi sinh vật phân giải lân. Thập kỉ 90 thế kỷ XX các vi sinh vật phân
giải lân sau khi được nhân sinh khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩm vi
sinh vật phân giải lân hoặc phối trộn với chất hữu cơ để tạo thành phân lân hữu cơ vi sinh
vật.

Kết quả nghiên cứu ở nhiều nơi cho thấy phân vi sinh vật phân giải photphate khó
tan có thể nâng cao hiệu quả sử dụng phân lân khoáng lên 20 – 30% so với đối chứng đồng
thời có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng 5 – 10% tùy loại đất trồng và cây trồng. Việc
sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 30 – 50% lượng lân cần bón bằng quặng
phosphorit với hàm lượng lân tổng số tương đương mà năng suất cây trồng không bị giảm
sút. Ngoài tác dụng phân giải lân ,vi sinh vật phân giải lân còn có khả năng sản sinh ra các
chất kích thích sinh trưởng thực vật hoặc các chất kháng sinh giúp cây trồng phát triển tốt
hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài [7]. Nguyễn Thị Phương Chi,
Phạm Thanh Hà, Nguyễn thị Quỳnh Mai đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme photphataza
của 10 chủng vi sinh vật hòa tan lân và nhận thấy rằng ngoài khả năng hòa tan lân khó tan
các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và
vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học
các hợp chất hữu cơ chứa lân. Vũ Thúy Nga ,Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Thủy Tú, Phạm
văn Toản (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate vô cơ khó
tan của vi khuẩn Bradyrhizobium. Kết quả cho thấy chúng có khả năng tổng hợp 20 – 100
microgam/ml môi trường nuôi cấy. Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999)
nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên khả năng phân giải photphat khó tan của hai
chủng nấm sợi Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1.Tác giả nghiên
cứu 7 nguồn cung cấp nitơ khác nhau lên khả năng phân giải photphat của Aspergillus
awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1. Kết quả cho thấy KNO
3
, NaNO
3
,
(NH
4
)
2
SO
4

là những nguồn nitơ tốt nhất cho môi trường nuôi chủng MN1 tạo khả năng
phân giải photphat cao. Còn đối với chủng ĐT1 là NH
4
Cl [10].
Nghiên cứu gần đây nhất đối với vi sinh vật phân giải lân trên đất bazan nâu đỏ là sử
dụng chế phẩm vi sinh phân giải lân (50g) cho 1 ha cà phê có tác dụng tương đương với
34.3kg P
2
O
5
/ha [13]. Nghiên cứu cũng cho thấy, việc bón thêm vi sinh vật phân giải lân
làm tăng số lượng vi sinh vật phân giải lân trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải lân
khó tan trong đất 23 – 35%.
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật phân giải photphat khó tan trên đất
bazan nâu đỏ ở Đak Lak.
- Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan mạnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính phân giải phosphate
khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc) đến
khả năng phân giải phosphate khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu khảo sát hoạt tính phân giải phosphate nhôm khó tan của các chủng vi
sinh vật được tuyển chọn.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp thu mẫu
Địa điểm thu mẫu: Rẫy cà phê của các địa bàn sau: thôn 4 - xã Eahu - huyện Cư
Kuin, thôn 3 – xã Cư Suê – huyện Cư Mgar, Thôn Xuân Hoà – Xã Phú Xuân – Huyện
Krông Năng.
Thời gian thu mẫu: từ ngày 29/01/2010 đến ngày 31/01/2010.

Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 0 đến 30cm. Lượng đất lấy mỗi lần từ 40 – 50g.
Mẫu đất được đựng trong túi nilon polypropylen đã được khử trùng. Các mẫu sau khi lấy
được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu đất sau khi thu được đem ngay tới
phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập [15].
3.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
Môi trường phân lập nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa phosphate khó tan được sử
dụng là NBRIP [15]. NBRIP là môi trường chỉ chứa dạng phosphate khó tan nên các vi sinh
vật muốn sinh trưởng và phát triển được phải có khả năng sử dụng phosphate khó tan. Hay
nói cách khác, các vi sinh vật đó phải có khả năng phân giải phosphate khó tan. Thành phần
cơ bản của môi trường NBRIP gồm:
- 5 g Ca
3
(PO
4
)
2

