Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang đã tạo
một môi trường học tập và cơ hội quý báu cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công
nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình dìu dắt, dạy bảo tôi trong suốt khóa học
2007 – 2011.
Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
 TS. Nguyễn Văn Duy, thầy Lê Đình Đức đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn
cho tôi.
 Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,
đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại
phòng thí nghiệm.
 Chị Lưu Thị Thúy học viên cao học và các bạn trong nhóm sinh viên thực
tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của khóa 49, 50 Viện Công nghệ sinh
học và Môi trường, đã giúp đỡ cho tôi. Các bạn lớp 49 SH – những người bạn đồng
hành luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!
Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết
ơn vô hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi.
Nha Trang, tháng 07 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Hoàng Thị Giang

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vi khuẩn lactic 3
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 3
1.1.2. Phân loại lactic 3
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 5
1.1.4. Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6
1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò 8
1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò 8
1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò 9
1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic
trong thực phẩm 14
1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 14
1.3.2.Những nghiên cứu trong nước 16
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Vật liệu 18
2.1.1. Vi sinh vật 18
iii

2.1.2. Nguyên liệu cá giò 19

2.1.3. Hóa chất và môi trường 19
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng 21
2.2.2. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 22
2.2.3. Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic 22
2.2.4. Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi
khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh 24
2.2.5. Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 24
2.2.6. Xác định tổng vi khuẩn lactic 26
Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 27
3.1. Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 31
3.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi 33
3.4. Tổng số vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36
3.5. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48







iv

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Stt Ký hiệu

Nghĩa

1

CFU
Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
2 LAB

Lactic acid bacteria
(Vi khuẩn lactic)
3 MRS
de Man, Rogosa and Shatpe
(Môi trường nuôi cấy LactoBacillus)
4 PCA Plate Count Agar
(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
5 OD Optical Density
(Mật độ quang)
6

TSA Trypton soy agar
(Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
7 TSB Trypton soy broth
(Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số)


v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Thành phần môi trường MRS 20

Bảng 2. Thành phần môi trường TSB 20
Bảng 3. Khả năng sinh trưởng, đường kính vòng kháng khuẩn, hoạt độ riêng của
chủng T8 trên môi trường MRS 29
Bảng 4. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 31
Bảng 5. Sự phát triển tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 33
Bảng 6. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36
Bảng 7. Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic 36
Bảng 8. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 42











vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 37
0
C.
18
Hình 2. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ 37
0
C 19

Hình 3. Cá giò nguyên liệu tươi 19
Hình 4. Mặt ngoài da cá 23
Hình 5. Mặt trong da cá 23
Hình 6. Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE 23
Hình 7. Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE 24
Hình 8. Mẫu 3: Mẫu đối chứng 24
Hình 9. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 -18
giờ nuôi 27
Hình 10. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 15 -
19 giờ nuôi 28
Hình 11. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 -
24 giờ nuôi 28
Hình 12. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 -
27 giờ nuôi 29
Hình 13. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8
30
Hình 14. Vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS, nuôi ở nhiệt độ 37
0
C sau 48
giờ nuôi cấy 31
Hình 15. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 32
Hình 16. Sự phát triển tổng vi sinh vật hiếu khí trên da cá giò 33
Hình 17. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau 48 giờ 34
Hình 18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36
Hình 19. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở mẫu 1 37
Hình 20. Khả năng kháng Bacillus của vi khuẩn lactic T8 theo thời gian bảo quản 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày 37
vii

Hình 21. Vi khuẩn lactic T8 sau 3 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng

dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 39
Hình 22. Vi khuẩn lactic T8 sau 5 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng
dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 40
Hình 23. Vi khuẩn lactic T8 sau 7 ngày bảo quản ở mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 40
Hình 24. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41
Hình 25. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 0 ngày 43
Hình 26. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 3 ngày 44
Hình 27. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày 45
Hình 28. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày và 7 ngày 46






1

LỜI MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản thủy sản trước kia vốn chỉ góp phần nhỏ bé trong
tổng sản lượng thủy sản toàn cầu, tuy nhiên từ những năm 1950 đến năm 2008 đã
tăng 50 lần và hiện nay chiếm gần 50% trong tổng sản lượng sản xuất trên toàn
thế giới. Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng: năm 2004
đạt 1,4 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản, năm 2010 sản lượng thủy
sản đạt 2706,8 nghìn tấn bằng 105,4% so với cùng kỳ năm 2009 và 102,1% so
với kế hoạch năm 2010. Kỳ vọng năm 2011, theo kế hoạch nghành thủy sản phấn

