Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau
đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi đến thầy: TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn
Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám
đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Bác sỹ
Lê Đình Hải và KS. Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân
viện Thú y miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình
thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cảm ơn ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và
các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên
cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Bộ
môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại
học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cùng toàn thể các cô
chú, anh chị trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng và tập thể cán bộ công nhân viên
của Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện và
động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.

Nha Trang, tháng 06, năm 2011
Sinh viên

Mai Thị Ly Na


GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Ở Việt Nam 5
1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10] 5
1.2.1. Đặc điểm hình thái 6
1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học 7
1.2.3. Đặc tính di truyền 8
1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens 9
1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens [14] 9
1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA 13
1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome) 13
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của 16S RNA 15
1.4. Phản ứng PCR [2], [9], [37], [38] 16
1.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR 17
1.4.2. Các điều kiện của phản ứng PCR 17
1.4.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR 21
1.4.4. Các hạn chế của phản ứng PCR 22
1.5. Điện di - Phát hiện sản phẩm PCR [2], [9] 25

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu 27
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27
2.3. Vật liệu nghiên cứu 27
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 27
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

ii

2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu 27
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 27
2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh
vật hóa học 28
2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens 29
2.4.4. Xác định đặc tính hình thái của C. perfringens 30
2.4.5. Phương pháp giữ giống vi khuẩn 31
2.4.6. Giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát
hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR 31
2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR
(Songer J.G. và cộng sự, 1999). 34
2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens 37
3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 38
3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 39
3.2.1. Hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn 39
3.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động của C. perfringens 40
3.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens 40

3.4. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát
hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR 45
3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được bằng kỹ thuật
Multiplex PCR 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 54

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C. perfringens Clostridium perfringens
E. coli Escherichia coli
S. agalactiae Streptococus agalactiae
Taq Thermus aquaticus
BHI Brain Heart Broth
SPS Agar Perfringens Selective Agar
TSC Agar Tryptose - Sulfit - Cycloserin Agar
PCR Polymerase Chain Reaction
dNTP Deoxynucleotide Triphosphate
TBE Tris Boric EDTA
DNA Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
M Marker - Thang chuẩn DNA
Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin
Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin

Ext Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin
Itx Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin
Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin
S Hệ số lắng (Svedberg)
Tm Nhiệt độ nóng chảy của một trình tự DNA
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 10
Bảng 1.2. Các type độc tố gây bệnh của C. perfringens 13
Bảng 1.3. Các loại enzyme polymerases cho phản ứng PCR 18
Bảng 2.1. Các thành phần của phản ứng PCR 33
Bảng 2.2. Nội dung các bước tiến hành chạy PCR 33
Bảng 2.3. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR 35
Bảng 2.4. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR 36
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân và mẫu
manh tràng của gà 37
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens.44
Bảng 3.3. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA 46
Bảng 3.4. Kết quả định type độc tố các chủng vi khuẩn C. perfringens 47

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn C. perfringens 4
Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta 6
Hình 1.3. Cấu trúc RNA ribosome 14
Hình 1.4. Cấu trúc bậc 2 của 16S RNA 15
Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR 21
Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32
Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng Multiplex PCR 35
Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens 39
Hình 3.2. Vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi 40
Hình 3.3. Vi khuẩn trên môi trường Fluid Thioglycolate 40
Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS agar 41
Hình 3.5. Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 41

Hình 3.6. Khuẩn lạc trên môi trường Egg yolk 42
Hình 3.7. Phản ứng CAMP test 42
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra lên men đường 43
Hình 3.9. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA 45
Hình 3.10. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringen 47
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


1

LỜI NÓI ĐẦU

Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) phân bố rộng rãi trong
thiên nhiên, thường thấy trong đất, nước và chất thải. Vi khuẩn cũng thường cư trú
tự nhiên trong đường tiêu hóa của các loài gia súc, gia cầm như dê cừu, trâu bò,
heo, gà Chúng là nguyên nhân gây nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, hoại thư
sinh hơi và gây ngộ độc thực phẩm cho người.
C. perfringens là nguyên nhân gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Đây là loại
bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra đột ngột với tỷ lệ chết rất cao. Theo Ilenia Drigo
(2008), nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủ yếu là do vi khuẩn C.
perfringens type A và type C. Trong đó, độc tố alpha đóng vai trò chủ đạo [18].
Tuy nhiên, McDougald (2003) thì lại cho rằng bệnh viêm ruột hoại tử thường kế
phát từ bệnh cầu trùng. Theo ông, khi thời tiết hoặc khẩu phần ăn thay đổi đột ngột
sẽ làm giảm sức đề kháng của con vật, tạo điều kiện cho cầu trùng gây bệnh. Đây là
thời điểm tốt nhất để C. perfringens sinh sôi nẩy nở và sản sinh độc tố gây bệnh.
Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ gia đình và các trang trại chăn nuôi có thể
lên đến 5 - 50 %.
Để xác định loài vi khuẩn C. perfringens trong các mẫu thực phẩm hay mẫu
bệnh phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp thường quy phân lập và giám