- 0.25g MgSO
4
.
- 0.2g KCl.
- 0.1g (NH
4
)
2
SO
4
- 5 gMgCl
2.
6 H

2
O.
- 10g glucose
- Nước 1lít.
-Phân lập các vi khuẩn trên môi trường đặc ở đĩa petri [8]:
+ Đất được nghiền nhỏ và phơi khô.
+ Cân 1g đất pha trong 99ml nước muối sinh lý 0.9% vô trùng. Lắc 10 phút.
+ Pha loãng dung dịch đất 10
-2
– 10
-5
lần.
+Dùng micropipette có đầu côn vô trùng hút 0.1ml dịch đất ở các độ pha
loãng cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường NBRIP.
- Tuyển chọn các vi khuẩn phân giải phosphate khó tan: sau 5 – 7 ngày, quan sát
khuẩn lạc, những khuẩn lạc nào có vòng phân giải được lựa chọn.
- Đếm số lượng tế bào (CFU/ml) theo Trần Linh Thước (2007). Đếm tất cả các
khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để
tính kết quả. Mật độ vi sinh vật phân giải phosphate tổng số được tính theo công thức sau
[12]:
A (CFU/ml) =
Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm trên cá đĩa đã chọn.
n
i
: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng i.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
f
i
: độ pha loãng tương ứng.

- Làm thuần: cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi trường
NBRIP khác để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 – 3 lần. Chọn
khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy truyền vào ống thạch nghiên để giữ giống.
3.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải photphat khó tan của các chủng vi
sinh vật
Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật dựa trên nồng độ
PO
4
có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ PO
4
càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị
phân giải càng nhiều.
Nồng độ PO
4
được xác định bằng phương pháp xanh molipdate [9]. Nguyên tắc của
phương pháp là ion PO
4

sẽ phản ứng với (NH
4
)
2
SO
4
tạo ra phức chất (NH
4
)
2
PO
4

.12MoO
3
màu vàng. Trong điều kiện acid và có ion Sn
2+
phức màu vàng sẽ chuyển thành phức màu
xanh (NH
4
)
3
(4MoO
2
.2MoO
3
):
PO
4
3-
+ 12(NH
4
)
2
SO
4
+ 24H
+
= (NH
4
)
2
PO

4
.12MoO
3
+ 21NH
4
+
+ 12H
2
O
(NH
4
)
2
PO
4
.12MoO
3
+ Sn
2+
+ 16H
+
= (NH
4
)
3
(4MoO
2
.2MoO
3
) + Sn

4+
+ 8H
2
O
Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại ở 690nm. Sử dụng máy UV Vis đo ở
bước sóng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất. Độ hấp thụ màu càng lớn
chứng tỏ nồng độ ion PO
4
càng cao.
N
n
1
Vf
1
+ … + n
i
Vf
i
Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ PO
4
cần thiết lập
phương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng KH
2
PO
4
. Sử dụng dung dịch KH
2
PO
4
5mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng 3.1.

Bảng 3.1. Bảng nồng độ KH
2
PO
4
(mg/l)
Nồng độ PO
4
(mg/l) Thể tích KH
2
PO
4
5mg/l (ml) Thể tích nước cất (ml)
0 0 100
0.1 2 98
0.2 4 96
0.3 6 94
0.4 8 92
0.5 10 90
Thực hiện phản ứng xanh molipdate các nồng độ KH
2
PO
4
rồi đo OD ở bước sóng
690nm. Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l được
xây dựng trên phần mềm Excel.
Chuẩn bị bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường NBRIP đã được khử
trùng. Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 5 ngày. Sau đó, lấy 1.5ml dịch
môi trường nuôi cấy đem ly tâm ở 10000rpm trong 10 phút. Hút cẩn thận 1ml dich phía trên
để làm phản ứng xanh molipdate rồi đo OD xác định nồng độ PO
4

.
Chọn ra 6 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphate khó tan mạnh nhất để
tiếp tục thí nghiệm.
3.2.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào
- Tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch: sử dụng kỹ thuật ria chữ T ( T streak) [12]. Sau
đó ủ ở 30
o
C trong 72h.
- Khuẩn lạc sẽ được xác định hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1979). Mô tả các
đặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, đặc tính quang học, màu sắc, mặt cắt ngang,
cấu trúc [6].
- Làm tiêu bản tế bào bằng thuốc nhuộm methyl blue và quan sát bằng kính hiển vi
quang học ở độ phóng đại 40x10.
3.2.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan là
Ca
3
PO
4
.
3.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Thực hiện 54 ống nghiệm chứa 10ml môi trường NBRIP. Hấp khử trùng các ống
nghiệm bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 1atm trong thời gian 20 phút. Cấy giống mỗi chủng
vi sinh vật vào 9 ống nghiệm. Chia các ống nghiệm thành 3 lô. Mỗi lô có 3 ống nghiệm của
mỗi chủng vi sinh vật. Mỗi lô thí nghiệm được phân bố như sau:
- Lô 1: Đặt trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm.
- Lô 2: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 30
o