đấu mức tăng trưởng chung là 7% so với năm 2010. Tổng sản lượng năm 2011
phấn đấu đạt khoảng 5,3 triệu tấn, trong đó khai thác là 2,3 triệu tấn và nuôi
trồng là 3 triệu tấn. Mặc dù, nghành nuôi trồng đạt được nhiều kết quả nhưng nó
đang đối mặt với những thách thức về môi trường nuôi, dịch bệnh, công nghệ sau
thu hoạch…
Nguyên liệu thủy sản nói chung là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu
không được bảo quản hợp lý. Hiện nay, các loại nguyên liệu sau đánh bắt và thu
hoạch của người dân chủ yếu bảo quản bằng phương pháp ướp đá lạnh. Ngoài ra,
để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại
như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinh để bảo quản. Những chất bảo quản
này nếu sử dụng không hợp lý sẽ gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm, ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng. Do đó, việc sử dụng hóa chất
để bảo quản nguyên liệu ít được sử dụng và một số chất bảo quản độc hại bị cấm.
Yêu cầu đặt ra phải tìm được phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn và kinh
tế. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu thay thế những chất
bảo quản hóa học bằng phương pháp sinh học an toàn hơn cho người sử dụng và
người tiêu dùng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh
vật mang những đặc tính: ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật gây hư
hỏng, gây thối nguyên liệu, an toàn cho người tiêu dùng. Một trong những nhóm
vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic được công
nhận là an toàn để sử dụng, nó được sử dụng trong quá trình bảo quản như lên


2

men dưa chua, nem chua, sữa chua…vì trong quá trình sống vi khuẩn lactic ngoài
việc sinh bacteriocin còn sinh acid lactic là tác nhân ức chế nhiều vi sinh vật.
Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King
fish) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng
bè ở các vùng biển tại các địa phương như: Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh,

Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Kiên Giang. Hiện nay, cá giò được tiêu
thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi
hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá
giò ươn lớn có thể tới 60.000đ/kg. Do đó việc nghiên cứu bảo quản cá giò có ý
nghĩa kinh tế cao.
Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các
điều kiện bên ngoài, môi trường nuôi cấy. Đa số mỗi sinh vật có môi trường nuôi
cấy đặc hiệu, MRS là môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic nói chung, ở đó vi
khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển tốt nhưng khi ứng dụng vi khuẩn này bảo
quản nguyên liệu thủy sản như cá giò thì sao?
Để trả lời cho câu hỏi đó chúng tôi tiến hành đề tài “Đặc điểm sinh trưởng của vi
khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu
tươi”.
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên cá giò nguyên liệu tươi.




3

Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào

tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp
chung vào họ Lactobacteriaccae. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác
nhau như: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn. Cầu khuẩn xếp các giống Streptococcus và
Leuconostoc, còn trực khuẩn thành một giống Lactobacillus. MRS là môi trường để
phân lập và nuôi cấy chủng lactic. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong
bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, đôi khi khuẩn lạc có
màu trắng đục, tròn lồi. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí, vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu
về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát
triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần
các loại vitamin như: Lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, folic acid, và các
amino acid… Các vi khuẩn lactic lên men được đường monno và disaccharide
nhưng không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác, ngoại trừ
L.delbrueckiin đồng hóa được tinh bột. Đa số vi khuẩn lên men lactic dị hình có
khả năng sử dụng pentose và acid citric, một số có hoạt tính protease (Lương
Đức Phẩm, 2002).
1.1.2. Phân loại lactic
Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta
chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic
đồng hình.
 Vi khuẩn lactic lên men đồng hình
Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa
enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường
chúng sinh ra chủ yếu là acid lactic. Vi khuẩn lactic lên men đồng hình như:
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casein,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum


4

Một số vi khuẩn lactic điển hình:
Streptococcus lactic - cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết
song đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống này ưa ấm, phát triển tốt ở 30 - 35
0
C, làm
đông tụ sữa sau 10 - 12 giờ. Trong môi trường nó tích tụ được 0,8 - 1% acid.
Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 10
0
C, tối đa là 40 - 45
0
C. Một số chủng tạo
thành bacteriocin ở dạng nizin.
Steptococcus lactic - liên cầu khuẩn lacitic được sử dụng rộng rãi trong
chế biến các sản phẩn sữa như sữa chua, crem - bơ chua, phomat Khi đông tụ
sữa các cục vón chặt và nhẵn được tạo thành.
Streptococcus cremoris - tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và
tạo acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25
0
C, tối thiểu
là 10
0
C, tối đa là 36 - 38
0
C. Khi sử dụng phải phối trộn với Str. lactic. Một số
chủng thuộc giống Diplococus sinh bacterioxin ở dạng diplocoxin (Lương Đức
Phẩm, 2002).
 Vi khuẩn lactic lên men dị hình
Vi khuẩn lactic lên men dị hình là vi khuẩn khi lên men các loại đường
chúng không chỉ tạo ra acid lactic mà còn tạo ra các sản phẩm khác như acid
acetic, acid propionic, ethanol Vi khẩn lactic dị hình như: Lactobacillus

pasterianus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopessici, Streptococcus
cumoris, Streptococcus lactic
Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình điển hình:
Lactobacillus brevis (tên cũ là L. brassica fermeentati) tìm thấy chủ yếu
trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột. Vì vậy nó được gọi là trực khuẩn cải
bắp. Trong lên men, ngoài acid lactic nó còn tạo ra acid axetic, rượu etylic và
CO
2
, nó còn tạo cho sản phẩm có hương thơm dễ chụi.
Lactobacillus lycopersici - trực khuẩn sinh hơi, đứng riêng lẻ hoặc liên kết
thành chuỗi, gây hư hỏng cà chua (thối nhũn cuống) cũng như cà chua đóng hộp,
nước cà chua thanh trùng chưa triệt để. Ngày nay, giống này được coi như là biến
chủng của L.brevis.