định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn (Quinn và cộng sự, 1994). Ưu điểm
của phương pháp này là tách được các chủng vi khuẩn thuần khiết nhưng lại tốn
nhiều thời gian và kết quả không thực sự chính xác do trong quá trình nuôi cấy một
số vi khuẩn có thể thay đổi đặc tính sinh hóa. Khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là sinh
học phân tử ngày càng phát triển, các phương pháp thử nhanh (PCR, ELISA…) ra
đời giúp rút ngắn thời gian phát hiện, định lượng và định danh vi sinh vật với độ
chuẩn xác cao. Hiện nay, sử dụng phương pháp PCR trong việc giám định vi khuẩn
C. perfringens bằng phát hiện gene 16S RNA ngày càng ứng dụng rộng rãi. Gene
16S RNA là RNA đơn vị nhỏ (small unit) của ribosome vi khuẩn. Ở vi khuẩn,
ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với hệ số lắng S lần lượt
là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn 50S chứa hai loại RNA là 23S rRNA và 5S rRNA,
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


2

tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ gồm một loại 16S rRNA. Gene 16S rRNA có một đặc điểm
rất đặc biệt, đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với
những vùng biến động nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài, có trình tự rất bảo thủ không
thay đổi qua thời đại và rất chuyên biệt cho mỗi loại vi khuẩn. Chính vì vậy, gene
này đã trở thành “một thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa
học trong việc định danh và phân loại các vi khuẩn [7, 9, 20].
Từ những thực tế trên đây, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y
miền Trung và Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại
học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Giám định loài và định type độc tố vi
khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử”.
Mục tiêu của đề tài :
Phát hiện nhanh vi khuẩn C. perfringens, từ đó đề xuất biện pháp phòng trị
bệnh có hiệu quả cho gà và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens

gây ra.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ gà theo phương pháp thường
quy.
2) Giám định loài vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập theo phương
pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR.
3) Định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập bằng kỹ
thuật Multiplex PCR.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn để
báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà
1.1.1. Trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về C.
perfringens gây bệnh cho người và các loại gia súc, gia cầm.
Theo Long J. R (1973), bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) do C.
perfringens gây ra ở gà được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961 trên gà trống non
6 - 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó bệnh xuất hiện ở Úc, Canada, Mỹ và Thụy Điển.
Bệnh thường xảy ra trên gà từ 2 - 4 tuần tuổi [23].
Hofshagen và cộng sự (1992), đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens
từ 192 mẫu phân của 99 con gà thịt và 93 con gà rừng. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân

lập vi khuẩn C. perfringens và khả năng sản sinh độc tố alpha ở gà thịt cao gấp 1,7
lần so với gà rừng [17].
Năm 2004, Hakan Kalender, Viện nghiên cứu và kiểm soát thú y, ElazÝÛ-
Thổ Nhĩ Kỳ, đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn C. perfringens từ manh tràng gà và
phát hiện gene mã hóa độc tố alpha do vi khuẩn này gây ra bằng phản ứng PCR.
Kết quả của nghiên cứu này là tác giả đã phân lập được vi khuẩn C. perfringens từ
8 mẫu manh tràng gà trong số 160 mẫu đem phân tích (5%). Và trong 8 mẫu phân
lập được, sau khi tiến hành phản ứng PCR, có 6 mẫu mang gene độc tố type A và 2
mẫu còn lại không thể định type [16].
Effat và cộng sự (2007) đã phân lập vi khuẩn C. perfringens từ các mẫu gà bị
bệnh tại các trang trại gà ở Cario - Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử. Ông đã định
type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu
mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với
độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại
này [15].
Cũng trong năm 2007, I. Svodosová và cộng sự, Đại học Brno - Cộng hòa Séc
đã phân lập 609 mẫu manh tràng của những con gà thịt từ 23 trang trại. Kết quả là
tác giả thu được 112 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens (chiếm 18,39%).
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