C.
- Lô 3: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 35
o
C.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làm phản
ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO
4
.
3.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Sử dụng môi trường NBRIP cho thí nghiệm. Đo pH của môi trường bằng máy đo
pH – meter. Điều chỉnh pH môi trường bằng KOH 1N và HCl 1N. Thí nghiệm trên 3 lô:
- Lô 1: Sử dụng môi trường NBRIP không có điều chỉnh pH (pH = 6.8).
- Lô 2: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5.8.
- Lô 3: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7.8.
Mỗi lô thí nghiệm môi trường được phân phối vào 18 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm
chứa 10ml môi trường. Sau đó hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút. Cấy giống vi sinh vật
vào 3 lô. Cấy mỗi giống vi sinh vật vào 3 ống nghiệm của một lô.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làm phản
ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO
4
3-
.
3.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Chuẩn bị 3 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm gồm 12 bình tam giác 250ml. Phân phối
vào mỗi bình tam giác 50ml môi trường NBRIP, đem hấp khử trùng ở 121
o
C, 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào cấc bình tam giác. Mỗi giống cấy vào 2 bình tam giác trên 1 lô. Các lô

được lắc ở các tốc độ khác nhau:
- Lô 1 : Để ở trạng thái tĩnh.
- Lô 2 : Lắc ở tốc độ 75rpm.
- Lô 3 : Lắc ở tốc độ 150 rpm.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO
4
3-
.
3.2.6. Phương pháp nghiên cứu một số thành phần môi trường để nuôi cấy các
chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
3.2.6.1. Phương pháp xác định nguồn carbon thích hợp cho nuôi cấy các chủng vi
sinh vật phân giải phosphate khó tan
Thành phần môi trường dựa trên môi trường NBRIP nhưng có thay đổi. Các nguồn
carbon sử dụng là glucose và saccharose.
Thực hiện 2 lô thí nghiệm.
- Lô 1 : sử dụng nguồn carbon là glucose (10g/l). Môi trường được phân phối vào 18
ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn carbon là saccharose (10g/l). Môi trường được phân phối
vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO
4
.

3.2.6.2. Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho nuôi cấy các chủng vi sinh
vật phân giải phosphate khó tan
Sử dụng môi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa nitơ được thay đổi. Các
nguồn nitơ sử dụng là urê và (NH
4
)
2
SO
4
.
Thực hiện 2 lô thí nghiệm.
- Lô 1 : sử dụng nguồn nitơ là urê ( 0.053g/l). Môi trường được phân phối vào 18
ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn nitơ là (NH
4
)
2
SO
4
(0.1g/l). Môi trường được phân phối vào
18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO
4

3-
.
3.2.7. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính phân giải phosphate khó tan của các
chủng vi sinh vật tuyển chọn được trên nguồn phosphate AlPO
4
Sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan được thay đổi là
AlPO
4
(3.9g/l).
Thực hiện 2 lô thí nghiệm:
- Lô 1 : sử dụng nguồn phosphate khó tan là Ca
3
(PO
4
)
2
. Môi trường được phân phối
vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn phosphate khó tan là AlPO
4
. Môi trường được phân phối vào
18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121
o
C và 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO

4
. So sánh hoạt tính phân giải phosphate khó
tan khi sử dụng AlPO
4
với đối chứng là Ca
3
(PO
4
)
2
ở lô 1.
3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Các số liệu về khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật được
xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan. Các số liệu được
phân tích ANOVA 1 và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0.01.
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD và
nồng độ PO
4
được xử lý trên phần mềm EXCELL 2007 của Microsoft. Các biểu đồ khác
cũng được xử lý trên phần mềm này.
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
Các mẫu đất đỏ bazan của 3 huyện Krông Năng, Cư Kuin, Cư M gar được nghiền
nhỏ rồi pha loãng từ 10
-2
đến 10
-7
. Mỗi độ pha loãng lấy 100 μl trải đều trên đĩa thạch. Kết
quả cho thấy ở độ pha loãng 10
-4