5

Streptococcus lactic thuộc chuỗi cầu khuẩn Gram (+), nhiệt độ phát triển
từ 10 - 45
0
C, có khả năng chụi được nồng độ muối 4%. Khi lên men đường như
maltose, lactose, xylose chúng tạo ra acid lactic, acid acetic, CO
2
và diacetyl.
Chúng không có khả năng lên men insulin, glycerol, sorbitol, raffinose.
Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ
sinh trưởng 10 - 45
0
C. Chúng có khả năng chụi được nồng độ muối 5% và có khả
năng lên men đường glucose, maltose, trehalose và silicin.

1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
 Nguồn cacbon
Vi sinh vật là giới sinh vật duy nhất có khả năng đồng hóa được nhiều
nguồn cacbon khác nhau. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi sinh vật
không phải là giống nhau ở nhiều nguồn cacbon khác nhau: có những nguồn
cacbon dễ sử dụng và những nguồn cacbon khó sử dụng, thậm chí phải huy động
nhiều vi sinh vật cùng tham gia phân hủy từ từ. Thông thường vi sinh vật trong
tự nhiên hay trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo sẽ tiến hành phân hủy nguồn
cacbon có cấu tạo đơn giản có mức độ oxy hóa mạnh sau đó mới phân hủy nguồn
cacbon phức tạp và có mức độ oxy hóa thấp. Nhìn chung vi sinh vật dễ hấp thu
cacbon từ hydratcacbon, trong đó glucose là chất được đa số vi sinh vật sử dụng.
Đối với vi khuẩn lactic thì đường mono và disaccharide là nguồn cacbon
tốt nhất, còn các polysaccharide hầu như không thể lên men được. Tốc độ lên
men của các loại đường khác nhau là khác nhau nhưng khi nhân giống ta dùng
một loại đường cố định thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau
chúng phát triển hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này.
 Nguồn nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng
nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật thường ở hai dạng:
nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nitơ vô cơ. Trong đó nguồn nitơ được sử dụng chủ
yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là protein như: Cao thịt, cao nấm men, trypton,


6

dịch thủy phân casein từ sữa… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử
dụng nhiều và có hiệu quả nhất trong phòng thí nghiệm.
 Vitamin

Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Vitamin B6 là vitamin rất quan trọng
trong sự sinh tổng hợp các amino acid ở vi khuẩn lactic.
 Muối khoáng
Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong qua trình trao đổi chất ở vi
sinh vật. Các chất khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là
những chất khoáng ở dạng hợp chất, đơn chất, có thể ở dạng vô cơ hay hợp chất
hữu cơ. Một số muối khoáng được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật là:
K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, CaSO
4
,…
Trong các loại muối khoáng đó photpho là loại muối quan trọng nhất mà
các vi khuẩn lactic cần. Số lượng photpho trong môi trường nuôi cấy có ảnh
hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật. Nếu hàm lượng quá cao vi sinh
vật khó phát triển, nếu quá ít sẽ không đủ cho quá trình trao đổi chất và như vậy
sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sự đồng hóa hydratcacbon.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên
men và cho sinh trưởng vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và
loại ưa ấm. Loại ưa nhiệt bao gồm: L. bulgaricus, L. thermophilus, L.
delbrueckii…phát triển tốt ở 45 - 60
0
C. Loại ưa ấm gồm: L. causasicus, L. lactic,
L. acidophilus…phát triển tốt ở 37 - 45
0
C và L. brevis, L. buchner và
L.pastorianus phát triển tốt ở 28 - 32
0
C.
1.1.4. Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh
vật khá phổ biến trong điều trị bệnh cho người cũng như động vật. Nguyên nhân
là do con người lạm dụng thuốc kháng sinh để điều trị một số bệnh cho vật nuôi
cũng như bảo quản thực phẩm. Để hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh trong thực


7

phẩm và chăn nuôi người ta đã nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ vi
sinh vật để ức chế lại vi sinh vật gần gũi với chúng.
Bacteriocin có bản chất là những peptide hoặc là những protein có hoạt tính
kháng khuẩn và là sản phẩm của nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau (Antonio Gálvez
và cs, 2007). Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra các loài bacteriocin nào thì có khả năng
chống lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây phản ứng dị ứng cho con
người và các vấn đề về sức khỏe, phân hủy nhanh bởi protease, lipase. Đa số
bacteriocin có tính kháng nguyên cao nhưng có phổ ức chế hẹp, hoạt động tốt
dưới những khoảng pH, nhiệt độ nhất định. Ví dụ như ST28MS và ST26MS được

sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút
tại 100
0
C hay 20 phút ở 121
0
C (Torodov và Dicks, 2005). Hầu hết bacteriocin sinh
tổng hợp từ vi khuẩn Gram (-), có hoạt tính ức chế các loại cùng họ hàng tuy nhiên
một số loài vi khuẩn Gram (-) bị ức chế bởi bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn
Gram (+). Những vi khuẩn Gram (+) sinh bacteriocin có khả năng ức chế vi
khuẩn Gram (-) như: Lactobacillus, Bacillus crecus, Streptococci,
Staphylococci…Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram (+) có hoạt
tính ức chế các loại vi khuẩn Gram (+). Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi
sinh vật khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi
sinh vật, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công
vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều chủng sinh bacteriocin như Vibrio,
Bacillus…Trong đó lactic là nhóm vi khuẩn được quan tâm nhiều do chúng sinh
bacteriocin có phổ ức chế rộng hơn các nhóm vi khuẩn khác, đồng thời nó được
xem là nhóm vi khuẩn an toàn cho con người. Ngày nay, người ta ứng dụng
bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong nhiều lĩnh vực khác nhau: công nghiệp, y
dược, thức ăn động vật, chế biến thực phẩm…
Bacteriocin của nhóm vi khuẩn lactic sử dụng trong quy trình chế biến
thực phẩm để rửa sạch rau quả trước khi dùng, nó tác động và làm giảm lượng vi
khuẩn gây bệnh, gây thối rửa (Allende và cs, 2007). Bacteriocin được thêm vào
trong thành phần của thực phẩm, lúc này chúng sẽ chống lại sự hư hỏng thực


8

phẩm và vi sinh vật gây bệnh (Cleveland và cs, 2001). Trong việc tìm ra các loại

thuốc cho con người, bacteriocin có thể sử dụng để chống các loài gây bệnh
nghiêm trọng cho người, ví dụ như MRSA và VRE (Lawton và cs, 2007). Trong
sản xuất thuốc thú y chứa bacteriocin, nó ức chế sự phát triển tác nhân gây bệnh
viêm vú ở bò (Ryan và cs, 1999)…Trong những năm gần đây, bacteriocin được
chý ý hơn trong công nghệ ứng dụng bảo quản thực phẩm. Nó thay thế chất bảo
quản hóa học và chất kháng sinh đồng thời giữ cho thực phẩm ở trạng thái tự
nhiên, tươi ngon và đặc biệt là không độc với con người. Ngoài bacteriocin có
tính thương mại như nisin và pediocin PA-1/AcH thì sử dụng các bacteriocin
khác từ nhóm vi khuẩn lactic (lactisin 3147, enterocin AS-48 hoặc variancin)
cũng có tác dụng bảo vệ thực phẩm tránh khỏi sự hư hỏng. Chẳng hạn
bacteriocin bảo quản thực phẩm kháng chọn lọc đối với Listeria monocytogenes
mà không ảnh hưởng đến vi sinh vật khác. Để nâng cao hiệu quả của quá trình
bảo quản nguyên liệu người ta kết hợp bổ sung bacteriocin với phương pháp xử
lý vật lý áp suất cao hoặc xung điện từ trường, bacteriocin kết hợp áp suất thủy
tĩnh cao, bacteriocin với phương pháp bảo quản lạnh…Hiệu quả tác động của
bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi nhân tố môi trường như pH, nhiệt độ, cấu
trúc và thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật của thực phẩm. Sự phát
triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh vật phân tử, đồng thời những nghiên cứu về
sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể tiết lộ các nguồn sinh bacteriocin
mới (Gálvez và cs, 2007).
1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò
1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò
Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King
fish) phân bố ở vùng biển nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nước ấm của biển ôn
đới. Trong tự nhiên, cá giò sống ở vùng nước mặn hoặc nước lợ ven biển, rạn
san hô cho đến vùng biển khơi. Cá giò thuộc loại cá dữ, ăn thịt động vật, thức ăn
tự nhiên gồm cua, tôm, ốc và các loại cá con. Tốc độ sinh trưởng của cá nhanh,
có thể đạt cỡ 4 - 6 kg sau một năm nuôi. Cá giò thành thục lần đầu tiên sau 2
năm tuổi, mùa sinh sản của cá giò ở miền Bắc từ tháng 4 đến tháng 7 hằng năm.

9

Quy trình sản xuất cá giò tương đối ổn định và được đơn giản hóa để áp
dụng rộng rãi, kể cả các cơ sở không có điều kiện đầu tư. Kỹ thuật này bao gồm
sinh sản nhân tạo đại trà bằng cách cho đẻ tự nhiên, cá bố mẹ được nuôi vỗ,
ương nuôi ấu trùng, ương cá giống trên bể, ao và lồng gần bờ, nuôi cá thương
phẩm trong lồng ngoài khơi. Cá giò có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ
biến trong lồng bè ở các vùng biển tại các địa phương như Hải Phòng, Nghệ An,
Quảng Ninh, Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Vũng Tàu, Kiên Giang.
Hiện nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra
nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh
lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000 đ/kg. Do đó việc nghiên
cứu phòng và chữa bệnh cũng như bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao.
1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò
Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò rất dễ bị biến chất và hư hỏng.
Nguyên nhân gây hư hỏng do tự bản thân trong tế bào có sẵn enzym thúc đẩy quá
trình oxy hóa xảy ra, do vi sinh vật và các yếu tố bên ngoài (như nhiệt độ và độ ẩm).
Chính vì những lẽ đó cần có những phương pháp xử lý, bảo quản để giữ được chất
lượng, hạn chế tổn hao dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm cho nguyên liệu
thủy sản cũng như cá giò.
Những năm gần đây, xuất khẩu thủy sản Việt Nam có những bước tiến nhảy
vọt. Năm 2002, lần đâu tiên kim ngạch xuất khẩu vượt qua con số 2 tỷ đô la. Chất
lượng hàng thủy sản tiêu thụ nội địa cũng không ngừng được cải thiện, đáp ứng yêu
cầu ngày một cao của nhân dân. Đạt được những thành công đó, một trong những
yếu tố quan trọng là nhờ những người làm công việc khai thác và nuôi trồng thủy
sản đã bảo quản tốt nguyên liệu cho khâu chế biến, tạo thành một dây chuyền đồng
bộ, khép kín, giữ cho sản phẩm luôn được tươi tốt.
Tùy từng điều kiện cụ thể của từng ngư dân, doanh nghiệp sản xuất thủy sản
mà có phương pháp bảo quản cá và nguyên liệu thủy sản khác nhau: bảo quản cá ở