4

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR để định type độc tố của vi khuẩn, tác giả xác
định tất cả vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều thuộc type A. Trong đó có 4
chủng mang gene cpb2 mã hóa độc tố beta 2 [19].
Rocio Crespo và cộng sự (2007) đã tiến hành so sánh 31 mẫu gia cầm (gà, gà
tây, chim cút và vẹt) bị viêm ruột hoại tử từ năm 1997 và 2005 với 19 mẫu gia cầm
không có triệu chứng về bệnh này. Qua nghiên cứu cho thấy, tất cả các chủng C.

perfringens phân lập từ các gia cầm này đều thuộc type A. Tuy nhiên, trong số đó
chỉ có 54% sản sinh độc tố trong ống nghiệm khi phân tích bằng kỹ thuật Western
Blot. Và đáng ngạc nhiên là một lượng lớn các chủng vi khuẩn phân lập từ gia cầm
khỏe mạnh (90%) có khả năng sản sinh cpb2, trong khi đó hơn một nửa các chủng
vi khuẩn phân lập từ gia cầm bị bệnh lại không thể sản sinh loại độc tố này. Từ
những điều tra này, tác giả kết luận rằng không có mối liên hệ nào giữa độc tố β2 và
bệnh viêm ruột hoại tử ở gia cầm [27].
Theo Ilenia Drigo và cộng sự (2008), với nghiên cứu về các gene độc tố của
các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ những con gà khỏe mạnh và gà bị
bệnh. Tác giả cho rằng: Type A và type C là hai type độc tố gây bệnh viêm ruột
hoại tử ở gà [18].
Năm 2008, TS. Anthony Keyburn, Nghiên cứu sinh của Đại học Monash và
cộng sự đã có phát hiện đột phá rằng độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây
bệnh viêm ruột hoại tử trên gà, ông phát hiện ra một loại độc tố mới NetB mới là
yếu tố độc lực chính. Đến nay, ông và nhóm cộng sự đang tiếp tục nghiên cứu để
tìm ra một loại vắc-xin thực sự có hiệu quả để chống lại căn bệnh này [12].
Năm 2009, Leen Timbermont và cộng sự đã phân lập được 26 chủng C.
perfringens từ gà khỏe mạnh và 24 chủng C. perfringens từ gà nghi bệnh viêm ruột
hoại tử. Tiến hành đem nuôi trong ống nghiệm và nhận thấy rằng một tỷ lệ lớn (55 -
67%) chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà nghi bệnh có khả năng ức chế sự
phát triển của các chủng C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh. Vì vậy, tác giả đã
đưa ra kết luận: vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà bệnh có khả năng sản sinh
độc tố có hoạt lực mạnh hơn vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh [22].
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


5

Saad Gharaibeh và cộng sự (2010) đã phân lập được 67 chủng vi khuẩn C.

perfringens từ 155 mẫu phân gà thịt nuôi tại Jordan (chiếm 43,2%). Thực hiện phản
ứng Multiplex PCR thì nhận thấy 100% các chủng vi khuẩn C. perfringens đều
thuộc type A. Tác giả cũng tiến hành kiểm tra sự mẫn cảm của 67 chủng vi khuẩn
C. perfringens với kháng sinh và kết quả cho thấy C. perfringens mẫn cảm mạnh
với Penicillin, với Oxytetracycline chiếm 82,3% và với Amoxicillin là 67,4% [28].
1.1.2. Ở Việt Nam
Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do vi khuẩn C. perfringens gây ra vẫn chưa được
nghiên cứu nhiều ở nước ta, các nghiên cứu chủ yếu về vi khuẩn C. perfringens gây
bệnh trên bò, dê, cừu, lợn.
Theo Giáo sư Đào Trọng Đạt và các tác giả như Trần Thị Hạnh, Đặng Phương
Kiệt (1998), C. perfringens type C có thể phân lập được trong chất chứa đường ruột
của động vật khỏe. Kết quả kiểm tra vi khuẩn học các mẫu phân lấy từ các động vật
trâu bò, cừu, lợn và gia cầm có thể phát hiện được C. perfringens. Nhóm tác giả cũng
nhận thấy vi khuẩn này có thể dễ dàng tìm thấy trong thức ăn, dụng cụ chăn nuôi,
môi trường xung quanh chuồng trại gia súc, trong đất và nguồn nước [2].
Theo TS. Lê Lập và cộng sự (2007), khi phân lập và xác định type độc tố của
vi khuẩn C. perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Tác giả
cho biết, những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A, mang gene cpa
mã hóa sản sinh độc tố alpha; những chủng phân lập từ phủ tạng của dê, cừu bị
bệnh viêm ruột hoại tử lại thuộc type D, mang gene cpa và etx [6].
Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009), các chủng vi khuẩn
C. perfringens mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, sản sinh độc tố gây chết
chuột. Kết quả của việc định type bằng Multiplex PCR cho thấy các chủng C.
perfringens phân lập từ bò thuộc type A (48,1%) và type D (51,9%); các chủng phân
lập từ lợn thuộc type A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta 2 (18,9%) [5].
1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10]
C. perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và
thường được tìm thấy trong ruột động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