– 10
-5
cho kết quả khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250.
Bảng 4.1. Tổng mật độ vi sinh vật phân giải phosphate khó tan ở 3 mẫu đất: Krông
Năng, Cư Kuin, Cư Mgar
Mẫu Số khuẩn lạc ở các độ pha loãng
10
-4
10
-5
Tổng mật độ vi sinh
vật (CFU/ml)
Krông Năng
Đĩa 1 185 26
Đĩa 2 209 21
2.00 x 10
7
Cư Kuin
Đĩa 1 217 31
Đĩa 2 - 27
2.29 x 10
7

Cư Mgar
Đĩa 1 >250 25
Đĩa 2 248 37
2.58 x 10
7

Kết quả bảng 4.1 cho thấy tổng mật độ vi sinh vật phân giải phosphate trong đất đỏ

bazan ở Cư Mgar đạt cao nhất, gần 26 triệu CFU/ml. Sau đó là ở Cư Kuin, gần 23 triệu
CFU/ml. Còn tổng mật độ vi sinh vật phân giải phosphate trong đất đỏ bazan ở Krông
Năng thấp nhất: 20 triệu CFU/ml. Sự khác biệt này có thể do tỷ lệ lân khó tan và dễ tan
trong đất. Đất chứa nhiều lân khó tan thì số lượng vi sinh vật phân giải lân nhiều hơn đất
chứa nhiều lân dễ tan. Tỷ lệ lân khó tan trong đất lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như: loại đất, điều kiện tự nhiên của từng vùng, quá trình canh tác, cách bón phân. Tuy
nhiên, mật độ vi sinh vật phân giải phosphate khó tan ở mỗi vùng đất khác nhau còn do
nhiều nguyên nhân khác như: bón phân vi sinh có chứa vi sinh vật phân giải phosphate khó
tan, chế độ nước…Do đó, để đưa ra được kết luận chính xác về đất của ba địa phương trên
cần thêm những nghiên cứu khác.
Các khuẩn lạc sẽ được phân loại sơ bộ dựa vào hình thái của khuẩn lạc và hình thái
tế bào của vi sinh vật. Những khuẩn lạc nào có đặc điểm hình thái giống nhau sẽ được xếp
vào một chủng.
Bảng 4.2. Các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan phân lập
Nhóm vi sinh vật Ký hiệu chủng
Vi khuẩn M1, M4, M5, M6, M7, M8, M10,
M11, M12, M13, M16, M17
Xạ khuẩn X2, X3, X9, X14, X15
Theo kết quả bảng 4.2, đã phân lập được 17 chủng vi sinh vật phân giải phosphate
khó tan thuộc hai nhóm vi sinh vật: vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong đó gồm 12 chủng vi khuẩn
và 5 chủng xạ khuẩn.
Để xác định số lượng chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan ở mỗi mẫu đất,
đếm số chủng vi sinh vật trên các đĩa thạch. Kết quả được ghi nhận trong bảng 4.3 như sau:
Bảng 4.3. Số chủng vi sinh vật phân lập được trên các mẫu đất từ Krông Năng, Cư
Mgar và Cư Kuin.
STT Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu chủng
1 Krông Năng M8, M11.
2 Cư Mgar M1, X2, X3, M5, M6, X9, M10, M1, M12,
X14, X15, M16, M17.
3 Cư Kuin M4, M5, M7, M8, M11, M12, M13, X15,

M17.
Mẫu đất ở Krông Năng phân lập được 2 chủng vi sinh vật, Cư Kuin được 9 chủng
còn ở Cư Mgar được 13 chủng. Như vậy, đất rẫy ở Cư Mgar có số lượng các chủng vi sinh
vật phân giải phosphate khó tan nhiều nhất. Chúng tôi giải thích điều này do điều kiện tự
nhiên của từng vùng lúc thu mẫu, loại đất, chế độ phân bón… Để tìm hiểu được nguyên
nhân sự khác biệt về số lượng các chủng vi sinh vật phân lập ở các địa phương cần phải có
những nghiên cứu về đặc điểm đất của từng vùng, quá trình canh các, cách bón phân…
trong điều kiện giới hạn của đề tài không thực hiện được.
4.2 Đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphate
khó tan cao
4.2.1. Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng
độ mg/l của dung dịch PO
4