nhệt độ thấp, hóa chất bảo quản, chất kháng sinh, xung điện trường…
a. Bảo quản cá nguyên liệu ở nhiệt độ thấp


10

Dựa vào nguyên lý chung là khi nhiệt độ hạ thấp thì enzym và vi sinh vật
trong nguyên liệu bị giảm hoạt động hoặc có thể bị đình chỉ sự sống, như vậy
nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian. Trong phạm vi nhiệt độ bình
thường, cứ nhiệt độ hạ xuống 10
0
C thì phản ứng sinh hóa giảm xuống 1/2 đến 1/3,
khi nhiệt độ hạ xuống thấp sẽ làm ức chế hoạt động về sinh lý của vi sinh vật cũng
như enzym. Ví dụ như nhiệt độ nhỏ hơn 10
0
C vi khuẩn gây thối rữa và vi khuẩn gây
bệnh bị kìm chế phần nào, ở 0
0
C thì tỷ lệ phát triển của chủng rất thấp, -5
0
C đến -
10
0
C thì hầu như không phát triển được. Nhưng vẫn có loài vi khuẩn khi nhiệt độ hạ
xuống -15
0
C vẫn phát triển được: Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium…
Giữ tươi ở nhiệt độ thấp có hai phương pháp là ướp lạnh và ướp đông.
 Phương pháp ướp lạnh sơ bộ
Ướp lạnh sơ bộ được ngư dân sử dụng phổ biến để bảo quản nguyên liệu

mới đánh bắt. Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm nhưng giữ tươi trong thời gian
ngắn. Phương pháp ướp lạnh là hạ nhiệt độ xuống 0
0
C hoặc -1
0
C có thể sử dụng kho
lạnh, nước biển lạnh hoặc nước đá để bảo quản. Trong đó bảo quản bằng nước đá là
phổ biến nhất, người ta sử dụng nước đá vảy hoặc nước đá vụn kết hợp với muối ăn
để tăng khả năng làm lạnh. Tỷ lệ muối ăn dùng 15 - 20 % so với lượng nước đá và
lượng nước đá là 100 - 128% so với lượng cá như vậy có thể làm cho nhiệt độ hạ
xuống -8 ÷ -10
0
C. Tiến hành bảo quản bằng cách cứ một lớp muối đá rồi một lớp cá
ướp cho vào thùng gỗ, dung tích thùng chứa 25 - 30 kg và chiều cao lớp nguyên liệu
không nên quá 30 cm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006).
 Phương pháp làm lạnh đông
Phương pháp làm lạnh đông là hạ thấp nhiệt độ của nguyên liệu xuống -8
0
C.
Như vậy một lượng nước lớn ở trong nguyên liệu sẽ bị đông kết lại làm ngừng đến
mức tối đa hoặc đình chỉ hoàn toàn hoạt động của enzym nội tại, vi sinh vật sẵn có
và vi sinh nhật xâm nhập vào gây thối rữa. Hiện nay, đây là phương pháp giữ tươi
nguyên liệu tốt nhất, đảm bảo được tính chất, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của
nguyên liệu. Mặc dù vậy trong quá trình bảo quản chất lượng của nguyên liệu cũng
có sự biến đổi như protid bị đông đặc biến tính, chất béo bị thủy phân hoặc bị oxy


11

hóa, đặc biệt là các biến đổi về vật lý và cấu trúc của nguyên liệu. Nguyên liệu làm

lạnh đông trước khi đưa vào chế biến hoặc tiêu thụ phải được tiến hành giải đông.
Tùy vào mục đích và thời gian bảo quản mà người ta chọn nhiệt độ bảo
quản khác nhau có thể -18
0
C, -25
0
C…Phương pháp này chỉ áp dụng với các nhà
máy chế biến với quy mô lớn, sử dụng các kho, tủ cấp đông. Để tăng hiệu quả bảo
quản trước khi cấp đông nguyên liệu có thể được lấy hết ruột rửa sạch nội tạng.
b. Bảo quản cá nguyên liệu bằng hóa chất
Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo
quản nguyên liệu rất có hiệu quả. Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với
nhiệt độ thấp thì giữ được tươi hơn.
Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không
có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho
nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng
mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản.
Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: muối vô cơ,
acid chất hữu cơ.
Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khac nhau:
 Muối vô cơ
Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite
(Ca(OCl)
2
), natri nitrit (NaNO
2
), natri chlorua (NaCl) bằng cách chế thành nước đá
hoặc pha thành dung dịch. Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá
ướp, còn khi pha thành dung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2 - 5 phút
sau đó mang bảo quản lạnh.