6

này phát triển và sinh bệnh lý trong cơ thể vật chủ. C. perfringens đã được phân lập
bởi Welch và Nuttall (năm 1892) từ vết thương bị hoại tử và được đặt tên là
Baccillus aerogenes capsulatus. Sau đó đổi thành Bacillus perfringens, tiếp theo là
Clostridium welchii. Và hiện nay là Clostridium perfringens.
Hệ thống phân loại khoa học của C. perfringens:
Giới (regnum) : Bacteria
Ngành (phylum) : Firmicutes
Lớp (class) : Clostridia
Bộ (ordor) : Clostridiales
Họ (familia) : Clostridiaceae
Chi (genus) : Clostridium
Loài (species) : C. perfringens
1.2.1. Đặc điểm hình thái
C. perfringens là trực khuẩn Gram dương, hình que, yếm khí và có khả năng
tạo bào tử. C. perfringens có đặc tính giúp dễ phân biệt với các loài khác thuộc chi
Clostridium là hình que lớn (0,6 - 2,4 × 1,3 - 19 µm), có vỏ kết nang và không di
động. Khuẩn lạc của C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng bên
trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài không dung
huyết hoàn toàn (do độc tố alpha). Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung
huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật.

Hình 1.1. Vi khuẩn C. perfringens Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


7

Vi khuẩn C. perfringens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50
o
C,
phát triển chậm ở 20
o
C. Và ở 43 - 47
o
C vi khuẩn phát triển nhanh cực độ, có thể tạo
ra một thế hệ trong 8 - 10 phút và sản sinh khí. Vi khuẩn phát triển trong khoảng
pH 5 - 8 và hoạt tính nền của nước là 0,93 - 0,97.
C. perfringens có thể sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ sự biến
đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và sản
sinh nội bào tử. Nội bào tử có thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như
nóng, khô, acid, chất tẩy rửa.
1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học
C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí không đòi
hỏi khắt khe như các vi khuẩn khác:
- Điều kiện nuôi cấy: C. perfringens phát triển tốt ở môi trường yếm khí, thông
thường từ 2 - 10% CO
2
.

- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp là 37 - 42
o
C.
- Vi khuẩn này có thể phát triển trên các môi trường:
 Trên môi trường Fluid Thioglycolate: Sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi
khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường.
 Trên môi trường SPS agar hoặc TSC agar: Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc
tròn, màu đen do vi khuẩn sinh H
2
S kết hợp với Fe (Fe có sẵn trong môi trường)
tạo thành FeS có màu đen.
 Trên môi trường thạch máu: Sau 24 - 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của
C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng dung huyết kép (vòng
bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết
không hoàn toàn (do độc tố alpha)). Hiện tượng này là dung huyết beta trên môi
trường nuôi cấy thạch máu.
 Trên môi trường Litmus milk: Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây
điển hình do đường lactose trong môi trường bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón
casein và làm chuyển màu môi trường, từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH
Litmus. Sau đó, các đám vẩn acid bị vỡ, nứt ra do sự hình thành hơi.
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


8

 Trên môi trường lòng đỏ trứng (Egg yolk): Vi khuẩn C. perfringens phát
triển sản sinh men lecithinase phân giải lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung
quanh khuẩn lạc.
 Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và S. agalactiae

trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc của S.
agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung
huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C. perfringens.
 Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm
đục môi trường.
 Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, maltose,
sucrose. Không lên men mannitol, không sinh indol.
1.2.3. Đặc tính di truyền
Trong các loài có khả năng gây độc của chi Clostridium, C. perfringens là loài
điển hình cho các nghiên cứu di truyền vì tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng
thao tác di truyền dễ dàng. Năm 2002, cấu trúc genome hoàn chỉnh của chủng C.
perfringens đã được công bố bởi Shimizu và cộng sự. Bộ nhiễm sắc thể của chủng
này gồm 3.031.430 bp, 2660 vùng mã hóa cho các protein và 10 loại rRNA; tổng
hàm lượng G + C là 28,6%.
Khi cấu trúc genome của C. perfringens được so sánh với genome của những
vi khuẩn không gây bệnh như C. acetabutylicum, sự khác biệt rõ ràng nhất có liên
quan đến các gene sinh độc tố của C. perfringens. Ngoài các gene độc tố đã biết,
Shimizu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác, kết hợp trong hệ gene của C.
perfringens. Năm gene dung huyết đã được xác định dựa trên sự tương đồng về khả
năng dung huyết đã được mô tả trong các loài vi khuẩn đã phân loại trước đây. Hai
type có gene quy định protein liên kết với fibronectin là tương đồng với gene của vi
khuẩn Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis đã cho thấy có sự liên quan đến
các yếu tố gây độc.
Trình tự genome của C. perfringens cho thấy các gene độc lực không có tác
động cộng gộp với nhau. Chỉ có một vài yếu tố di truyền di động có thể được phát
hiện và những dấu hiệu của gene theo chiều ngang là khó phát hiện trong genome
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