 Loại acid
Các loại acid thường dùng để bảo quản nguyên liệu thủy sản là: Acib boric,
acid chlohytric, acid acetic, acid lactic…
Dùng acid để giữ tươi nguyên liệu có 3 cách: thứ nhất là pha acid thành
dung dịch có nồng độ thích hợp rồi đem phun hoặc ngâm lên nguyên liệu, cá sau khi
được ngâm hoặc phun xong trong thời gian ngắn thì đem bảo quản lạnh hoặc bằng
muối ăn. Cách thứ hai là chế thành nước đá có acid để bảo quản. Cách thứ ba là


12

dùng hỗn hợp acid với chất hóa học phòng thối khác để nâng cao hiệu quả bảo
quản. Ngoài ra, người ta dùng rơm, cỏ khô, mùn cưa… được tẩm acid để bảo quản.
 Loại chất hữu cơ
Nói chung các chất hữu cơ thường được sử dụng hạn chế trong bảo quản
nguyên liệu tùy theo quy định của các nước.
Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối
natri của nó, formaldehyt và sulfathiazol…và chúng được sử dụng dưới dạng chế
thành nước đá hoặc pha thành dung dịch.
c. Bảo quản bằng cách dùng thuốc chống oxy hóa
Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay
sinh ra sản phẩm ôi khét, ôi thối nguyên nhân là do hiện tượng oxy hóa, đốt cháy
mỡ sinh ra. Để ngăn chặn hiện tượng đó người ta tiến hành bảo quản lạnh kết hợp
với chất chống oxy hóa.
Các chất chống oxy hóa được dùng như: Acid citric, acid tactric, tocopherol
(vitamin E), butyl hydroxyanizol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT)…Chúng
không có khả năng phục hồi lại các chất béo đã hỏng mà có tác dụng chống sự oxy
hóa hoặc để chống oxy.
Chất chống oxy hóa được sử dụng dưới dạng dung dịch, nước đá (Nguyễn Trọng
Cẩn và cs, 2006).

d. Bảo quản bằng phương pháp sinh học kết hợp bảo quản lạnh
Sử dụng phương pháp sinh học để làm chậm thời điểm bắt đầu tê cứng hoặc
kéo dài quá trình tê cứng của cá để giữ cá được tươi, có nghĩa là làm chậm sự phân
giải ATP. Muốn làm giảm sự phân giải ATP trong tổ chức cơ thịt cá thì tìm mọi
cách làm cho cá chết ngay, không để cho cá giãy giụa hoạt động. Có nhiều cách làm
cho cá ngừng hoạt động như thả cá vào nước 2
0
C, dùng điện trường, các chất gây
mê cho cá ngủ trong một thời gian nhất định. Cá sau khi chết phải thả ngay vào
nước biển hoặc nước muối pha loãng 1 - 2 giờ để rửa sạch máu, nhiệt độ nước rửa
phải thấp hơn nhiệt độ cá sống 2 - 3
0
C, không được thấp quá sẽ làm cơ thịt co rút lại
và mau tê cứng. Cá sau khi rửa xong vớt ra bảo quản 10
0
C. Khi vận chuyển cá đi
nơi khác dùng nước đá để bảo quản. Cá được xếp trong bao polyethylene và xếp


13

thành từng con vào thùng gỗ, nước đá chỉ phủ phần đầu không ướp nước đá xuống
thân để phòng hạ thấp nhiệt độ. Trong quá trình vận chuyển tránh mọi va chạm, giữ
cá được yên tĩnh (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006).
e. Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh
Truớc đây chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo
quản nguyên liệu. Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh
có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên
cứu và sử dụng thận trọng hơn. Chất kháng sinh là chất hữu cơ do vi sinh vật hoặc
động thực vật cao đẳng sinh ra hoặc dùng phương pháp tổng hợp như

chloromyxetin.
Aureomycin và teramycin là chất kháng sinh được sử dụng để bảo quản hải
sản nhiều nhất, ngoài ra người ta nghiên cứu sử dụng các chất như penicillin, nizin,
tylozin…
Chất kháng sinh được sử dụng trong bảo quản bởi vì nó làm cho một vài cơ năng
nào đó trong vi sinh vật không hoạt động được và làm rối loạn sự trao đổi chất, do
đó làm vi sinh vật bị yếu hoặc bị chết. Tác dụng đó của chất kháng sinh rất mạnh
cho nên chỉ dùng liều nhỏ đã có hiệu lực bảo quản.
Có 3 phương pháp sử dụng chất kháng sinh: ngâm, phun và chế thành nước
đá.
Phương pháp ngâm: nguyên liệu đem rửa sạch ngâm vào dung dịch chất
kháng sinh từ 5 - 10 phút, sau đó đem bảo quản, nồng độ kháng sinh thường dùng là
5 - 20ppm, bảo quản cá thường dùng chất kháng sinh có nồng độ 10ppm.
Phương pháp phun: nguyên liệu rửa sạch sau đó dùng dung dịch khánh sinh
có nồng độ hơi cao để phun đều trên nguyên liệu. Phương pháp này thích hợp với
các loại cá to.
Phương pháp chế thành nước đá: dùng chất kháng sinh hòa thành dung dịch
sau đó làm lạnh cho đóng băng rồi đem nghiền nhỏ ra để bảo quản nguyên liệu, khi
bảo quản chất kháng sinh sẽ tan ra ngấm vào nguyên liệu. Dùng dung dịch chất
kháng sinh để chế thành nước đá sẽ làm chất kháng sinh phân bố không đều trong