9

của C. perfringens. Do đó, có thể thấy rằng các type độc tố khác nhau của C.
perfringens được tiến hóa từ type A bằng cách nhiễm vào các yếu tố ngoài nhiễm
sắc thể như plasmid và gene nhảy.
Gene mã hóa độc tố alpha và theta nằm trên nhiễm sắc thể, nhiều gene mã hóa
các loại độc tố khác cũng nằm trên plasmid. Gene mã hóa độc tố enterotoxin có thể
nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid.
Biểu hiện của alpha toxin và theta toxin được quy định bởi một hệ thống dẫn
truyền tín hiệu hai thành phần (VirR/VirS), một bộ cảm biến histidine kinase, VirS,
và các yếu tố cần cho một phản ứng, VirR. Cơ chế điều hòa xảy ra ở cấp độ phiên
mã và các đột biến có thể thay đổi việc sản sinh cả độc tố alpha và theta.
1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens
Vi khuẩn C. perfringens có khắp nơi trong thiên nhiên và là một phần của hệ
vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật. Thường có hai dạng cơ
bản hình thành nên bệnh là vi khuẩn có sẵn trong ruột hoặc thức ăn bị nhiễm vi
khuẩn này. Ngoài ra, những thay đổi về môi trường, khẩu phần thức ăn thay đổi đột
ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein và năng lượng cũng là
những nguyên nhân gây bệnh. Hoặc do vận động quá mức đã làm chậm nhu động
ruột, giữ lại lâu các vi khuẩn trong ruột làm tăng sự hấp thụ của độc tố.
Carbonhydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho C. perfringens phát
triển nhanh chóng.
Một số tác giả khác lại cho rằng C. perfringens thừờng xuyên sống cộng sinh
ở dạ dày. Bình thường các vi khuẩn này cũng có nhiều ở ruột già, nhưng trong
những điều kiện thuận lợi thì nó phát triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non
và sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân
chính gây bệnh.
1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens [14]
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc
tố khác nhau như: độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε), iota (i), beta 2, enterotoxin,

theta, vv…. Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon,
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


10

iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype)
khác nhau (A, B, C, D, E). Trong đó, type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh
độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc
tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha và iota.
Bảng 1.1. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens
C. perfringens

Độc tố chủ yếu
Type Alpha Beta Epsilon Iota
A
+ - - -
B
+ + + -
C
+ + - -
D
+ - + -
E
+ - - +

 Alpha toxin (Gene mã hóa là cpa - Gene này nằm trên nhiễm sắc thể của vi
khuẩn): Đây là loại độc tố gây chết chính, có hoạt tính enzyme phospholipase C. Nó
có khả năng thủy phân màng phospholipid của các loại tế bào khác nhau, làm tan

màng hoặc tạo ra dạng cytotoxicity. Vai trò của độc tố là gây xuất huyết, hoại tử với
hoạt tính kết dính tiểu cầu và ảnh hưởng đến tính thấm của mao mạch.
Alpha toxin tinh chế có khối lượng phân tử là 43 kDa và pH ở điểm đẳng điện
là 5,4. Năm 1989, ba phòng thí nghiệm ở Anh, Hoa Kỳ và Nhật Bản đã đồng thời có
báo cáo về việc nhân dòng gene alpha toxin từ C. perfringens. Titball và cộng sự ở
Anh đã chèn đoạn gene mã hóa độc tố alpha của vi khuẩn này vào plasmid của E.
coli và phát hiện vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp có phản ứng phân giải
lecithinase trên môi trường Egg yolk. Các gene mã hóa cho một loại protein có khối
lượng 44,5 kDa và dường như giống với alpha toxin cũng được mô tả. TSO và
Seibel tại Hoa Kỳ cũng với phương pháp tương tự đã phát hiện độc tố alpha được
sản xuất từ plasmid của các sinh vật có phản ứng dung huyết trên môi trường thạch
máu. Họ đã tìm thấy một đoạn gene dài 2 kb chèn vào plasmid của C. perfringens
có chứa một chuỗi dài 1197 nucleotide mã hóa cho 399 amino acid với khối lượng
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