14

nước đá, nước đá có thể làm mất hoạt tính chất kháng sinh hoặc gây kết tủa
(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006).
f. Bảo quản cá nguyên liệu bằng dịch bacteriocin
Bacteriocin là những đoạn peptid hoặc protein có hoạt tính kháng khuẩn
được sản xuất trừ nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Bacteriocin được ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm và nó được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để

giảm chất bảo quản hóa học đưa vào thực phẩm và nó tốt hơn phương pháp xử lý
nhiệt. Bảo quản bằng bacteriocin thì thực phẩm giữ được các tính chất đặc trưng về
cảm quan và dinh dưỡng. Đây là phương pháp bảo quản tự nhiên, nó có thể đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về sản phẩm ăn liền tiện lợi, an toàn,
tươi, sạch của chế biến thực phẩm và phát triển các sản phẩm mới. Ngoài các sản
phẩm thương mại sẵn có như nisin, pediocin PA-1/AcH còn có các loại khác như
lacticin 3147, enterocin AS-48 hoặc variacin.
Bacteriocin được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu cũng như trong thực
phẩm dưới các hình thức cho vào phụ gia, làm chất độn, nuôi cấy vi sinh vật bổ
sung vào nguồn nguyên liệu để nó tự sản sinh bacteriocin, cũng có thể tạo các
bacteriocin cố định trên bao bì bảo quản (Antonio Gá levez* và cs, 2007).
Trong những năm gần đây, ứng dụng của bacteriocin như là một phần của
công nghệ xử lý. Việc kết hợp giữa bacteriocin với xử lý nhiệt hay xung điện
trường, bảo quản lạnh, điều chỉnh hỗn hợp khí…tốt hơn khi dùng bacteriocin để bảo
quản. Các phương pháp này ứng dụng rộng rãi ngoài nước trong bảo quản thực
phẩm nhưng ở Việt Nam còn hạn chế.
Ngoài những phương pháp bảo quản trên còn sử dụng phương pháp điều
chỉnh hỗn hợp khí, bức xạ điện ly nhưng nó ít được sử dụng trong bảo quản nguyên
liệu thủy sản.
1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn
lactic trong thực phẩm
1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có tính chất
ưu việt để dùng cho bảo quản thực phẩm như an toàn với người sử dụng, không


15

độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi protease trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh
hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người, hoạt động trong khoảng pH rộng,

chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên
màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh
và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác
di truyền (Gálvez và cs, 2007).
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt
tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid
hữu cơ và sinh ra bacteriocin kháng khuẩn và kháng nấm (De Vuyst và Leroy
F, 2007).
Jinlan Zhang và cộng sự (2007), đã phân lập được chủng Lactobacillus
pentosus 31-1 từ Xuan Wei Ham sản phẩm lên men truyền thống của Trung
Quốc sinh bacteriocin pentocin 31-1 ứng dụng trong bảo quản thịt heo ở 4
0
C.
Kết quả nghiên cứu sử dụng pentocin 31-1 ở ba nồng độ 40 AU/ml, 75 AU/ml và
80 AU/ml cho thấy ở nồng độ 80 AU/ml là tốt nhất. Thịt được bảo quản bằng
bacteriocin có màu sắc, mùi, trạng thái tốt hơn thịt chỉ được bảo quản lạnh. Cùng
năm 2007, Elisabetta Tome và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng bacteriocin từ vi
khuẩn lactic trong bảo quản cá hồi hun khói bao gói hút chân không để lạnh.
Người ta đã nghiên cứu được các chủng lactic sinh bacteriocin: LAB (lactic acid
bacteria) ETO5, ETO6, ET30, ET34. Những chủng này phải được sàng lọc bằng
cách thử hoạt tính decarboxylase tyrosine và histidine.
Năm 2009, Gao J và cộng sự phân lập được các chủng Lactobacillus
subsp. và L. paracasei. Paracin 1.7 là bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn L.
paracasei HD 1.7, bền với nhiệt độ và pH acid nhưng nhạy cảm với enzym thủy
phân protein. Khi bảo quản ở 4
0
C sau 4 tháng hoạt động ức chế của paracin 1.7
chỉ giảm 4,19 %. Paracin 1.7 có phổ ức chế rộng kháng lại Bacillus, Escherichia,
Staphylococcus, Microccus, Pseudomonas, Salmonella, Sacharomyces,
Enterobacter.