11

phân tử là 43 kDa. Okabe và cộng sự ở Nhật Bản cũng đã thành công trong việc
nhân dòng gene vô tính alpha toxin của C. perfringens và cũng cho biết chiều dài
của gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai nghiên cứu nói trên.
 Beta toxin (Gene mã hóa là Cpb - nằm trên plasmid của vi khuẩn): Đây là
loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type B và C. Beta toxin là một
protein mẫn cảm cao với trypsin, gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào màng
trong ruột. Ngoài ra, độc tố beta còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến
trao đổi Ca
2+
của màng gây ra rối loạn chức năng thần kinh bình thường. Loại độc
tố này có thể được thu hồi từ môi trường lỏng và tinh chế bằng phương pháp sắc ký

ái lực, sử dụng một cột có chứa kẽm nhiệt phân, cột thứ hai bằng nhựa vinyl ưa
nước. Độc tố beta tinh chế có trọng lượng phân tử 40 kDa và pH đẳng điện là 5,6.
Gene mã hóa cpb gồm 1113 nucleotid mã hóa cho 371 amino acid. Nó có tính chất
tương tự alpha toxin, do đó rất khó để tách riêng hai loại độc tố này. Beta toxin có
độc tính rất mạnh: Khi tiêm vào chuột gây tăng huyết áp và nhịp tim, liều gây chết
LD50 cho chuột trưởng thành là 310 và 4500 ng/kg; và chỉ cần 2 ng độc tố này có
thể gây bệnh trên lợn con.
 Epsilon toxin (Etx - nằm trên plasmid): Epsilon toxin được sản sinh ra dưới
dạng 1 tiền độc tố và được hoạt hóa bằng men proteolytic ở lượng thấp. Đích của
độc tố này là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của
động vật Eukaryote, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố gây hoại tử
và gây chết.
Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D. Nó là
một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa. Loại độc tố
này chủ yếu ảnh hưởng đến ruột bằng việc tăng tính thấm của thành mạch. Do đó,
tăng cường sự hấp thu độc tố và đóng vai trò như là một chất độc gây chết người.
Sau khi lưu thông vào các cơ quan bên trong cơ thể, nó gây sưng thận, phù nề ở
phổi, màng ngoài tím và làm cho lượng chất lỏng dư thừa.
Ảnh hưởng của việc tăng tính thấm thành mạch có thể được chứng minh bằng
cách tiêm loại độc tố này vào một vị trí sau đó nó sẽ đi vào hệ tuần hoàn. Buxton đã
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


12

đề xuất một cơ chế hoạt động của độc tố epsilon trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan
đến hệ thống adenylcyclase (hệ thống xúc tác tổng hợp AMP mạch vòng từ ATP)
trong các tế bào bị ảnh hưởng. Kĩ thuật ELISA đã phát hiện được độc tố epsilon và
được đề xuất để thay thế việc gây chết chuột và thử nghiệm cho việc sản xuất một

loại kháng thể đặc hiệu.
 Iota toxin (Itx - nằm trên plasmid) có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào
biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia). Sau khi độc tố được gắn vào thụ
thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. Độc
tố làm tăng tính thấm của mao mạch và tác động lên màng tế bào.
Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type E. Ia và Ib được phân
cách bởi điểm đẳng điện. Ia có pH đẳng điện là 5,2; khối lượng phân tử 47,5 kDa.
Và Ib có pH đẳng điện là 4,2; khối lượng phân tử là 71,5 kDa. Một hỗn hợp gồm cả
hai thành phần Ia và Ib cần thiết cho hoạt động sinh học quan trọng được đo bằng
việc gây chết. Chuỗi nhẹ Ia là một enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ADP, cơ vân, và
protein actin không co rút.
Ngoài 4 độc tố chính trên, có 2 độc tố cũng đóng vai trò quan trọng trong việc
gây bệnh là độc tố beta 2 và enterotoxin:
Beta 2 là độc tố được mô tả nhiều nhất trong thời gian gần đây, gây bệnh về
ruột cho động vật nuôi, đặc biệt là heo con và ngựa. Độc tố thường gây triệu chứng
tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên.
Enterotoxin là độc tố được mô tả nhiều nhất khi nói đến C. perfringens, có tác
động đến tế bào biểu mô và gây bệnh về đường ruột. Độc tố gây tiêu chảy làm mất
nước và chất điện giải trong cơ thể. Enterotoxin được sản sinh trong quá trình hình
thành bào tử của vi khuẩn và độc tố sẽ tăng khi tế bào sinh dưỡng bị phá hủy.




GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


13

 Mỗi type độc tố khác nhau gây ra các loại bệnh khác nhau trên các đối tượng
khác nhau. Các type độc tố gây bệnh được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các type độc tố gây bệnh của C. perfringens
Type Bệnh Đối tượng gây bệnh
A
- Hoại thư sinh hơi
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Ngộ độc thực phẩm
- Viêm ruột kết
- Viêm dạ dày xuất huyết
- Người, động vật, gà
- Heo, gà.
- Bò và cừu non
- Người
- Ngựa
- Chó
B
- Bệnh lỵ
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Cừu con
- Ngựa con, cừu và dê
C
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Người
- Cừu, bê con, cừu con, heo
con
D
- Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu con, cừu (mềm thận),

dê và trâu bò
E
- Viêm ruột
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Thỏ
- Bê con và cừu con

1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA
1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome)
rRNA kết hợp với protein chuyên biệt cấu tạo nên ribosome, một thành phần
của bộ máy dịch mã của tế bào. rRNA chiếm đến 80% tổng số RNA của tế bào. Ở
các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hệ số
lắng S. Tùy theo hệ số lắng S, rRNA được chia thành nhiều loại. Ribosome của mọi
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


14

tế bào đều gồm một tiểu đơn vị nhỏ và một tiểu đơn vị lớn. Mỗi tiểu đơn vị có mang
nhiều protein và rRNA có kích thước khác nhau.
- Ở eukaryote: Ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai tiểu đơn vị:
+ Tiểu đơn vị lớn (60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S.
+ Tiểu đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S.
- Ở prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 tiểu
đơn vị
+ Tiểu đơn vị lớn (50S) có rRNA 23S; 5S.
+ Tiểu đơn vị nhỏ (30S) chỉ có rRNA 16S.
RNA ribosom có cấu trúc bậc 1 (mạch thẳng) và cấu trúc bậc 2. Trong
ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc 2. RNA ribosom có cấu tạo là một

sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung: A liên kết với U, G
liên kết với C và có khi G liên kết với U. Các RNA ribosome là sự kết hợp của
rRNA, các enzyme và protein cấu trúc.










Hình 1.3. Cấu trúc RNA ribosome



GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


15

1.3.2. Cấu trúc và chức năng của 16S RNA
16S ribosome RNA (16S rRNA) là một thành phần của tiểu đơn vị 30S của
ribosome vi khuẩn. Nó có chiều dài khoảng 1542 nucleotide.
Nhiều trình tự 16S rRNA có thể tồn tại trong một loại vi khuẩn duy nhất.
 Một số chức năng của 16S RNA:
Giống như tiểu đơn vị lớn 23S rRNA, 16S RNA đóng một vai trò cấu trúc,
hoạt động như một khung đỡ để xác định vị trí của protein ribosome.

Đầu tận cùng 3’ chứa trình tự Shine - Dalgarno (RBS: Ribosome Binding
Site) liên kết ngược hướng với thượng nguồn codon AUG khởi đầu.
16S RNA kết hợp với 23S hình thành nên hai tiểu đơn vị (50S + 30S).
Ngoài ra, 16S RNA còn có chức năng ổn định chính xác sự bắt cặp của codon
- anticodon tại vị trí A (tiểu đơn vị lớn của ribosome có 3 vị trí gắn cho phân tử
tRNA là vị trí P (Peptidyl - tRNA bingding site), vị trí E (Exit site), và vị trí A
(Aminoacyl - tRNA bingding site)) thông qua việc hình thành liên kết hydro giữa
nguyên tử N1 của gốc Adenine ở vị trí 1492 và 1493 trên chiều dài của 16S rRNA
và nhóm 2’OH trên phân tử mRNA.