Về mặt công nghệ, bacteriocin đã và đang được sử dụng kết hợp với hàng
loạt kỹ thuật khác để tăng cường khả năng bất hoạt vi sinh vật đích. Người ta có


16

thể sử dụng kết hợp bacteriocin với các chất kháng khuẩn khác, xử lý nhiệt độ,
áp lực thủy tĩnh cao, xung điện…( Gálvez và cs, 2007).
Gao và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sản xuất bacteriocin từ
Lactobacillus sake C2 được phân lập từ cải bắp lên men. Kết quả sakacin C2 phổ
kháng khuẩn rộng và hoạt động ổn định ở nhiệt độ cao 121
0
C , pH ổn định trong
khoảng 3 - 8, nhạy cảm với protease nhưng không nhạy cảm với lipase, α -
amylase và β - amylase.
1.3.2. Những nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên những nghiên cứu về ứng
dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm , thủy sản còn nhiều hạn chế.
Lactic là chủng vi khuẩn được sử dụng đầu tiên để làm chế phẩm sinh học
cho người và động vật giúp kích thích khả năng tiêu hóa. Tuy nhiên trong chế phẩm
xử lý nước nuôi trồng thủy sản, vi sinh vật đóng vai trò hoàn toàn khác là cạnh
tranh và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh cho động vật nuôi. Hai
chủng vi khuẩn Bacillus sp HY1 và vi khuẩn lactic CC4K được phân lập từ nước
nuôi tôm và nước dưa đều có khả năng ức chế tốt các vi khuẩn Vibrio
paraheamolyticus HH1, V. furnisii VT14 – 1, V. Harvey NC5 – 1 và V. vulnificus
HH2. Trong đó chủng CC4K chỉ có khả năng kháng một số vi sinh vật nhân sơ là
S. aureus, S. luted, B. stutilis không kháng được vi sinh vật nhân chuẩn (Đặng
Phương Nga và cs, 2007). Năm 2006, Đặng Phương Nga và cộng sự nghiên cứu khả
năng đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm của một số chủng vi sinh vật lựa

chọn. Kết quả chọn được ba chủng: Bacillus sp HY1, Pseudomonas aeruginosa
HL1 và Lactobacillus buchneri DC4 có khả năng kháng Vibrio.
Trong những năm 2004, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã khảo sát đa
dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn
lactic đường tiêu hóa đường ruột (đề tài khoa học cơ bản 2004 - 2005, mã số
620504). Nhóm tác giả Đại học Quốc Gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh
bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum L24, kết quả thấy vi khuẩn này
vừa có khả năng sinh acid lactic vừa có khả năng sinh bacteriocin (Nguyễn Thị


17

Hoài Hà và cs, 2002). Bacteriocin đã được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel và điện di
trên gel SDS - PAGE có trọng lượng phân tử khoảng 10 - 30kDa.
Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản
xuất bacteriocin cố khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm
như E.coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác (Lê Thị Hồng Tuyết và cs,
2004). Nghiên cứu này còn cho thấy bacteriocin bắt dầu được sản xuất ở
L.acidophilus từ giờ thứ 12, ở nhiệt độ 30 - 37
0
C với pH 5 - 7 và vi khuẩn có thể
sử dụng các loại đường như manitol, maltose và glucose.
Nhóm nghiên cứu ở trường Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã
thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố
định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi
sơ chế. Kết quả cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên
BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn
đảm bảo về mặt thời gian lên men, khối lượng và số lượng bacteriocin so với đối
chứng. Khi sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml để bảo
quản thịt tươi sơ chế, tối thiểu cho thấy thời gian bảo quản đến 3 ngày mầ vẫn đảm

bảo chất lượng theo TCVN 7046:2002.
Trong việc nghiên cứu quy trình muối chua nha đam (Lê Thanh Mai, 2002)
tiến hành thí nghiệm dựa trên hai phương pháp: lên men có bổ sung giống
Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống. Kết quả cho thấy muối
chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn.
Ngoài ra còn rất nhiều nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào thực
phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định về mặt cảm quan hơn là thực phẩm lên
men truyền thống. Tuy nhiên những nghiên cứu trực tiếp về vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin trong bảo quản thủy sản, thực phẩm còn hạn chế.



18

Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vi sinh vật
 Vi khuẩn lactic

Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ
37
0
C
Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin phân lập từ nước dưa cải được lấy
từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,
Trường Đại học Nha Trang.
Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin được nuôi trên môi trường lỏng
MRS (bảng 1), trong tủ ấm 37
o

C. Chúng tôi đã bảo quản giống lactic trên môi
trường thạch nghiêng MRS và trong glycerol. Bảo quản vi khuẩn lactic trên môi
trường thạch nghiêng MRS, các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6
o
C. Định kỳ cấy
truyền giống, 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần. Bảo quản giống trong glycerol 30%
với tỷ lệ thể tích giữa dịch giống / glycerol là 70 µl / 30 µl, các ống được giữ ở -
70
0
C.
 Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus phân lập từ mẫu tôm sú được lấy từ bộ sưu tập chủng vi
sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang.
Sau khi có chủng gốc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus trên
môi trường lỏng TSB (bảng 2) ở nhiệt độ 28 - 30
0
C, lắc 200 vòng/phút. Bảo quản