Hình 1.4. Cấu trúc bậc 2 của 16S RNA

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


16

 Sử dụng 16S RNA để xác định loài vi khuẩn [7], [20]
Hiện nay, phương pháp truyền thống trong việc nhận dạng loài vi khuẩn đã

dần dần được thay bằng những phương pháp hiện đại hơn: PCR hay ELISA…Sử
dụng PCR trong việc xác định vi khuẩn bằng gene 16S RNA được các nhà khoa
học ngày càng quan tâm.
Tiểu đơn vị lớn 50S của vi khuẩn chứa hai loại RNA là 23S rRNA và 5S
rRNA, tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ gồm một loại 16S rRNA. Gene 5S rRNA có kích
thước khoảng 120 nucleotide. Do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít, vì
vậy khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của
vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. 23S rRNA có kích thước khoảng
2900 nucleotide, quá lớn nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và
phân loại vi khuẩn. Gene 16S rRNA có kích thước khoảng 1542 nucleotide vừa đủ
để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật, không gây khó khăn trong các bước
xác định trình tự gene và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc
của gene 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất
nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc
hiệu riêng cho các chi và loài. 16S rRNA có một đặc điểm rất đặc biệt đó là chúng
mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với những vùng biến động
nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài, có trình tự rất bảo thủ không thay đổi qua thời đại
và rất chuyên biệt cho mỗi loại vi khuẩn. Chính vì vậy, gene này đã trở thành “một
thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa học trong việc định
danh và phân loại các vi khuẩn.
1.4. Phản ứng PCR [2], [9], [37], [38]
PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng rộng rãi
nhất. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện
của tế bào. PCR có thể khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà
không qua tạo dòng. Phương pháp này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách
mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền.
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội

17

1.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá
trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA polymerase chịu
nhiệt. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được
hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp
hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ
tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình
tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ
sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược
(antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với
chiều phiên mã của gene.
1.4.2. Các điều kiện của phản ứng PCR
 DNA mẫu
DNA mẫu là DNA có chứa đoạn gene cần nhân lên. Phản ứng khuếch đại đạt
tối ưu nếu DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt
kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử
dụng theo lý thuyết một bản copy DNA đủ cho phản ứng PCR , tuy nhiên để phản
ứng đạt hiệu quả thì lượng mẫu có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với
việc sử dụng các polymerase. Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế
được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Một ưu
điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA
không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu
ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết,…
 Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì
đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


18

enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy,
nhiệt độ lại thấp khiến sự khuếch đại kí sinh rất cao,…). Phương pháp PCR chuyển
sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt
được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus (Taq). Enzyme
Taq polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính DNA và xúc tác sự tổng hợp
DNA từ đầu đến cuối quá trình phản ứng (không bị phá hủy vĩnh viễn ở 94
o
C và
nhiệt độ hoạt động tối ưu là 72
o
C).
Bảng 1.3. Các loại enzyme polymerases cho phản ứng PCR
Enzyme Sinh Vật Độ chính xác Hiệu suất Độ ổn định
Taq T. aquaticus Thấp Cao Thấp
Tbr T. brokianus Thấp Thấp Cao
Tli T. litoralis Cao Thấp Rất cao
Deep Vent P GB - D Cao Thấp Rất cao

 Taq polymerase hiệu quả cao và thường được sử dụng.
 Nếu nhiệt độ cao quan trọng (tỉ lệ GC cao) thì Tbr, Tli, Deep Vent enzyme
thường được sử dụng.
 Nếu cần độ chính xác cao thì enzyme với chức năng đọc chính xác thường

được sử dụng (Deep Vent).
 Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với
nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một
enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn
++
, nhưng với sự
hiện diện của DNA khuôn và ion Mn
++
, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch
đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.




GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội


19

 Mồi - primer
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khếch đại đặc trưng và có
hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải
tuân thủ một số nguyên tắc sau:
 Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa
mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do
sự bắp cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần
nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.

 Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch tán, không trùng
với các trình tự lặp lại trên gene.
 Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng PCR
sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 3 kb (sản phẩm PCR).
 Nồng độ mồi trong một phản ứng PCR thường từ 0,1 - 0,5 mM hoặc 6 x 10
12

phân tử hoặc hơn, nồng độ này đủ cho ít nhất 30 chu kỳ.
 Kích thước mồi khoảng 20 bp và chứa đủ 4 base bằng nhau (17 - 30 bp hoặc
hơn).
 Deoxynucleotide triphotphate
Bốn loại deoxynucleotide triphotphate (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) thường
được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 µM/mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn
đến sự khuếch đại “kí sinh”, vì vậy sẽ ức chế phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong
thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Bốn loại dNTP này thường được trộn lẫn với nhau và giữ ở dạng chất lỏng ở - 20
o
C.
Nồng độ các cation hóa trị 2 cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình
PCR. Tất cả enzyme polymerase đều yêu cầu cation hóa trị 2 để hoạt động. Thường
là Mg
++
, Mg
++
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt thường dùng. Nếu nồng độ Mg
++
quá thấp (< 0,5 mM) làm
giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế.
Nếu nồng độ Mg

++
quá cao sẽ làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn